Summary
Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.
Protocol
1. Neutralisation, Verdünnung und Polymerisation von Kollagen-Lösungen für 3D-Untersuchung und zelluläre Kontraktions Assays
- Auf dem Eis in sterilen Gewebekultur Kapuze, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit sterilem, eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in einem 15 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie gründlich mit Plastikpipette, bis die Lösung homogen ist und Misch Wirbel sind nicht mehr sichtbar. Achten Sie darauf, keine Luftblasen während des Mischprozesses einzuführen. Bewahren Sie kurz auf Eis.
- Verdünnte neutralisierte Collagen auf die geeignete Konzentration mit Zellmedium (wie RPMI, DMEM, etc.).
- Zur Berechnung der Menge an neutralisierten Kollagen zu bilden gewünschte Kollagen - Konzentration erforderlich ist , verwenden Sie die Gleichung N = (D * V) / (S / 2), wobei N Menge an neutralisierten Kollagen ist erforderlich, D die gewünschte Kollagen - Konzentration ist , V das Endvolumen der Kollagenkonzentration gewünscht ist, und S ter beginnt Lager Kollagen-Konzentration.
- Bringen die Menge der neutralisierten Collagen-zu-Volumen durch die Zugabe von einer Zelle und Zellmedien Lösung auf. Gut mischen und auf Eis halten, bis sie bereit zu werfen.
- Beispiel: Bei einer 2 mg / ml Gel in einem 1 ml Gelvolumen (typisches Volumen für ein Gel gegossen in 6-Well-Platte oder 50 mm Glasbodenschale), multiplizieren Sie zunächst die gewünschte Konzentration (2 mg / ml) durch das gewünschte Endvolumen (1 ml). Nehmen Sie diese Zahl (2 mg) und teilen sie durch die Hälfte der Stoffkonzentration auf der Flasche aufgeführt (9,49 mg / ml). In diesem Fall werden mit 0,58 ml Medium / Zellmischung 0,42 ml der neutralisierten Collagen verdünnt.
- Pipettieren der eiskalten Kollagen / Zelle / Medien in Mischung entweder eine Kultur nicht zu behandelnde Gewebe 6-Well-Platte oder eine 50 mm Glasbodenschale. Verwenden Sie Pipettenspitze gleichmäßig die Lösung verteilt.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine nicht-Gewebekultur-behandelte Platte zu verwenden, um die Bindung oder das Wachstum der Zellen außerhalb des collag zu minimierenen-Gel. - Man lässt etwa 10 bei Raumtemperatur zu polymerisieren - 15 min. Die Gele sollten undurchsichtig bei der Polymerisation drehen.
- Nachdem es undurchsichtig geworden ist, bewegen Platte oder einen Teller bis 37 ° C für weitere 45 - 60 min Polymerisation zu beenden.
- Nach 45 - 60 min, fügen Sie 2 - 3 ml Medium und Release-Gele von den Seiten des Bohrlochs durch eine p200 Pipettenspitze um Umkreis von gut oder Schale läuft. Swirl Gericht sanft das Gel zu lösen. Das Kollagen-Gel sollte in den Medien zu schweben.
2. Western Blotting, Cell Morphogenese und Gel Gontractility Assay
- Um Protein-Spiegel, der Morphologie oder zelluläre Kontraktionsfähigkeit in Bezug Steifigkeit an das ECM, beginnen durch Gießen Collagengele, gemäß 1.1 beurteilen - 1.6, entkernt mit Zellen für einen 7 - 10 Tage-Test. Bestimmen Sie jede empirisch Särate Zelllinie in Abhängigkeit von Wachstumsrate und Konfluenz. 100.000 Zellen / Gel - Für einen 10 Tage-Test kann die Aussaatdichte von 20.000 liegen.
- MessenZellkontraktilität, messen Sie den Gel Durchmesser durch ein Lineal oder eine Kamera Intervall alle 24 Stunden oder zu gegebener Zeit verwendet wird.
