Summary
Kollagen er en kjernekomponent i ECM, og gir viktige signaler for flere cellulære prosesser som spenner fra migrasjon til differensiering og spredning. Forutsatt her er en protokoll for å bygge celler i 3D kollagen hydrogeler, og en mer avansert teknikk for generering av randomiserte eller justert kollagen matriser ved hjelp av PDMS microchannels.
Protocol
1. Nøytralisering, fortynning og polymerisering av kollagen Løsninger for 3D etterforskning og Cellular Sammentrekning Analyser
- På is i sterilt vevskultur hette, nøytralisere kollagen (1: 1) med steril, is-kald 100 mM HEPES i 2 x PBS, pH 7,4, i et 15 ml konisk rør. Bland godt med plast pipette inntil løsningen er homogen og miksing swirls ikke lenger er synlige. Vær forsiktig med å innføre luftbobler under blandeprosessen. Oppbevar kort på is.
- Fortynn nøytralisert kollagen til den passende konsentrasjon med cellemedium (så som RPMI, DMEM, etc.).
- For å beregne mengden av nøytralisert kollagen som kreves for å gjøre opp ønsket collagen-konsentrasjon ved å bruke ligningen N = (D * V) / (S / 2), hvor N er mengden nøytralisert kollagen som kreves, er D den ønskede kollagen konsentrasjon, er V det endelige volum av den ønskede konsentrasjon kollagen, og S er tHan starter lager kollagen konsentrasjon.
- Ta opp mengden av kollagen nøytralisert til volum ved tilsetning av en celle og celle media løsning. Bland godt og oppbevar på is inntil den er klar til å kaste.
- Eksempel: For en 2 mg / ml gel i en 1 ml gel volum (typisk volum for en gel støpt i 6 brønners plate eller 50 mm glassbunn rett), først multiplisere den ønskede konsentrasjon (2 mg / ml) av det ønskede sluttvolum (1 ml). Ta dette tallet (2 mg) og dele det med halvparten av bestanden konsentrasjon oppført på flaske (9,49 mg / ml). I dette tilfellet, blir 0,42 ml av den nøytraliserte kollagen fortynnet med 0,58 ml av media / celle-blandingen.
- Pipet det iskalde kollagen / celle / media blandingen i enten en ikke-vev kultur behandlet seks-brønns plate eller en 50 mm glassbunn fatet. Bruk pipette tips til jevnt spredt ut løsningen.
MERK: Det er viktig å bruke en ikke-vev kultur behandlet plate å minimere vedlegg eller vekst av cellene utenfor collagen gel. - Tillat å polymerisere ved romtemperatur i ca. 10 - 15 min. De gels bør slå ugjennomsiktig ved polymerisasjon.
- Etter at den har slått ugjennomsiktig, flytte plate eller tallerken til 37 ˚C for ytterligere 45 - 60 minutter å fullføre polymerisasjon.
- Etter 45 - 60 minutter, tilsett 2 - 3 ml media og slipp gels fra sidene av brønnen ved å kjøre en P200 pipette tips rundt omkretsen av godt eller parabol. Swirl fatet forsiktig å frigjøre gelen. Kollagen gel bør være flytende i media.
2. Western Blotting, Cell morphogenesis og Gel Gontractility analyse
- For å vurdere protein nivåer, morfologi eller cellular kontraktilitet i forhold til ECM stivhet, begynner ved å helle kollagen gels, ifølge 01.01 til 01.06, sådd med celler for en 7-10 dagers analysen. Bestem hver cellelinje seeding rente empirisk avhengig av vekst og sammenflytning. For en 10 dagers analyse, kan seeding tetthet i området fra 20.000 - 100.000 celler / gel.
- Å målecelle kontraktilitet, måle gelen diameter ved hjelp av en linjal eller et kamera hver 24 timer, eller ved passende tidsintervall.
Merk: I tillegg kan tilsvarende bilder innsamlet fra et mikroskop bli kontrollert for morfologiske egenskaper karakteristisk for cellelinjen podet i gelen, slik som acini-lignende strukturer, epiteliale tubuli, cellulære fremspring, og lameliapodia. - For å vurdere proteinnivåer, lysere gelene i RIPA-buffer og fremgangsmåte for Western blot-analyse av proteiner av interesse som er beskrevet i Wozniak et al. 17 og Gallagher et al., 18.
