Summary
コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。
Protocol
1.中和、希釈および3D調査と細胞収縮アッセイのためのコラーゲンソリューションの重合
- 滅菌組織培養フード中で氷上で、コラーゲン（1：1）を中和2×PBS、pH7.4中の滅菌、氷冷100mMのHEPESで、15ミリリットルコニカルチューブ内を。溶液が均一でないと、混合渦巻きが見えなくなるまで、プラスチックピペットを用いて完全に混合します。混合プロセスの間に気泡を導入しないように注意してください。氷の上で簡単に保管してください。
- 細胞培地を用いて適切な濃度（ など RPMI、DMEM、など）に中和されたコラーゲンを希釈します。
- Nが必要な中和コラーゲンの量であり、（S / 2）/所望のコラーゲン濃度を構成するために必要な中和されたコラーゲンの量を計算式N =（Dの*のV）を使用するには、Dは、所望のコラーゲン濃度で、Vは所望の最終コラーゲン濃度の量、及びSをt彼は株式コラーゲン濃度を開始します。
- 細胞と細胞培地溶液を添加することによってボリュームに中和したコラーゲンの量を起動します。完全に混合し、キャストする準備ができるまで氷上で保存します。
- 例：1ミリリットルゲルボリューム（6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュでゲルキャスト用の典型的な量）中の2mg / mlのゲルについて、最初の所望の最終体積で所望の濃度（2mg / ml）を掛けます（1 ml）を。この数（2 mg）を取り、ボトルに記載されているストック濃度（9.49 mg / mlで）の半分で割り。この場合には、中和されたコラーゲンを0.42 mlの培地/細胞混合物0.58 mlを希釈します。
- ピペットは、非組織培養のいずれかに、氷冷コラーゲン/細胞/培地の混合物を、6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュを処理しました。溶液を均等に広げるためにピペットチップを使用してください。
注：collagの外の細胞の付着又は成長を最小化するために、非組織培養処理したプレートを使用することが重要ですゲルエン。 - 15分 - 約10のために室温で重合することを可能にします。ゲルは、重合時に不透明有効にしてください。
- 重合を完了するために60分 - それが不透明になった後、追加の45を37℃にプレート又は皿を移動します。
- 45後 - メディアの3ミリリットルとウェルまたは皿の周囲P200のピペットチップを実行することにより、ウェルの側面からゲルをリリース - 60分、2を追加します。渦巻料理は優しくゲルを解放します。コラーゲンゲルは、メディアに浮遊する必要があります。
2.ウェスタンブロッティング、細胞形態形成やジェルGontractilityアッセイ
- タンパク質レベル、ECMの剛性に関連する形態や細胞の収縮性を評価するために、コラーゲンゲルを注ぐことにより開始し、1.1に従って - 10日間のアッセイ - 1.6、7用の細胞を播種。成長率や密集度に応じて経験的に各細胞株の播種量を決定します。 100,000細胞/ゲル - 10日間のアッセイについては、播種密度20,000の範囲であり得ます。
- 測定する細胞収縮性は、24時間毎定規またはカメラを使用するか、または適切な時間間隔でゲルの直径を測定します。
注：細胞株の形態学的特徴の特性は、ゲルに播種するために加え、顕微鏡から収集し、対応する画像は、腺房様構造、上皮尿細管、細胞突起、及びlameliapodiaとして、調べることができます。 - ウォズニアックに記載されているように17、ギャラガーら ら 、タンパク質レベルを評価するRIPA緩衝液でゲルを溶解し、目的のタンパク質のウエスタンブロット分析のために処理した。18。
- 重要：細胞株との間の収縮性の比較で、 らルイで概説したようにゲルから抽出することができる総DNAへの収縮性を正常化19、または西洋によって変化しない、ハウスキーピングタンパク質（ヒストン、GAPDH など ）。ブロット分析、ウォズニアックらに記載されているように17、ギャラガーら 。18。血球計数器を用いてゲル内の細胞を計数した場合、請負ゲルなど総ゲル面積に細胞数を正規化することを確認した細胞を集中します。