Anmerkung: Zusätzlich entsprechende Bilder von dem Mikroskop gesammelt können in dem Gel, wie Acini artige Strukturen, epithelialen Tubuli, zellulärer Vorsprünge und lameliapodia ausgesät für morphologische Merkmale Charakteristik der Zelllinie untersucht werden. - Proteinspiegel, lysieren die Gele in RIPA - Puffer und Verfahren zur Western - Blot - Analyse von Proteinen von Interesse zu bewerten , wie in Wozniak et al. 17 und Gallagher et al. 18.
- WICHTIG: Bei Vergleichen der Kontraktilität zwischen Zelllinien, normalisieren Kontraktilität Gesamt - DNA, die aus den Gelen extrahiert werden kann , wie von Lui skizziert, et al 19, oder zu einem unveränderlichen, Housekeeping - Protein (Histone, GAPDH, etc.) durch Western. Blot - Analyse, wie in Wozniak et al. 17 und Gallagher et al. 18. Wenn das Zählen Zellen innerhalb des Gels eine Zählkammer, stellen Sie sicher, Zellzahl auf insgesamt Gelfläche als Auftraggeber Gel zu normalisieren Zellen konzentrieren.
- Feed-Gele alle 3 - 4 Tage von 1 ml Medium entfernt und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Stellen Sie sicher, Gele zu füttern, nachdem die Messung als die Zugabe von frischem Medium / Serum genommen wird, wird eine Spitze in der Kontraktilität führen.
3. Erzeugung von PDMS Mikrokanäle für Collagen Faserjustage
Hinweis: Um ausgerichtet Kollagenmatrices, eine Form für PDMS Mikrokanäle (2A) erfordert eine SU-8 - Silizium - Master hergestellt über Softlithographie 15 erzeugen.
- Um PDMS Kanäle machen, mischen PDMS gründlich in einem Einwegbecher mit einem Handwerks-Stick. Für einen 6-Zoll-Silikon-Master, mit 2 g Härter 20 g Elastomerbasis mischen.
- De-Gas die PDMS-Mischung durch die Einwegbecher in einer Vakuumkammer unter einem Vakuumdruck Platzierung von550 mm Hg. De-Gas mit 1 - 1,5 Std.
- Während die PDMS Entgasen, bereiten Sie das Silikon-Master für das Gießen. Bereiten Sie mit einem sauberen Blatt Transparentfolie auf einer Heizplatte, gefolgt von der Silikon-Master platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalform nach oben zeigt.
HINWEIS: Bei PDMS Gießen und Aushärten der Silikon Master wird zwischen zwei Platten aus Transparentfolie sandwichartig angeordnet werden. - Nach 1 bis 1,5 Stunden, entfernen Sie die entgaste PDMS aus der Vakuumkammer, und gießen Sie langsam den Silikon-Master.
WICHTIG: Vermeiden Sie Luftblasen. Weiter in der Mitte des Master zu gießen, und lassen Sie die Schwerkraft gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: Die PDMS Abfall muss nicht den ganzen Weg bis zum Rand des Masters zu verlängern. - Nach PDMS auf das Master gegossen wurde, ein zweites Blatt Transparentfolie auf der Oberseite des Silikon-Master und PDMS anzuwenden. Vorsichtig rollen die zweite Transparenzblatt nach unten auf der Oberseite des PDMS / Silikon-Master-Luftblasen zu vermeiden. Überstürz es nicht. PDMS sollte nun gleichmäßig verteilt over-Master.
- Sanft legen Sie eine Gummiplatte auf der Oberseite der Transparenz, durch eine 1/8 "Acrylfolie gefolgt.
- In drei 10 lb Gewichte auf dem Acrylglasplatte. Zunächst werden die Gewichte "schweben". Lassen Sie sie zu regeln und zu stabilisieren, bevor Sie fortfahren.