- VIKTIG: I sammenligninger av kontraktilitet mellom cellelinjer, normal kontraktilitet til total DNA, som kan være hentet fra gels som skissert av Lui, et al 19, eller til en uforanderlig, housekeeping protein (histoner, GAPDH, etc.) av Western. blot-analyse, som beskrevet i Wozniak et al. 17 og Gallagher et al. 18. Hvis telle celler i gel ved hjelp av en hemocytometer, sørg for å normalisere celle nummer til total gel område som oppdragsgiver gel vil konsentrere celler.
- Fôr gels hver 3 - 4 dager ved å fjerne 1 ml media og erstatte den med 1 ml frisk medier. Sørg for å mate gels etter at målingen er tatt som tilførsel av frisk media / serum vil føre til en topp i kontraktilitet.
3. generasjon av PDMS mikro for Kollagen Fiber Alignment
Merk: For å generere justert kollagen matriser, en form for PDMS microchannels (Figur 2A) krever en SU-8 silisium mester gjøres via soft-litografi 15.
- For å gjøre PDMS kanaler, bland PDMS grundig i en engangs kopp med fag- pinne. For en 6 tommers silikon Hoved, bland 20 g av elastomer base med 2 g av herdemiddel.
- De-gass PDMS blandingen ved å plassere engangsbeholder i et vakuumkammer under et vakuumtrykk på550 mm Hg. De-gass til 1 - 1,5 time.
- Mens de-gassing de PDMS, forberede silikon master for å helle. Forbered ved å plassere en ren transparent film på en kokeplate etterfulgt av silikon mester. Sørg for at microchannel mold vender opp.
MERK: Under PDMS støping og herding, vil silikon herre bli klemt mellom to ark med transparenter. - Etter 1 til 1,5 time, fjerne de-gasset PDMS fra vakuumkammeret, og sakte hell over silikon mester.
VIKTIG: Unngå luftbobler. Fortsett å helle i sentrum av master, og lar tyngdekraften til å spre det jevnt.
MERK: PDMS fallet trenger ikke å strekke seg hele veien til kanten av skipsføreren. - Etter PDMS har blitt strømmet på master, legg på et transparent film på toppen av silikon master og PDMS. Nøye, rull andre åpenhet ark ned på toppen av PDMS / silikon mester for å unngå luftbobler. Ikke stress. PDMS skal nå jevnt fordelt over mester.
- Stikk forsiktig en gummiplate på toppen av åpenhet, etterfulgt av en 1/8 "akryl ark.
- Legg tre 10 lb vekter på toppen av akryl ark. I første omgang vil vektene "flyte". Tillate dem å bosette og stabilisere seg før du fortsetter videre.
- Sett kokeplate temperaturen til 70 C og kur PDMS for 4 timer. Avkjøl i minimum 1 time før urovekkende.
- skrelle nøye toppen transparent film fra leiv og fjerne kanalene med en tang.
- Oppbevares i støvfritt rett til det skal brukes.
4. prepping PDMS microchannels for bruk
- Plasser kanaler opp ned på nytt, rent transparentfilm. Rengjør alle porter (figur 2b) ved hjelp av sirkelbevegelser med en skarp tang. Fjern eventuelle fragmenter av PDMS.
- Rene kanaler ved hjelp av et stykke av pakketape som en tack klut. Påfør tape til overflaten av benk (klebrig side opp), og deretter sette kanal on toppen. Trykk ned på kanaler med runde enden av tang for å sikre god kontakt. Ta ut og gjenta på begge sider til synlig rusk blir fjernet.
- Overføring renset, preparert PDMS-kanaler inn i et 50 ml konisk med 70% EtOH. Vortex ved maksimal hastighet i 30 sek. Kast EtOH og erstatte med frisk 70% EtOH. Oppbevares i 70% EtOH til den er klar til bruk.
- I vev kultur hette og bruk av aseptiske teknikker, overføre PDMS kanaler til et rent og sterilt dekke glass eller glassbunn retter. Sett kanalen side opp og UV godbit inntil EtOH har fordampet.
- Når det er tørt, snu PDMS så kanalene vender ned mot dekkglass. Trykk på PDMS kanal ned på glasset for å gjøre en god forsegling. Legg en lapp av sterile PDMS å dekke / lukke sentrum port (port B, figur 2b). La det helt tørre før du fortsetter.