- メディアの1ミリリットルを除去し、新鮮な培地の1ミリリットルでそれを置き換えることにより4日 - フィードゲルごとに3。測定は新鮮な培地/血清の添加とした後、ゲルを供給するようにしてください収縮にスパイクが発生します。
コラーゲン繊維の位置合わせのためのPDMSマイクロチャンネルの3世代
注：整列コラーゲンマトリックスを生成するには、PDMSマイクロチャネル（ 図 2A）のための金型は、ソフトリソグラフィー15を介して作られたSU-8シリコンマスターが必要です。
- PDMSチャネルを作成するには、クラフトスティックで使い捨てカップに徹底的にPDMSを混ぜます。 6インチのシリコンマスターのために、硬化剤を2 gのエラストマーベース20gを混合します。
- 脱ガスの減圧下で真空チャンバ内で使い捨てカップを配置することによってPDMS液550ミリメートルHgの。 1.5時間 - 1のための脱ガス。
- PDMSを脱ガス発生が、注ぐためのシリコーンマスターを準備します。シリコーンマスターに続いて、ホットプレート上に透明フィルムのクリーンシートを配置することによって準備します。マイクロチャネルモールドは上向きいることを確認してください。
注：PDMS鋳造および硬化中に、シリコーンマスタは透明フィルムの2枚のシートの間に挟まれます。 - 1の後 - 1.5時間、真空チャンバーから脱気PDMSを削除して、ゆっくりとシリコーンマスターの上に注ぎます。
重要：気泡を避けてください。マスターの中心に注ぐと、重力が均等にそれを広めることができるように続けます。
注：PDMS降下がマスターの端にすべての方法を拡張する必要はありません。 - PDMSをマスター上に注がれた後、シリコンマスターとPDMSの上に透明フィルムの第二シートを適用します。慎重に気泡を回避するために、PDMS /シリコンマスターの上に第二の透明シートを転がり落ちます。急がないで。 PDMSは今均等にoを分散させる必要がありますマスター版。
- 静か1/8 "アクリル板に続いて透明性の上にゴムシートを配置。
- アクリル板の上に3 10ポンドの重みを追加します。当初は、重みは「フロート」になります。彼らはさらに進む前に解決して安定化することを可能にします。
- 4時間、70℃および硬化PDMSにホットプレートの温度を設定します。乱す前にさらに1時間の最小値のために冷却してください。
- 慎重にウエハから透明フィルムのトップシートを剥離し、鉗子でチャンネルを削除します。
- 使用する準備ができるまで無塵の皿に保管してください。
使用4.プレッピングPDMSマイクロチャンネル
- 逆さまに新しい、きれいな透明フィルムの上に置いてチャンネル。鋭いピンセットで円運動を使用して清掃し、すべてのポート（ 図2b）。 PDMSの任意のフラグメントを削除します。
- タッククロスとしてガムテープの一部を使って、クリーンチャンネル。ベンチ（粘着面を上）の表面にテープを適用し、その後、チャネルOを設定n個のトップ。良好な接触を確実にするために鉗子の丸い端を有するチャネルを押し下げます。削除して、目に見える破片が除去されるまで両側に繰り返します。
- 洗浄転送は、70％EtOHで50ミリリットルコニカルにPDMSチャネルを準備さ。 30秒間最大速度でボルテックス。エタノールを捨て、新鮮な70％EtOHで置き換えます。使用する直前まで70％エタノールで保管してください。
- 組織培養フード内で無菌技術を使用して、清潔で無菌カバーガラスやガラスボトムディッシュにPDMSチャネルを転送します。エタノールが蒸発するまで、チャネル側のアップとUV御馳走を置きます。
- チャンネルはカバーガラスに向かって下向きにされるように乾燥したら、PDMSを反転。良好なシールを作るためにガラス上にPDMSチャネルを押し下げます。中央のポート（ポートB、 図2b）を閉じる/カバーするために滅菌PDMSのパッチを追加します。先に進む前には、完全に乾燥できるようにします。
- プレコート滅菌水で10 / mlのコラーゲンとチャネルの内部。コートに、channの上に100μlの液滴を配置エル、真空とを通して描きます。 37℃で1時間後、冷蔵庫へのコラーゲンコーティング溶液で満たされた転送チャネル。 30分 - 約15のためのチル。