- Stellen Sie Heizplatte Temperatur auf 70 ° C und Heilung PDMS für 4 Stunden. Lassen Sie für mindestens 1 zusätzliche Stunde abkühlen, bevor Sie zu stören.
- vorsichtig abziehen oberste Blatt Transparentfolie aus dem Wafer, und entfernen Sie die Kanäle mit einer Zange.
- Shop in staubfreien Schale bis zum Gebrauch.
4. Prepping PDMS Mikrokanäle für den Einsatz
- Platz Kanäle den Kopf auf neue, saubere Transparentfolie. Reinigen Sie alle Ports (Abbildung 2b) mit Kreisbewegung mit einer scharfen Zange. Entfernen Sie alle Fragmente von PDMS.
- Saubere Kanäle durch ein Stück Klebeband als Staubtuch verwenden. Das Band auf der Oberfläche der Bank (klebrigen Seite nach oben), und dann Kanal o eingestelltn oben. Drücken Sie auf Kanäle mit runden Ende Zange einen guten Kontakt zu gewährleisten. Entfernen Sie und wiederholen Sie auf beiden Seiten bis zum sichtbaren Verschmutzungen entfernt wird.
- Transfer gereinigt, desinfiziert PDMS Kanäle in ein 50 ml konisches mit 70% EtOH. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden. Entsorgen Sie EtOH und ersetzen mit frischen 70% EtOH. Shop in 70% EtOH bis zum Gebrauch.
- In Gewebekultur Haube und aseptische Techniken, übertragen Sie die PDMS-Kanäle auf eine saubere und sterile Abdeckung aus Glas oder Glasbodenschalen. Setzen Sie den Kanal nach oben und UV-Behandlung bis EtOH verdampft ist.
- Nach dem Trocknen, drehen Sie die PDMS so die Kanäle nach unten in Richtung Abdeckglas konfrontiert sind. Drücken Sie die PDMS-Kanal auf dem Glas nach unten, um eine gute Abdichtung zu machen. Fügen Sie einen Patch von sterilen PDMS zu bedecken / Schließen der Mitte - Port (Port B, 2b). Lassen Sie gründlich zu trocknen, bevor Sie fortfahren.
- Pre-coat das Innere des Kanals mit 10 & mgr; g / ml Kollagen in sterilem Wasser. Zur Beschichtung, legen Sie ein 100 & mgr; l Tröpfchen auf der Spitze eines channel und mit Vakuum ziehen durch. Nach 1 Stunde bei 37 ° C, Übertragungskanäle mit Kollagen-Beschichtungslösung auf einen Kühlschrank gefüllt. Chill für ca. 15 - 30 min.
- Entfernen Sie Kollagen-Beschichtungslösung mit Saugvorrichtung oder pipettieren und Kollagen Vorbereitung beginnen.
5. Collagen Vorbereitung für den Einsatz in Mikrokanälen
- Auf dem Eis, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH-Wert 7,4. Gut mischen, bis sie homogen ist (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.1).
- Verdünnen Sie neutralisierten Kollagen zu den entsprechenden Konzentrationen mit Zellmedien (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.2). Inkubieren für 15 Minuten auf Eis.
- Zur gleichen Zeit, montiert Kühlkanäle auf Eis.
HINWEIS: Das Ziel, alle Komponenten für den Kanal Prozess bei 4 ° C oder unten zu haben. Collagen Nukleation Temperatur und Zeit sind wichtige Parameter zur Polymerisation und kann der Ausgangspunkt für die weitere Optimierung sein, falls erforderlich. - CounT-Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren an der entsprechenden Einsaatdichte zu diesem Zeitpunkt. Zur Vereinfachung der Berechnungen, resuspendieren zu 1-3.000.000 Zellen / ml. (Für weitere Einzelheiten siehe auch Abschnitt 2.1).
- Sobald Zellen gezählt wurden und 15 Minuten vergangen sind, fahren Sie mit Kollagen zu gießen.
