Summary
Collageen is een essentieel onderdeel van de ECM en biedt essentiële signalen verscheidene cellulaire processen gaande van migratie differentiatie en proliferatie. Er wordt hier een protocol voor het inbedden van cellen in 3D collageen hydrogels, en een meer geavanceerde techniek voor het genereren van gerandomiseerde of uitgelijnd collageen matrices gebruikt PDMS microkanalen.
Protocol
1. neutralisering, verdunning en polymerisatie van Collageen Oplossingen voor 3D-onderzoek en Cellular Contractie Testen
- Op ijs in steriele weefselkweek kap, neutraliseren collageen (1: 1) met steriele, ijskoude 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in een 15 ml conische buis. Meng goed met plastic pipet totdat oplossing homogeen is en het mengen van de wervelingen zijn niet meer zichtbaar. Wees voorzichtig luchtbellen te introduceren tijdens het mengproces. Bewaar kort op ijs.
- Verdun geneutraliseerd collageen om de geschikte concentratie met celmedium (zoals RPMI, DMEM, etc.).
- Om de hoeveelheid geneutraliseerde collageen nodig is om make-up de gewenste collageen concentratie te berekenen, gebruikt u de vergelijking N = (D * V) / (S / 2), waarbij N hoeveelheid geneutraliseerde collageen nodig is, D de gewenste collageen concentratie, V het eindvolume van de gewenste collageenconcentratie en S tHij beginvoorraad collageen concentratie.
- Breng de hoeveelheid geneutraliseerde collageen volume door toevoegen van een cel en cel mediaoplossing. Meng goed en op te slaan op het ijs pas klaar om te werpen.
- Voorbeeld: Voor een 2 mg / ml gel in een 1 ml gel volume (typisch volume voor een gel gegoten in 6 putjes of 50 mm glazen onderste schaal), eerst vermenigvuldig de gewenste concentratie (2 mg / ml) van het gewenste eindvolume (1 ml). Neem dit nummer (2 mg) en verdeel het met de helft van de voorraad concentratie worden vermeld op de fles (9,49 mg / ml). In dit geval, 0,42 ml van de geneutraliseerde collageen verdund met 0,58 ml medium / celmengsel.
- Pipet de ijskoude collageen / cel / Media mengsel in hetzij een niet-weefselkweek behandelde plaat met 6 putjes of 50 mm glazen onderste schaal. Gebruik pipet tip om gelijkmatig verspreid de oplossing.
Opmerking: Het is belangrijk om een niet-weefselkweek behandelde plaat gebruikt om de aanhechting of groei van de cellen buiten de collag minimaliserenen gel. - Laten polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 10-15 min. De gels moet ondoorzichtige draaien bij polymerisatie.
- Nadat het ondoorzichtig is geworden, zet bord of schaal tot 37 ° C voor een extra 45 - 60 min om de polymerisatie te voltooien.
- Na 45 - 60 minuten, voeg 2-3 ml van de media en gels los van zijden van de put door het uitvoeren van een p200 pipet tip rond perimeter van goed of gerecht. Swirl schotel voorzichtig aan de gel vrij te geven. De collageengel worden zwevend in media.
2. Western Blotting, Cell Morphogenesis en Gel Gontractility Assay
- Om eiwitniveaus, morfologie of cellulaire contractiliteit toetsen aan stijfheid ECM, eerst gieten collageen gels volgens 1,1-1,6 geënt met cellen voor 7-10 dagen assay. Bepaal elke cellijn seeding rate empirisch afhankelijk van de groeisnelheid en confluentie. Voor een 10 daagse test kan de zaaidichtheid variëren van 20.000 - 100.000 cellen / gel.
- Metencel contractiliteit, meet de diameter gel met behulp van een liniaal of een camera elke 24 uur of op het geschikte tijdsinterval.
Noot: Bovendien kunnen overeenkomstige afbeeldingen vanuit een microscoop worden onderzocht op morfologische karakteristieke eigenschappen van de cellijn geënt in de gel, zoals acini structuren, epitheliale buisjes, cellulaire uitsteeksels en lameliapodia. - Om eiwitten te beoordelen, lyseren de gels in RIPA buffer en werkwijze voor Western blot analyse van eiwitten van belang zoals is beschreven in Wozniak et al. 17 en Gallagher et al. 18.
- Belangrijk: In vergelijkingen van contractiliteit tussen cellijnen normaliseren contractiliteit totale DNA, die kan worden afgeleid uit de gels zoals beschreven door Lui et al 19, of een onveranderlijke, schoonmaak eiwit (histonen, GAPDH, etc.) door Western. blotanalyse, zoals beschreven in Wozniak et al. 17 en Gallagher et al. 18. Als het tellen van cellen in de gel met behulp van een hemocytometer, zorg ervoor om het aantal cellen te normaliseren tot de totale gel gebied als de aanbestedende gel zal zich concentreren cellen.