- Pre-belegge innsiden av kanalen med 10 ug / ml kollagen i sterilt vann. Å belegge, legg en 100 mL dråpe på toppen av en flael, og trekke gjennom med vakuum. Etter 1 time ved 37 ° C, overføringskanaler som er fylt med kollagenbeleggoppløsning til et kjøleskap. Chill for ca 15-30 min.
- Fjern kollagen belegg løsning med vifte eller pipette, og begynne kollagen forberedelse.
5. Kollagen Forberedelser for bruk i mikro
- På is, nøytraliserer kollagen (1: 1) med is-kald 100 mM HEPES i 2 x PBS, pH 7,4. Bland grundig til homogen (For flere detaljer, se punkt 1.1).
- Spe nøytralisert kollagen til de riktige konsentrasjoner med celle media (For flere detaljer, se avsnitt 1.2). Inkuber i 15 minutter på is.
- På samme tid, chill montert kanaler på is.
MERK: Målet er å ha alle komponentene for kanalen prosessen ved 4 C eller lavere. Kollagen kjernedannelsestemperaturen og tid er viktige parametre til polymerisasjonsprosessen, og kan være utgangspunkt for videre optimalisering, om nødvendig. - CounT-celler med et hemacytometer og resuspender i riktig seeding tetthet på dette tidspunktet. For enkel beregning, resuspender til 1 - 3 millioner celler / ml. (For mer informasjon, se også avsnitt 2.1).
- Når cellene har blitt talt opp og 15 minutter har gått, går du videre til kollagen helle.
6. helle Justert og tilfeldig kollagen mikro
- Før tegning kollagen gjennom kanaler, justere og sette vakuum trykk med en innebygd vakuumregulator. Vakuumtrykk gir kraften til å bevege og styre hastigheten av kollagen strømnings, som bestemmer graden av innretting.
- For tilfeldige eller unaligned matriser, bruk en bred kanal (3 mm bred x 200 mikrometer høye) med en vakuumtrykk på 10 mm Hg eller mindre.
- For justert matriser, bruker smal kanal (1mm x 200 mikrometer høye) med et vakuum trykk på 60 mm Hg eller høyere.
- Fjern montert kanal fra is og legg på ren, renset overflaten av laminær strømning hood.
- Arbeid raskt og laste 120 - 150 mL av nøytralisert kollagen inn port A (figur 2b).
- Tegn kollagen gjennom kanalen ved å plassere en 25 ml pipette festet til vakuumledningen over port c (figur 2b). Tegn kollagen gjennom i en enkelt, enhetlig bevegelse. VIKTIG: For tilfeldige eller unaligned matriser, tegne kollagen sakte over kanalen (ca. 0,5 til 1 mm per sekund), og stopper når den når slutten. For justert matriser, trekke collagen over raskere, men ta vare for å unngå luftbobler.
- fjerne overflødig kollagen forsiktig fra havneområde med P200 pipetman eller aspirator.
- Plasser sterile PDMS flekker over begge portene A og C. Alle porter skal nå være dekket.
- Etter 2 - 3 minutter, fjern midt PDMS patch (port B) og tilsett 2 - 3 mL av celler (5 - 10 000 celler) inn til sentrum port. Tillat å delvis polymerisering (slå ugjennomsiktig) ved romtemperatur i ytterligere 10 - 15 min.
- etter 10- 15 min, overføring til 37 ˚C for ytterligere 15 - 30 minutter å fullføre polymerisasjon. Fjern PDMS deksler og legge til medier i fullstendig dekke kanalen og kultur celler som trengs. Celler kan bli lei av å fjerne en ml av gamle medier, og erstatte den med en ml av nye medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens 3D-analyser kan utføres innen den samme stivhet av kollagen-gel, kan variere gelen stivhet brukes til å bestemme hvordan cellene vil svare på mekaniske endringer i deres cellulære mikromiljø. En stiv kollagen hydrogel er definert som en gel hvor de innebygde celler er ikke i stand til å trekke seg sammen lokalt det omgivende kollagen. Den iboende kontraktilitet av forskjellige celletyper er unik, og dermed er det best å begynne med en enkel kontraktilitet kurve for å etablere den kollagen-konsentrasjonen som skal bli avfølt som kompatibel og stiv.