6. Pouring Aligned und Random Collagen Mikrokanäle
- Kollagen durch die Kanäle, eingestellt und programmiert werden Vakuumdruck mit einem Inline-Vakuumregler vor dem Zeichnen. Vakuumdruck liefert die Kraft zu induzieren und zu steuern, um die Rate der Kollagenstrom, der den Grad der Ausrichtung bestimmt.
- Für zufällige oder unaligned Matrizen, einen breiten Kanal (3 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 10 mm Hg oder weniger verwenden.
- Für ausgerichteten Matrizen verwenden schmalen Kanal (1 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 60 mm Hg oder höher.
- Entfernen Sie montierten Kanal aus Eis und auf sauberen, keimfreien Oberfläche von Laminar-Flow-hOOD.
- Arbeiten Sie schnell und laden 120-150 ul neutralisierten Kollagen in Port A (Abbildung 2b).
- Zeichne Kollagen durch den Kanal durch einen 25 ml - Pipette mit der Vakuumleitung über den Anschluss c (Abbildung 2b) befestigt platzieren. Zeichnen Sie Kollagen durch in einem einzigen, gleichförmige Bewegung. WICHTIG: Für zufällige oder nicht ausgerichteten Matrizen, Kollagen langsam über den Kanal ziehen (etwa 0,5 bis 1 mm pro Sekunde), und stoppen, sobald das Ende erreicht. Für ausgerichteten Matrizen, zeichnen das Kollagen in schneller, aber darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.
- überschüssiges Kollagen aus der Hafenregion mit p200 Pipetman oder Absauger vorsichtig entfernen.
- Legen Sie sterile PDMS-Patches über beide Anschlüsse A und C. Alle Ports nun abgedeckt werden sollten.
- Nach 2 - 3 ul Zellen (5 - - 10 Tausend Zellen) in das Zentrum Port 3 Minuten, Zentrum PDMS-Patch (Port B) und mit 2 entfernen. Lassen Sie teilweise zu polymerisieren (opak drehen) bei Raumtemperatur für eine weitere 10 bis 15 min.
- nach 10- 15 min, Transfer bis 37 ° C für weitere 15 - 30 min Polymerisation zu beenden. Entfernen PDMS Abdeckungen und Medien fügen den Kanal komplett und Kulturzellen abzudecken, wie sie benötigt werden. Zellen können durch Entfernen einer ml alten Medien zugeführt werden, und mit einem ml der neuen Medien zu ersetzen.
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Representative Results
Während 3D-Assays können innerhalb der gleichen Steifigkeit von Kollagengel, Variieren der Gelsteifheit erfolgen kann verwendet werden, um zu bestimmen, wie die Zellen auf mechanische Veränderungen in ihrer zellulären Mikroumgebung reagiert. Eine steife Kollagen Hydrogel wird als Gel definiert, wo die eingebetteten Zellen nicht in der Lage sind, um die umgebende Kollagen lokal zusammenzuziehen. Die intrinsische Kontraktilität von verschiedenen Zelltypen ist einzigartig, und so ist es am besten mit einem einfachen Kontraktilität Kurve zu beginnen, um die Kollagen-Konzentration zu etablieren, die als konform und steif gefühlt werden wird.