- Feed gels elke 3-4 dagen door het verwijderen van 1 ml medium en te vervangen door 1 ml vers medium. Zorg ervoor gels voeren na de meting de toevoeging van vers medium / serum genomen zal een piek in contractiliteit veroorzaken.
3. Productie van PDMS Microkanalen voor collageenvezels Alignment
Opmerking: Om uitgelijnd collageen matrices te genereren, een mal voor PDMS microkanalen (Figuur 2A) vereist een SU-8 silicium meester gemaakt via soft-lithografie 15.
- Om PDMS kanalen te maken, meng PDMS grondig in een beschikbare kop met een ambachtelijke stok. Voor een 6 inch siliconen meester, meng 20 g elastomeer basis met 2 g verharder.
- De gas de PDMS mengsel door het plaatsen van de wegwerpbare beker in een vacuümkamer onder een vacuümdruk van550 mm Hg. De gas-1 - 1,5 uur.
- Terwijl de-gasvorming het PDMS, de voorbereiding van de siliconen meester voor het gieten. Bereid door het plaatsen van een schone lei aan transparantie film op een kookplaat, gevolgd door de siliconen meester. Zorg ervoor dat het microkanaal mal naar boven gericht.
LET OP: Tijdens het PDMS gieten en uitharden, zal de siliconen meester worden ingeklemd tussen twee vellen transparanten. - Na 1-1,5 uur, verwijder de-de vergaste PDMS van de vacuümkamer, en langzaam giet over de siliconen meester.
BELANGRIJK: Vermijd luchtbellen. Ga verder te gieten in het centrum van de kapitein, en laat de zwaartekracht om het gelijkmatig verspreid.
LET OP: De PDMS daling hoeft niet helemaal uit te breiden tot de rand van de meester. - Na PDMS heeft op de master gegoten, breng dan een tweede vel transparanten bovenop de siliconen meester en PDMS. Voorzichtig rollen de tweede transparant vel naar beneden op de top van de PDMS / siliconen meester om luchtbellen te voorkomen. Haast je niet. PDMS moet nu gelijkmatig verdeeld over meester.
- Plaats voorzichtig een rubber op de top van de transparantie, gevolgd door een 1/8 "acryl plaat.
- Voeg drie 10 lb gewichten op de bovenkant van de acryl plaat. Aanvankelijk zal de gewichten "zweven". Hen in staat stellen om zich te vestigen en te stabiliseren alvorens verder te gaan.
- Stel verwarmingsplaat temperatuur 70 ° C en genezing PDMS 4 uur. Laat afkoelen minimaal nog 1 uur voor storen.
- Verwijder voorzichtig top van elk transparant uit de wafer, en de kanalen te verwijderen met een pincet.
- Winkel in stofvrije gerecht pas klaar voor gebruik.
4. Prepping PDMS Microkanalen voor gebruik
- Plaats kanalen ondersteboven op nieuwe, schone transparanten. Reinig alle poorten (Figuur 2b) met cirkelvormige beweging met een scherpe tang. Verwijder alle fragmenten van PDMS.
- Clean kanalen door gebruik te maken van een stuk van de verpakking tape als een tack doek. Toepassen tape aan de oppervlakte van de bank (kleverige kant naar boven), en stel kanaal on top. Druk naar beneden op kanalen met ronde uiteinde van een tang om goed contact te waarborgen. Verwijder en herhaal aan beide kanten tot zichtbare puin is verwijderd.
- Transfer schoongemaakt, klaargestoomd PDMS kanalen in een 50 ml conische met 70% EtOH. Vortex op maximale snelheid gedurende 30 sec. Gooi EtOH en te vervangen door vers 70% EtOH. Store in 70% EtOH totdat klaar voor gebruik.
- In weefselkweek kap en met behulp van aseptische technieken, de overdracht van de PDMS kanalen om een schone en steriele dekking van glas of glazen bodem gerechten. Zet het kanaal naar boven en UV behandelen totdat EtOH is verdampt.
- Eenmaal droog is, draait u de PDMS, zodat de kanalen naar beneden wijzen in de richting van dekglaasje. Druk op de PDMS kanaal naar beneden op het glas om een goede afdichting te maken. Voeg een patch van steriel PDMS te dekken / sluiten het centrum (poort B, Figuur 2b). Goed laten drogen alvorens verder te gaan.
- Voorbekleding de binnenzijde van het kanaal met 10 ug / ml collageen in steriel water. Bekleden, plaats een 100 ul druppel op de top van een channel, en trekken door met vacuüm. Na 1 uur bij 37 ° C, overdrachtskanalen gevuld met collageen bekledingsoplossing een koelkast. Chill gedurende ongeveer 15-30 min.