Begynn med å holde celletall konstant og å øke konsentrasjonen av kollagen gel. Stivheten av gelen skalere eksponentielt med konsentrasjon, som vist tidligere 10,20. Et representativt eksempel på en kontraktilitet analysen er vist i figur 1. Her er 50.000 4T1-celler innleiret i eithera 2 mg / ml eller 3,5 mg / ml kollagen gel i 5 dager. Den 4T1-cellelinjen er en meget kontraktile, metastatisk cancer linje, men er bare i stand til å trekke den høye tettheten gelen med ca 10% (figur 1 a, c). Dette lave nivået av sammentrekning er typisk for en stiv gel klassifikasjon. Sammenlignbare geler med lav tetthet (2 mg / ml, figur 1b, c) kontraheres 57% (n = 4) i løpet av samme tidsperiode. Det er viktig å merke seg at økning av mengden av kollagen ligand kan påvirke cellesignalveier, og derfor et andre organ for å variere stivheten, er å holde den kollagen-konsentrasjonen konstant og sammenligne gelene som blir satt fast (stiv) ved å være igjen er festet til bunnen av parabolen eller kontraktile (kompatibel) fordi de har blitt gitt ut til å flyte fritt i cellen medium. Dette kan tjene som en god kontroll for å bestemme om endringer i cellulær signalisering resulterer fra øket kollagen ligand eller stivheten av matrisen.
Når mestring for å bygge celler i 3D-matriser er oppnådd, kan analyser endres for å endre organisasjonen og orientering av kollagenfibre. Dette oppnås ved bruk av PDMS microfluidic kanaler (figur 2). For formålet med dette manuskriptet ble to tilsvarende konformasjoner brukt, en smal og en bred kanal, med 3 åpninger eller porter (figur 2B). I et typisk eksperiment for å bestemme den cellulære respons på tilfeldig i forhold til fluktende matriser, er upolymerisert kollagen trekkes gjennom mikrofluidkanalen fra port A til port C med celler blir lagt til port B. Graden av kollagen innretting blir modulert ved frekvensen av kollagen flyte slik at høyere kollagen strømningsrater gir bedre justering. Bruken av smalere kanaler kombinert med høyerevakuumtrykk forbedrer innretting av kollagen-nettverk, mens en bredere kanal brukes i forbindelse med lave vakuumtrykk genererer tilfeldige matriser. Organiseringen av fibrillære nettverk kan visualiseres ved andre harmonisk generering, som vist på representative bilder (figur 2c, d). I disse bildene, kollagen fibrene (indikert av pilspisser og pseudocolored i lilla) justere mer konsekvent med aksen av kollagen strøm i trange kanaler (figur 2d). Kollagenfibre i brede kanaler har en rekke orienteringer, og har en mer tilfeldig fordeling (figur 2c).
Forskjellen mellom brede og smale kanaler er merkbar for det menneskelige øye, men kan også bli analysert via programvare som er utviklet spesielt for fiber analyse. CT-FIRE, en åpen kildekode og fritt tilgjengelig programvare, benytter en curvelet basert algoritme for pre-prosessering, etterfulgt aven fiber ekstraksjon algoritme for å kvantifisere fiber vinkel, tykkelse, lengde og retthet 21. For hver tilstand, ble mer enn 500 bilder tilfeldig samplet fra forskjellige steder i kanalene, og mer enn 125.000 fibre ble hentet ut og analysert ved CT-BRANN. Den påfølgende fiber vinkel histogram som genereres for de trange kanaler (figur 2f) viser en klar anrikning av fibre som er orientert parallelt med strømningsretningen. I motsetning til dette, brede kanaler har en mer tilsvarende fiber vinkelfordeling (figur 2e) som er konsistent med en mer tilfeldig matrise.
Viktigere, bruk av microfluidic anordninger, som en teknikk for å kontrollere organisering og orientering av kollagenfibre, gir mulighet for vurdering av ulike cellulære responser til endrede matriseforhold. For eksempel, Sung et al. fastslått at levedyktigheten til menneskelige mammary fibrobasts er avhengig av kollagen fiber.15 I tillegg har senere arbeid fra vårt laboratorium demonstrerer at bryst carcinoma celler migrerer mer vedvarende på innrettede kollagenfibre sammenlignet med tilfeldige kollagen matriser. 3. Disse resultatene hjelpe til bedre å definere rollen til mikromiljøet innenfor rammen av mammary biologi og brystkreft. Fremover, evnen til å nøyaktig kontrollere 3D cellulære mikromiljø vil muliggjøre videre undersøkelse av viktige cellulære responser innenfor rammen av mange forskjellige sykdomstilstander.