- 吸引器またはピペットでコラーゲンコーティング溶液を除去し、コラーゲンの準備を始めます。
マイクロチャンネルにおける使用のため5.コラーゲンの準備
- 2×PBS、pH7.4中の氷冷100mMのHEPESで：氷上で、コラーゲン（1 1）を中和します。均一になるまで完全に混合（詳細については、1.1節を参照してください）。
- 細胞培地を用いて適切な濃度に中和されたコラーゲンを希釈する（詳細については、1.2節を参照してください）。氷上で15分間インキュベートします。
- 同時に、寒さは氷の上のチャネルを搭載しています。
注：目標は4℃以下でのチャネル処理のためのすべてのコンポーネントを持つことです。コラーゲンの核形成温度及び時間は、重合プロセスに重要なパラメータであり、そして必要に応じて、さらなる最適化のための出発点であってもよいです。 - COUNこの時に適切な播種密度で血球計および再懸濁を有するT細胞。 3百万個の細胞/ mlの - 計算を容易にするために、1に再懸濁します。 （詳細については、また、2.1節を参照してください）。
- 細胞がカウントされ、15分が経過したら、注ぐコラーゲンに進みます。
6.注ぐ同盟とランダムコラーゲンマイクロチャンネル
- チャネルを介してコラーゲンを描画する前に、調整し、インライン真空レギュレータと真空圧力を設定します。真空圧は、誘導し、アライメントの程度を決定するコラーゲンの流量を制御するための力を提供します。
- ランダムまたは非整列行列の場合、10ミリメートルHgの以下の真空圧と広いチャネル（3ミリメートル幅×身長200μm）を使用します。
- 整列行列に対して、60ミリメートルHgの以上の真空圧力で狭チャネル（1ミリメートル幅×200μmの背の高い）を使用します。
- 氷からマウントされたチャネルを削除し、層流hのクリーン、消毒表面上に置きますOOD。
- （ 図2b）、ポートAに中和されたコラーゲン150μlの-すぐに働くと120をロードします。
- ポートc（ 図2b）を介して真空ラインに取り付けられた25ミリリットルピペットを配置することによって、チャネルを介してコラーゲンを描画します。単一、均一な動きで通ってコラーゲンを描画します。重要：ランダムまたはアラインされていない行列の場合、チャネルにわたってゆっくりとコラーゲンを描く（約0.5から1秒当たりミリメートル）、およびそれが最後に到達すると停止します。整列行列に対して、より迅速に渡ってコラーゲンを描くが、気泡を避けるように注意してください。
- 慎重P200ピペットマンやアスピレーターでポート領域から過剰なコラーゲンを削除します。
- AとCのすべてのポートが今カバーされるべきである両方のポートを介して滅菌PDMSパッチを配置します。
- 2後 - 3分、中央PDMSパッチ（ポートB）を除去し、2を追加 - 中央ポートに - （1万細胞5）細胞の3μLを。 15分 - 部分的に別の10室温で（不透明ターン）重合させました。
- 10後- 15分、さらに15、37℃への転送 - 重合を終了する30分。 PDMSのカバーを外し、必要に応じて完全にチャネルと文化のセルをカバーするためにメディアを追加。細胞は、古いメディアのミリリットルを除去し、新しいメディアのミリリットルでそれを置き換えることによって供給することができます。
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Representative Results
3Dアッセイは、コラーゲンゲルの同じ剛性内で行うことができるが、ゲルの剛性を変化させることは、細胞がそれらの細胞の微小環境における機械的な変化に応答する方法を決定するために使用することができます。堅いコラーゲンハイドロゲルは、埋め込まれた細胞が局所的に周囲のコラーゲンを収縮することができないゲルとして定義されています。異なる細胞型の本質的な収縮が独特であるため、それが準拠しており、硬いとして感知されるコラーゲン濃度を確立するために、単純な収縮曲線で始めるのがベストです。