Beginnen Sie mit der Zellzahl konstant gehalten wird und die Konzentration des Kollagen-Gel zu erhöhen. Die Steifigkeit des Gels wird maßstäblich exponentiell mit der Konzentration, wie zuvor 10,20 gezeigt. Ein repräsentatives Beispiel eines Kontraktionsassay ist in Abbildung 1 dargestellt. Hier 50.000 4T1 Zellen eingebettet in eithera 2 mg / ml oder 3,5 mg / ml Kollagen-Gel für 5 Tage. Die 4T1 - Zelllinie ist ein hochKontraktions, metastasierendem Krebs Linie, sondern ist nur in der Lage die hohe Dichte Gel zur Kontraktion um etwa 10% (Abbildung 1a, c). Das niedrige Niveau der Kontraktion ist typisch für ein steifes Gel-Klassifikation. Vergleichbare niedriger Dichte Gele (2 mg / ml, 1b, c) 57% schrumpfte (n = 4) während der gleichen Zeitrahmen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Menge an Kollagen Ligand Erhöhung kann Auswirkungen auf Zellsignalwege, also ein zweites Mittel, um die Steifigkeit zu variieren, um die Kollagen-Konzentration konstant zu halten und zu vergleichen, Gele, die zurückgehalten werden (steif) durch an der Unterseite angebracht gelassen zu werden von die Schale oder Kontraktions (konform), weil sie in dem Zellmedium zu schweben frei veröffentlicht wurden. Dies kann als eine gute Kontrolle dienen, um zu bestimmen, ob Änderungen in der zellulären Signalgebung resultieren aus erhöhten Kollagen-Liganden oder die Steifigkeit der Matrix.
Sobald Beherrschung von Zellen in 3D-Matrices Einbettung erreicht wird, können Assays modifiziert werden, um die Organisation und Orientierung der Kollagenfasern zu verändern. Dies wird durch die Verwendung von PDMS mikrofluidischen Kanälen (Abbildung 2) erreicht. Für die Zwecke dieses Manuskript, zwei ähnliche Konformationen verwendet wurden, einen schmalen und einen breiten Kanal, mit drei Öffnungen oder Ports (Abbildung 2b). In einem typischen Experiment, um die zelluläre Antwort auf zufällig zu bestimmen, im Vergleich zu Matrizen ausgerichtet wird unpolymerisierten Kollagen durch den mikrofluidischen Kanal vom Anschluss A zum Anschluss C gezeichnet mit Zellen Port B. Der Grad der Ausrichtung Kollagen hinzugefügt wird durch die Rate der Kollagen moduliert wird fließen, so dass höhere Kollagen Flussraten eine bessere Ausrichtung ergeben. Die Verwendung von schmaleren Kanälen mit höherer gekoppeltUnterdrücken verbessert die Ausrichtung des Kollagennetzwerk, während ein breiter Kanal in Verbindung mit niedrigen Vakuumdrücken verwendet Zufallsmatrizen erzeugt. Die Organisation des fibrillären Netzwerk kann durch Erzeugung der zweiten Harmonischen dargestellt werden, wie es in den repräsentativen Bildern (Figur 2c, d) gezeigt. In diesen Bildern, die Kollagenfasern (durch die Pfeile angedeutet und pseudocolored in lila) ausrichten konsequenter mit der Achse des Kollagen - Strömung in den engen Kanälen (Abbildung 2d). Die Kollagenfasern in breite Kanäle haben eine Vielzahl von Orientierungen und haben eine mehr zufällige Verteilung (Abbildung 2c).
Der Unterschied zwischen breiten und schmalen Kanäle discernable für das menschliche Auge, aber auch über die Software speziell für die Faseranalyse entwickelt analysiert werden. CT-FIRE, ein Open-Source und frei verfügbare Software, nutzt einen curvelet-basierten Algorithmus zur Vorverarbeitung, gefolgt vonein Faserextraktionsalgorithmus Faserwinkel, Dicke, Länge und Geradheit 21 zu quantifizieren. Für jede Bedingung mehr als 500 Bilder wurden von verschiedenen Stellen innerhalb der Kanäle zufällig abgetastet werden, und mehr als 125.000 Fasern wurden extrahiert und analysiert durch CT-FIRE. Die anschließende Faserwinkel Histogramms erzeugt für den engen Kanälen (Figur 2f) zeigt eine deutliche Anreicherung von Fasern parallel zur Strömungsrichtung ausgerichtet ist . Im Gegensatz dazu haben breite Kanäle eine äquivalente Faserwinkelverteilung (Figur 2e) , die mit einer Zufallsmatrix übereinstimmt.