Figur 1. 3D Kollagen Geleer til målecellen kontraktilitet og cellulære responser til ECM Stivhet. 4T1 celler ble sådd ut i begge (A) 3,5 mg / ml og (B) 2 mg / ml kollagen geler og tillatt å vokse i 5 dager. Over tid, kollagen gel (Gray områdeinnenfor stiplet linje) vil kontrakten og diameteren måles og kvantifiseres i (c, t-test, feilfelt +/- SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. generere slump og innrettet kollagen matriser ved hjelp av PDMS mikrokanaler. En seks tommers silikonplaten (a) ble anvendt som et templat for både brede og smale PDMS mikrokanaler (b). Identiske kollagenkonsentrasjoner ble trukket gjennom begge typer kanaler, og individuelle fibre (pilspisser, c, d) på linje med strømningsretning (piler) i smale mikrokanaler (D). Brede microchannels gitt mer tilfeldige matriser. fiber hjørner av paes med hensyn til bunnen av bildet ble tellet og vist i (e) og (f). Scale bar = 26 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D kollagen gels er et verdifullt tilskudd til vår verktøykasse for å forstå hvordan celler tolke og svare på deres lokale mikromiljøet. Dette manuskriptet har gitt en helt enkel protokoll for å bygge celler i et 3D kollagen matrise, og til reproduserbart generere matriser med tilfeldige eller justert kollagenfibre. Begge protokoller fungerer som tilpasnings plattformer hvor forskjellige kollagen isoformer, tverrbindingsmidler eller andre matriksproteiner kan potensielt bli tilsatt ved tidspunktet for polymeriseringen. Det er også lett å modifisere plattformene for å vurdere forskjellige tidsrammer og endepunkter for genekspresjon og proteinproduksjon. Imaging, vurdere protein og RNA-nivåer, og lese metabolske profilene er alle veldig kompatible med disse 3D-teknikker.
Som er viktig med alle teknikker, er det viktig å vurdere kvaliteten av gelen og analysen. Et tegn på en god kvalitet kollagen gel er en som kan håndtere manuell manipulering. For eksempel, en 1 ml [1 mg / ml] Kollagen gel helles i en seks brønn plate bør være lett plukket opp med en tang og manipulert. Dersom gelen tårer eller fragmenter, kvaliteten av gelen er suboptimal, og trinn må tas for å bedre kollagen polymerisasjonen. Temperatur og pH-verdien er de viktigste parametrene som kreves for god fiberdannelse og geldannelse. Begynn feilsøkingsprosessen ved å sørge for alle komponentene holdes på is inntil de er klare for gelering å skje. Det er også svært viktig å sørge for at nøytraliseringen buffer og kollagen stamløsning blir blandet grundig. Deretter bekrefter at pH for nøytraliseringen bufferen er ved pH 7,4. En HEPES-bufret PBS anbefales fordi det er meget kompatibel med vevskultur, har en bred buffrende område, og stamoppløsningene har en tendens til å være svært stabil ved 4 ° C i lange perioder av gangen. Det har også den ekstra fordelen av å produsere lengre, mer buede fibre som er mer lik den fysiologiske tilstand 15. NaOH er en annen commoare brukt nøytralisere løsning, men må titered nærmere. Det ser også ut til å ha effekt av å produsere kortere, tykkere fibre 15. Uansett bør pH i det nøytraliserte kollagen være ved en pH-verdi på 7,4. Hvis alle disse betingelsene blir oppfylt, og integriteten til gels er fortsatt ikke tilfredsstillende, så problemet ligger hos aksje kollagen løsning. Selv om lagerkollagenløsningen har et notert holdbarhet på 6 måneder ved 4 ° C, har vi funnet at det er generelt kortere enn kommersielle kilder krav når det brukes til 3D-geler. Kast den gamle flasken, og bestille fra et nytt parti. Det er ikke uvanlig for kvaliteten av kollagen fra produsent til å variere betydelig fra parti til parti.