- Verwijderen collageen bekledingsoplossing met zuigpomp of pipet, en beginnen collageenpreparaat.
5. Collageen Voorbereidingen voor gebruik in Microkanalen
- Op ijs, te neutraliseren collageen (1: 1) met ijskoude 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4. Meng grondig tot homogeen (Voor meer details, zie paragraaf 1.1).
- Verdun geneutraliseerde collageen naar de juiste concentraties met mobiele media (Voor meer details, zie paragraaf 1.2). Incubeer gedurende 15 min op ijs.
- Tegelijkertijd, chill gemonteerd kanalen op ijs.
Opmerking: Het doel is om alle componenten voor het kanaal proces bij 4 ° C of lager. Collageen kiemvormingstemperatuur en tijd zijn belangrijke parameters om de polymerisatiewerkwijze en kan het uitgangspunt voor verdere optimalisatie, indien nodig. - CounT-cellen met een hemacytometer en resuspendeer de juiste zaaidichtheid op dit moment. Gemakshalve berekeningen mengen met 1-3.000.000 cellen / ml. (Voor meer details, zie ook paragraaf 2.1).
- Zodra cellen zijn geteld en 15 minuten zijn verstreken, gaat u verder met collageen gieten.
6. Gieten uitgelijnd en Random Collageen Microkanalen
- Alvorens collageen via kanalen, aan te passen en stel onderdruk met een inline vacuüm regulator. Onderdruk levert de kracht voor inductie en regelen de snelheid van collageen stroom, die de mate van overeenkomst bepaalt.
- Voor willekeurige of niet-gebonden matrices, gebruik van een breed kanaal (3 mm breed x 200 micrometer lang) met een vacuüm druk van 10 mm Hg of minder.
- Voor uitgelijnd matrices Gebruik smal kanaal (1 mm breed x 200 micrometer lang) met een vacuüm druk van 60 mm Hg of hoger.
- Verwijder gemonteerd kanaal uit ijs en te plaatsen op schoon, ontsmet oppervlak van laminaire stroming hood.
- Werk snel en laad 120-150 ul van geneutraliseerd collageen in de haven A (Figuur 2b).
- Trek collageen door het kanaal door het plaatsen van een 25 ml pipet verbonden aan de vacuümleiding via poort c (Figuur 2b). Trek collageen door middel van in één uniforme beweging. BELANGRIJK: Voor willekeurige of niet-gebonden matrices, trek collageen langzaam over kanaal (ongeveer 0,5-1 mm per seconde), en stoppen zodra het einde bereikt. Voor uitgelijnd matrices, trek het collageen in meer sneller, maar zorg om luchtbellen te voorkomen.
- Haal overtollige collageen uit de havenregio met P200 Pipetman of afzuiger.
- Plaats steriel PDMS vlekken op beide poorten A en C. Alle poorten moet nu worden gedekt.
- Na 2-3 minuten, verwijder centrum PDMS patch (poort B) en voeg 2-3 pi van de cellen (5-10.000 cellen) in het centrum van de haven. Laat gedeeltelijk polymeriseren (ondoorzichtig) bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 10 - 15 min.
- na 10- 15 min, transfer naar 37 ° C nog 15 - 30 minuten om polymerisatie te voltooien. Verwijder PDMS covers en media toe te voegen aan volledig te bedekken het kanaal en kweekcellen als dat nodig is. Cellen kunnen worden gevoed door het verwijderen van een oude ml media en vervangen door een nieuwe ml media.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl 3D assays kunnen worden uitgevoerd in dezelfde stijfheid van collageengel, variëren de gel stijfheid kan worden gebruikt om te bepalen hoe cellen reageren op mechanische veranderingen in de cellulaire micro-omgeving. Een stijve collageen hydrogel wordt gedefinieerd als een gel waarin de ingebedde cellen niet in staat ter plaatse aan de omliggende collageen. De intrinsieke contractiliteit van verschillende celtypen uniek, en dus is het het beste om te beginnen met een eenvoudige contractiliteit bocht naar collageen concentratie die wordt waargenomen als conform en stijf vast.