細胞数を一定に保持し、コラーゲンゲルの濃度を増加させることによって開始します。以前に10,20示すように、ゲルの剛性は、濃度とともに指数関数的にスケールします。収縮アッセイの代表的な例は、図1に示されている。ここでは、50,000 4T1細胞をeitheに埋め込 まれていますRAの2mg / mlまたは5日間3.5 mg / mlでコラーゲンゲル。 4T1細胞株は、高度に収縮、転移性癌の線であるが、わずか約10％の高濃度のゲルを収縮させることができる（図1A、C）。収縮のこの低レベルは堅いゲル分類のための典型的なものです。同程度の低濃度のゲル（2 mg / mlで、 図1bは、C）は、同じ時間枠の間に57％収縮した（n = 4）されています。の底に取り付けたままされることによって（硬い）の剛性を変化させる、したがって第二の手段は、コラーゲン濃度を一定に保持し、拘束されたゲルを比較することで、コラーゲンリガンドの量を増加させるとシグナル伝達経路の細胞に影響を与える可能性があることに注意することが重要ですディッシュまたは収縮（準拠）、それらは細胞培地中で自由に浮遊するためにリリースされているため。これは、細胞内シグナル伝達の変化が増加したコラーゲンリガンドまたはマトリックスの剛性に起因するかどうかを判断するために良好な制御としての役割を果たすことができます。
3Dマトリックス内の細胞を埋め込むの習得が達成されると、アッセイは、コラーゲン繊維の組織と向きを変えるように修飾することができます。これは、PDMSマイクロ流体チャネル（ 図2）を使用することによって達成されます。本稿の目的のために、2つの同様のコンフォメーションは、3の開口部またはポート（ 図2b）と、狭い、広いチャネルを使用しました。整列の行列に比べてランダムに細胞応答を決定するための典型的な実験では、未重合コラーゲンは細胞がコラーゲンアライメントの程度は、コラーゲンの割合で変調されたポートBに追加されると、ポートCにポートAからマイクロ流体チャネルを通して描かれています高いコラーゲン流量がより良い位置合わせが得られるような流れ。高いと相まって、より狭いチャネルの使用低真空圧と併せて使用される広いチャネルは、ランダム行列を生成しながら、真空圧は、コラーゲンネットワークの整合性を高めます。代表画像（ 図2C、D）に示すように、原線維網の構成は、第二高調波発生によって可視化することができます。これらの画像では、コラーゲン線維（矢印で示され、紫色で疑似カラー）は、狭いチャネル（ 図2d）におけるコラーゲンの流れの軸と、より一貫して整列します。広いチャネル中のコラーゲン繊維は、様々な向きを有し、よりランダムな分布（ 図2c）を有します。
広いおよび狭いチャネルとの間の差は、人間の目に識別可能であるが、繊維分析のために特別に開発されたソフトウェアを介して分析することができます。 CT-FIRE、オープンソースで自由に利用可能なソフトウェアは、続いて前処理のためのcurveletベースのアルゴリズムを利用します繊維の抽出アルゴリズムは、ファイバ角度、厚さ、長さ、および真直21を定量化します。各条件については、500以上の画像がランダムにチャネル内の異なる場所から採取した、以上125,000繊維は、CT-FIREにより抽出し、分析しました。狭いチャネル（ 図2F）のために生成された後続の繊維角度ヒストグラムは、流れの方向に平行に配向された繊維の明らかな濃縮を示しています。対照的に、幅の広いチャネルは、よりランダム行列と一致する複数の同等の繊維角度分布（ 図2E）を有します。
重要なことは、マイクロ流体デバイスの使用は、組織およびコラーゲン繊維の配向性を制御する技術として、改変されたマトリックス条件に対する様々な細胞応答の評価を可能にします。例えば、宋ら 。ヒト乳房fibrobastsの生存率がコラーゲン繊維に依存していることを決定しました。15はまた、我々の研究室からの最近の研究は、乳癌細胞がランダムコラーゲンマトリックスに比べて整列コラーゲン繊維に、より永続的に移行することを実証している。3これらの結果は、より良い乳腺生物学と乳がんのコンテキスト内微小環境の役割を定義するのに役立ちます。今後、正確な3D携帯微小環境を制御する能力は、多くの異なる疾患状態の文脈の中で重要な細胞応答の継続的な調査が可能になります。