Wichtig ist, dass die Verwendung von mikrofluidischen Vorrichtungen, als eine Technik, die Organisation und Orientierung der Kollagenfasern zu steuern, ermöglicht die Beurteilung der verschiedenen zellulären Reaktionen auf veränderte Bedingungen Matrix. Zum Beispiel Sung et al. festgestellt, dass die Lebensfähigkeit von menschlichen Brust fibrobasts auf Kollagenfaser abhängig ist.15 Darüber hinaus neuere Arbeiten aus unserem Labor zeigen , dass Brustkrebszellen mehr hartnäckig an ausgerichteten Kollagenfasern im Vergleich zu zufälligen Kollagenmatrizes migrieren. 3 Diese Ergebnisse helfen, besser die Rolle der Mikroumgebung im Rahmen der Brust Biologie und Brustkrebs definieren. Bewegen der Fähigkeit, nach vorn, um präzise die zelluläre Mikroumgebung 3D-Steuerung wird für die weitere Untersuchung von wichtigen zellulären Reaktionen im Rahmen vieler verschiedener Krankheitszustände zu ermöglichen.
Abbildung 1. 3D - Kollagen - Gel für Messzelle Kontraktilität und zellulären Reaktionen auf ECM Stiffness. 4T1 Zellen in beide plattiert (A) 3,5 mg / ml und (B) 2 mg / ml Kollagen - Gelen und erlaubt für 5 Tage wachsen. Im Laufe der Zeit, das Kollagengel (graue Flächeinnerhalb gepunktete Linie) wird schrumpfen und der Durchmesser gemessen und quantifiziert in (c, Student-t-Test, Fehlerbalken +/- SD). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Erzeugung von Zufalls und Aligned Kollagen - Matrices Mit PDMS Mikrokanäle. Ein Sechs - Zoll - Siliziumwafer (a) wurde als Vorlage verwendet sowohl für breite und schmale PDMS Mikrokanäle (b). Identische Kollagenkonzentrationen durch beide Typen von Kanälen gezogen wurden, und Einzelfasern (Pfeilspitzen, c, d) mit der Strömungsrichtung (Pfeile) in engen Mikro ausrichten (D). Breite Mikrokanäle ergab mehr Zufallsmatrizen. Fiber angles in Bezug auf die Unterseite des Bildes wurden in (e) und (f) gezählt und angezeigt. Maßstabsbalken = 26 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
3D-Kollagen-Gele sind eine wertvolle Ergänzung zu unserer Toolbox zu verstehen, wie Zellen auf ihre lokalen Mikroumgebung interpretieren und darauf zu reagieren. Dieses Manuskript hat ein sehr einfaches Protokoll vorgesehen Zellen in einer 3D-Kollagen-Matrix einbetten und reproduzierbar Matrizen erzeugen mit zufälligen oder Kollagenfasern ausgerichtet sind. Beide Protokolle arbeiten, wie anpassungsfähig Plattformen, auf denen verschiedene Kollagen-Isoformen, Vernetzern oder anderen Matrixproteinen möglicherweise zum Zeitpunkt der Polymerisation zugegeben werden. Es ist auch leicht, die Plattformen zu ändern unterschiedliche Fristigkeit und Endpunkte für die Genexpression und Proteinproduktion zu beurteilen. Imaging, Bewertung Protein und RNA-Spiegel und Lese metabolischen Profile sind alle sehr kompatibel mit diesen 3D-Techniken.