I tillegg til å identifisere kvalitet kollagen geler, er det også viktig å identifisere de trinnene som er avgjørende for dannelse av god innretting i PDMS microchannel. Det underliggende prinsipp for denne teknikken er at frekvensen av collagen strømmen gjennom micro induserer senere filament justering. Derfor er det mest kritiske trinn i å kontrollere graden av fiberinnrettings er korrekt modulasjon av vakuumtrykk. For tilfeldige kollagen innretting i en microchannel, må vakuumtrykket være lav, og kollagenet skal flyte langsomt ned i kanalen. Dersom kollagenet flyter gjennom for raskt, vil fibrene begynne å justere. Et bredere kanal gjør denne påstanden enklere. Omvendt, for god kollagen innretting, høyere vakuumtrykk må benyttes og kollagen løsningen må trekkes gjennom raskere. En annen kritisk trinn i dannelsen av innrettede matriser er temperaturen. Det er svært viktig å sørge for at alle komponenter og løsninger er kjølt på is før bruk. Dersom kanalene ikke er kjølt før bruk, vil kollagen i kanalene polymerisere for hurtig, og vil resultere i tynnere, mindre fibre. Hvis nøytralisert kollagen blir kjølt ved 4 ˚C og ikke på is, Forbedringed kjernedannelse vil gi opphav til større fiberdiametere som er vanskeligere å justere ved strømning. Det er også viktig å slappe av microchannel selv. Uten forutgående kjøling, vil det lille volum av kollagen oppvarmes meget hurtig, hvilket ga dårlige resultater.
Kollagenmikrokanaler er en meget nyttig teknikk, men det er visse begrensninger. For en, justeringen i en flyt-indusert microchannel er aldri perfekt, og vil aldri lik en belastning-indusert justering teknikk. Det vil alltid være noen fibre som er orientert vinkelrett i forhold til strømningsretningen, men det reproduserbarhet, tilpasningsevne, og brukervennlighet oppveie de små variasjonene i innretting inne i kanalen. Enda viktigere, celler er blitt vist å effektivt å avføle små endringer i innretting, og reagere med mer vedvarende migrasjon i disse kanalene 3,15. Cellene vil også forbedre innrettingen av kanalen som deres antall øker og de begynner å migrere. Hvis større justering ier påkrevet, kan PDMS microchannels enkelt endres til smalere dimensjoner eller å ha små restriksjonar for å forbedre justering. Begge har vist seg å være effektive, men har andre tilknyttede avveininger 16. En annen begrensning for microchannel teknikk er at den PDMS kanal har liten permeabilitet til medikamenter eller fluorescerende fargestoffer. Dette betyr at disse forbindelser må diffundere ned i kanalen fra portene, som er overraskende lav, og kan utgjøre vanskeligheter med å vaske ut behandlinger.
Selv om det er visse begrensninger for denne microchannel plattformen, det tilbyr flere fordeler i forhold til eksisterende teknikker. Det er mer eksperimentelt tilgjengelig da det ikke krever omfangsrike instrumenter 3,13 eller små populasjoner av celler for å generere innretting. Det heller ikke krever eksogene magnetiske kuler 13,14 som pleier å være autofluorescent og kunne kunstig kryssbinde kollagen nettverket. Kollagen microchannel erogså rett og slett mer kostnadseffektiv og økonomisk. I tillegg til de nåværende fordeler, har den også mange fordeler som kan utnyttes i fremtidige anvendelser. For det første kan den kollagen microchannel være utformet eller modifisert på nesten hvilken som helst konfigurasjon eller eksperiment. Avanserte design tillater kanalene for å lage hule kollagen rør eller 3D-strukturer for å etterligne den arkitekturen av forenklede organer eller tumorer 22. Videre kan kanalene være laget av andre materialer enn PDMS materialer. Dette kan potensielt formidle ulike mekaniske egenskaper til de innebygde kollagen nettverk eller matriser. Til slutt, kan den lille mengden av reagenser benyttet i denne analysen også gjør det attraktivt og økonomisk for mindre høy gjennomstrømning skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Grant tall UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, og T32-GM008692-18 for å finansiere dette arbeidet. Vi erkjenner også Jeremy Bredfelt og Yuming Liu loci for utvikling av og hjelp med CT-FIRE analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