細胞収縮性およびECM剛性に対する細胞応答を測定するための図1. 3Dコラーゲンゲルは。4T1細胞が両方に播種しました （a）は、3.5 mg / mlとし、 （B）に2mg / mlのコラーゲンゲルを5日間増殖させました。時間をかけて、コラーゲンゲル（グレーエリア点線内）収縮し、直径を測定し、定量化された（C、スチューデントのt検定、エラーバー+/- SD）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PDMSマイクロチャネルを使用して図2乱数発生及び配向コラーゲンマトリックス。6インチシリコンウエハ（A）は 、幅狭の両方PDMSマイクロチャネル（B）のための鋳型として使用しました。同一のコラーゲン濃度は、両方のチャネルの種類、および個々の繊維（矢じり、C、D）を通って引かれた狭いマイクロチャネル内の流れの方向（矢印）と整列 （D）。幅広のマイクロチャネルは、よりランダムな行列を生成しました。ファイバーANGL画像の下部に対してESを計数し、（e）及び（f）に示しました。スケールバー=26μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
3Dコラーゲンゲルは、細胞がどのように解釈するかを理解し、それらの局所微小環境に対応するため、当社のツールボックスに貴重な追加されています。この原稿は、3Dコラーゲンマトリックス内に細胞を埋め込むための非常に基本的なプロトコルを提供している、かつ再現ランダムまたは整列したコラーゲン繊維とマトリクスを生成します。両方のプロトコルは、異なるコラーゲンアイソフォーム、架橋剤、または他のマトリックスタンパク質は、潜在的に重合時に添加することができる適応プラットフォームとして働きます。遺伝子発現およびタンパク質産生のために異なる時間枠およびエンドポイントを評価するためのプラットフォームを変更することも容易です。イメージング、タンパク質やRNAのレベルを評価し、代謝プロファイルを読み込むには、すべてのこれらの3D技術と非常に互換性があります。
すべての技術とが重要であるとして、ゲルおよびアッセイの品質を評価することが重要です。良質のコラーゲンゲルの符号は、手動操作を扱うことができるものです。例えば、1 mlの[1mg / mlの簡単にピンセットで拾い、操作されるべき]コラーゲンゲルは、6ウェルプレートに注ぎました。ゲル涙または断片場合、ゲルの品質が準最適であり、およびステップは、コラーゲン重合を改善するために取られる必要があります。温度およびpHは、良好な繊維形成およびゲル化のために必要な最も重要なパラメータです。ゲル化が起こるためには、すべてのコンポーネントが準備ができるまで氷上に保持されていることを確認することにより、トラブルシューティングのプロセスを開始します。中和緩衝液とコラーゲン原液を十分に混合されていることを確認するためにも非常に重要です。次に、中和緩衝液のpHは7.4であることを確認してください。 HEPESは、それが組織培養に非常に互換性があるため、PBSを推奨する緩衝広い緩衝範囲を有し、ストック溶液は長期間4℃で非常に安定である傾向があります。それはまた、生理学的状態15に類似しているより長い、より湾曲した繊維を製造するという利点を有します。 NaOHが別のCommoですNLY溶液を中和に使用するが、より密接に滴定される必要があります。また、より短い、より厚い繊維15を生成する効果を有すると思われます。かかわらず、中和されたコラーゲンのpHは、7.4のpHであるべきです。これらすべての条件が満たされており、ゲルの保全性がまだ十分ではない場合、問題はストックコラーゲン溶液です。ストックコラーゲン溶液は4℃で6ヶ月のリストされた貯蔵寿命を有するが、我々は3次元ゲルのために使用される場合、商業的供給源を主張よりも一般に短いことを発見しました。古いボトルを捨てて、新しいロットからの注文。メーカーからのコラーゲンの品質はロット間に有意に変化することは珍しくありません。