Wie wichtig bei allen Techniken ist, ist es wichtig, die Qualität des Gels und Assays zu beurteilen. Ein Zeichen für eine gute Qualität Kollagen-Gel ist eine, die eine manuelle Manipulation verarbeiten kann. Beispielsweise eine 1 ml [1 mg / ml] Kollagen-Gel gegossen in eine sechs-Well-Platte leicht mit einer Zange und manipuliert aufgenommen werden sollte. Wenn das Gel Risse oder Bruchstücke, die Qualität des Gels suboptimal, und Schritte müssen unternommen werden, um die Kollagen-Polymerisation zu verbessern. Temperatur und pH-Wert sind die wichtigsten Parameter, die für eine gute Faserbildung und Gelieren. Beginnen Sie die Fehlersuche, indem sie sicher, dass alle Komponenten auf Eis gehalten werden, bis sie bereit zum Gelieren auftritt. Es ist auch sehr wichtig, um sicherzustellen, dass die Neutralisationspuffer und Kollagen-Stammlösung gründlich gemischt werden. Als nächstes überprüfen, dass der pH-Wert des Neutralisierungspuffer bei pH 7,4 ist. Eine HEPES-gepufferte PBS empfohlen, da sie sehr kompatibel zu Gewebekultur ist, hat eine breite Pufferbereich und Vorratslösungen sind in der Regel bei 4 ° C für lange Zeiträume sehr stabil. Es hat auch den zusätzlichen Vorteil der längeren, gekrümmten Fasern erzeugen , die 15 mit dem physiologischen Zustand ähnlicher sind. NaOH ist ein weiterer Commonly verwendeten Neutralisierungslösung, muss aber titriert enger werden. Es scheint auch zur Herstellung von kürzeren, dickeren Fasern 15 , die die Wirkung haben. Unabhängig davon sollten bei einem pH-Wert von 7,4 sein, der pH-Wert des neutralisierten Collagen. Wenn alle diese Bedingungen erfüllt werden, und die Integrität der Gele ist nach wie vor nicht zufriedenstellend ist, dann liegt das Problem mit dem Lager Kollagenlösung. Obwohl die Aktie Kollagenlösung ein börsennotiertes Haltbarkeit von 6 Monaten bei 4 ° C hat, haben wir festgestellt, dass es in der Regel kürzer ist als kommerzielle Quellen behaupten, wenn für die 3D-Gele verwendet. Entsorgen Sie die alte Flasche, und Auftrag von einer neuen Charge. Es ist nicht ungewöhnlich, dass die Qualität von Kollagen vom Hersteller deutlich von Charge zu Charge variieren.
Zusätzlich Qualität Kollagengelen zu identifizieren, ist es auch wichtig, die Schritte zu identifizieren, die für die Erzeugung von guten Ausrichtung innerhalb des PDMS Mikrokanal kritisch sind. Das zugrundeliegende Prinzip dieser Technik ist, dass die Rate der collagen Strömung durch den Mikrokanal induziert anschließend Filament Ausrichtung. Daher ist der wichtigste Schritt in den Grad der Faserausrichtung zu steuern richtige Modulation des Vakuumdrucks. Für zufällige Kollagen Ausrichtung in einem Mikrokanal, muss der Unterdruck niedrig sein, und das Kollagen müssen langsam den Kanal fließen. Wenn das Kollagen zu schnell fließt, beginnen die Fasern auszurichten. Ein breiter Kanal macht dieser Satz einfacher. Im Gegensatz dazu für eine gute Kollagen Ausrichtung, müssen höhere Unterdrücke verwendet werden und die Kollagenlösung muß schneller durchgezogen. Ein zweiter kritischer Schritt in der Erzeugung von ausgerichteten Matrizen ist die Temperatur. Es ist sehr wichtig, um sicherzustellen, dass alle Komponenten und Lösungen auf Eis gekühlt werden, bevor sie verwendet werden. Wenn die Kanäle nicht vor gekühlt werden das Kollagen in den Kanälen zu verwenden, polymerisieren zu schnell und wird in dünner kleineren Fasern führen. Wenn das neutralisierte Kollagen bei 4 ° C gekühlt wird, und nicht auf dem Eis, das enhanced Nukleierung wird zu größeren Faserdurchmessern führen, die schwieriger durch die Strömung auszurichten. Es ist auch wichtig, dass der Mikrokanal selbst zu kühlen. Ohne vorherige Abkühlung, wärmt das geringe Volumen von Kollagen sehr schnell schlechte Ergebnisse ergibt.