高品質のコラーゲンゲルを識別することに加えて、PDMSマイクロチャネル内の良好な配向を生成するための重要なステップを特定することも重要です。この技術の基本原理は、高専の割合でありますマイクロチャネルを通るアジャンの流れは、その後、フィラメントの配置を誘導します。したがって、繊維配向の度合いを制御する最も重要なステップは、真空圧の適切な変調があります。マイクロチャネル内のランダムなコラーゲンアライメントのために、真空圧が低くなければならない、とコラーゲンは、チャネルダウンゆっくりと流れなければなりません。コラーゲンはあまりにも速く流れると、繊維が整列するために開始されます。広いチャネルは、この命題が容易になります。逆に、良いコラーゲンアライメントのために、より高い真空圧を使用する必要があり、コラーゲン溶液は、より迅速を通じて引かなければなりません。整列行列の生成において第2の臨界段階は温度です。すべてのコンポーネントおよびソリューションが使用前に氷上で冷却されていることを確認することは非常に重要です。チャネルは使用前に冷却されていない場合は、チャネル中のコラーゲンも速く重合し、より薄い、より小さな繊維をもたらします。中和コラーゲンは4℃に冷却している場合ではない氷の上で、enhancED核は、流れによって位置合わせがより困難である、より大きな繊維径を生じさせます。マイクロチャネル自体を冷却することも重要です。前冷却することなく、コラーゲンの小容積は悪い結果をもたらす非常に急速に暖めます。
コラーゲンマイクロチャネルは非常に有用な技術であるが、一定の制限があります。 1については、流れによって誘発されるマイクロチャネルのアライメントは決して完全ではない、と歪誘起アライメント技術を等しくすることはありません。常に流れの方向に垂直に配向いくつかの繊維が、再現性、適応性、使いやすさは、チャネル内の位置合わせの小さな変化を上回るがあります。さらに重要なのは、細胞が効果的に位置合わせの小さな変化を感知し、これらのチャネル3,15でより持続的移行で応答することが示されています。その数は増加し、彼らが移行し始めるように、細胞は、チャネルの整列を向上させます。もし大きなアライメントI必要なのは、PDMSマイクロチャネルを容易に狭い寸法に変更することができるか、位置合わせを向上させる小さな収縮を有すること。両方が有効であるが、他の関連したトレードオフ16を有することが示されています。マイクロチャンネル技術の他の制限は、PDMSチャネルは、薬剤または蛍光色素に小さな透過性を有することです。これは、これらの化合物が驚くほど遅いポートからチャネルをダウン拡散する必要があり、治療を洗浄の困難をもたらすことができることを意味します。
このマイクロチャネルプラットフォームに一定の制限がありますが、それは既存の技術に比べていくつかの利点を提供しません。それはかさばる楽器3,13またはアライメントを生成するための細胞の小集団を必要としないように、それはより実験的にアクセス可能です。また、自家蛍光になる傾向があり、人為的にコラーゲンネットワークを架橋することができ、外因性磁気ビーズ13,14を必要としません。コラーゲンマイクロチャネルは、また、単に、より費用対効果が高く、経済的。現在の効果に加えて、それは、将来の用途に活用することができる多くの利点を有しています。一つには、コラーゲンのマイクロチャネルを設計することができるか、またはほとんどすべての構成や実験で変更します。高度なデザインは、チャネルが簡略化された器官または腫瘍22のアーキテクチャを模倣するために中空のコラーゲン管または3D構造を作成することができます。さらに、チャネルは、PDMS以外の材料で作ることができます。これは、潜在的に埋め込まれたコラーゲンネットワークまたはマトリックスに異なる機械的性質を伝えることができます。最後に、このアッセイに使用される試薬の少量も小さくハイスループットスクリーニングのために、それが魅力的かつ経済的になるかもしれません。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません
Acknowledgments
作者はこの仕事に資金を供給するための助成金番号UO1CA143069、R01CA142833、R01CA114462、RO1CA179556、T32-AG000213-24、およびT32-GM008692-18を承認したいと思います。また、CT-FIRE分析での開発と支援のための遺伝子座のジェレミーBredfeltとユーミン劉を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
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