Die Kollagen-Mikrokanäle sind eine sehr nützliche Technik, aber es gibt gewisse Beschränkungen. Zum einen ist die Ausrichtung in einer strömungsinduzierten Mikrokanal nie perfekt, und wird nie eine spannungsinduzierte Ausrichtungstechnik entsprechen. Es wird immer einige Fasern senkrecht zur Strömungsrichtung ausgerichtet sein, aber die Reproduzierbarkeit, Anpassungsfähigkeit und Einfachheit der Verwendung überwiegen die kleinen Variationen in Ausrichtung innerhalb des Kanals. Noch wichtiger ist , gezeigt wurden Zellen effektiv in diesen Kanälen 3,15 mit hartnäckiger Migration kleine Änderungen in der Ausrichtung und reagieren zu erfassen. Die Zellen werden auch die Ausrichtung des Kanals zu verbessern, wie ihre Anzahl zu erhöhen, und sie beginnen zu migrieren. Wenn eine größere Ausrichtung iist erforderlich, können die Mikrokanäle PDMS leicht schmaleren Abmessungen modifiziert werden, oder kleine Einschnürungen zu haben, um die Ausrichtung zu verbessern. Beide haben sich als wirksam erwiesen, aber haben andere damit verbundenen Handels-offs 16. Eine weitere Einschränkung für die Mikrokanal-Technik besteht darin, dass die PDMS-Kanal wenig Permeabilität zu Drogen oder Fluoreszenzfarbstoffen hat. Dies bedeutet, dass diese Verbindungen den Kanal von den Häfen zu diffundieren nach unten müssen, die überraschend langsam, und Schwierigkeiten beim Auswaschen Behandlungen darstellen.
Zwar gibt es gewisse Einschränkungen dieser Mikrokanal-Plattform sind, ist es eine Reihe von Vorteilen gegenüber bestehenden Techniken bieten. Es ist experimentell zugänglich , da es nicht sperrige Instrumente 3,13 oder kleine Populationen von Zellen erfordert Ausrichtung zu erzeugen. Es erfordert auch keine exogenen magnetische Kügelchen 13,14 , die autofluoreszenten zu neigen und das Kollagen - Netzwerk künstlich vernetzen können. Das Kollagen ist Mikrokanalauch einfach kostengünstiger und wirtschaftlicher. Zusätzlich zu den aktuellen Vorteile, es hat auch zahlreiche Vorteile, die in zukünftigen Anwendungen genutzt werden können. Zum einen kann die Kollagenmikrokanal in nahezu jeder Konfiguration oder Experiment entworfen oder modifiziert werden. Erweiterte Konstruktionen ermöglichen die Kanäle Hohl Kollagen Rohre oder 3D - Strukturen zu schaffen , 22 die Architektur vereinfacht Organe oder Tumore zu imitieren. Darüber hinaus kann die andere Kanäle als PDMS aus Materialien hergestellt sein. Dies könnte möglicherweise unterschiedliche mechanische Eigenschaften zu den eingebetteten Kollagen Netzwerke oder Matrizen vermitteln. Schließlich könnte die geringe Menge an Reagenzien für diesen Assay verwendet, auch für kleinere Hochdurchsatz-Bildschirme es attraktiv und wirtschaftlich zu machen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Die Autoren möchten Zuschuss Zahlen UO1CA143069 anzuerkennen, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 und T32-GM008692-18 diese Arbeit für die Finanzierung. Wir erkennen auch Jeremy Bredfelt und Yuming Liu von Loci für die Entwicklung und Unterstützung bei der CT-FIRE-Analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
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