Eerst met het aantal cellen constant en verhogen van de concentratie van de collageengel. De stijfheid van de gel exponentieel schaalbaar concentratie, zoals eerder getoond 10,20. Een representatief voorbeeld van een contractiliteit assay is weergegeven in figuur 1. Hier worden 50.000 4T1 cellen ingebed in eithera 2 mg / ml of 3,5 mg / ml collageen gel voor 5 dagen. De 4T1-cellijn is een zeer contractiele, metastatische kanker lijn, maar is alleen in staat om de hoge dichtheid gel krimp van ongeveer 10% (figuur 1a, c). Deze geringe contractie is typisch voor een stijve gel classificatie. De vergelijkbare lage dichtheid gels (2 mg / ml, figuur 1b, c) worden gecontracteerd 57% (n = 4) tijdens dezelfde periode. Het is belangrijk op te merken dat het verhogen van de hoeveelheid collageen ligand invloed kan signaaltransductie wegen, dus een tweede middel om de stijfheid variëren, is het collageen concentratie constant te houden en te vergelijken gels die worden tegengehouden (stijve) door zich hechtmiddelen aan de onderzijde van het gerecht of contractiele (compliant), omdat ze zijn vrijgegeven om vrij zweven in de cel medium. Dit kan dienen als een goede controle om te bepalen of veranderingen in de cellulaire signalering van een toegenomen collageen ligand of de stijfheid van de matrix.
Zodra beheersing van inbedding cellen in 3D matrices wordt bereikt, kunnen assays worden aangepast aan de organisatie en oriëntatie van de collageenvezels veranderen. Dit wordt bereikt door het gebruik van PDMS microfluïdische kanalen (figuur 2). Ten behoeve van dit manuscript werden twee soortgelijke conformaties gebruikt, een smalle en brede kanalen, met 3 openingen of poorten (figuur 2b). In een typisch experiment om de cellulaire respons op willekeurige opzichte uitgelijnd matrices te bepalen, wordt gepolymeriseerd collageen getrokken door de microfluïdische kanaal van poort A naar poort C met cellen toegevoegd aan poort B. De mate van aanpassing collageen wordt gemoduleerd door de snelheid van collageen stromen zodanig dat hogere collageen debieten op een betere afstemming. Het gebruik van smallere kanalen combinatie met hogerevacuümdrukken verbetert de uitlijning van het collageennetwerk, terwijl een bredere kanaal in combinatie met lage druk vacuüm genereert willekeurige matrices. De organisatie van het vezelachtige netwerk kan worden gevisualiseerd door frequentieverdubbeling, zoals getoond in representatieve beelden (figuur 2c, d). In deze beelden, de collageenvezels (aangegeven door de pijlpunten pseudocolored in paars) uitgelijnd consistenter met de as van collageen stroming in de nauwe kanalen (figuur 2d). De collageenvezels in brede kanalen verschillende oriëntaties, en hebben een meer willekeurige verdeling (figuur 2c).
Het verschil tussen brede en smalle kanalen waarneembaar voor het menselijk oog, maar kan ook softwarematig specifiek voor vezelanalyse geanalyseerd. CT-FIRE, een open source en vrij beschikbare software, maakt gebruik van een-curvelet gebaseerde algoritme voor pre-processing, gevolgd dooreen vezel extractie algoritme vezelhoek, dikte, lengte en rechtheid 21 kwantificeren. Voor elke conditie werden meer dan 500 beelden willekeurig bemonsterd uit verschillende locaties in de kanalen en meer dan 125.000 vezels werden geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van CT-FIRE. De daaropvolgende vezelhoek histogram gegenereerd voor de smalle kanalen (figuur 2f) toont een duidelijke verrijking vezels evenwijdig aan de stromingsrichting. Daarentegen brede kanalen hebben een equivalente vezel lichtverdeling (figuur 2e) die overeenkomt met een willekeurige matrix.
Belangrijk is dat het gebruik van microfluïdische inrichtingen, als een techniek om de opzet en inrichting van collageenvezels regelen, maakt de beoordeling van verschillende cellulaire reacties op veranderde omstandigheden matrix. Bijvoorbeeld Sung et al. bepaald dat de levensvatbaarheid van menselijke mammaire fibrobasts afhankelijk van collageenvezels.15 Bovendien recent werk in ons laboratorium aangetoond dat borstcarcinoomcellen migreren meer aanhoudend op lijn collageenvezels vergelijking met willekeurige collageen matrices. 3 Deze resultaten helpen om de rol van de micro-omgeving binnen het kader van de borstklier biologie en borstkanker beter te definiëren. In de toekomst de mogelijkheid om nauwkeurig te regelen 3D cellulaire micro-omgeving zal voor verdere onderzoeken belangrijke cellulaire reacties in de context van verschillende ziektetoestanden.
Figuur 1. 3D Collageen Gel voor meetcel Contractiliteit en cellulaire reacties op ECM stijfheid. 4T1 cellen werden uitgeplaat in beide (A) 3,5 mg / ml en (B) 2 mg / ml collageen gels en kunnen groeien voor 5 dagen. Op termijn de collageengel (grijs gebiedbinnen stippellijn) zal krimpen en de diameter wordt gemeten en gekwantificeerd (c, t-toets, error bars +/- SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. genereren van willekeurige en Aligned Collageen matrices gebruiken PDMS Microkanalen. Een zes inch siliciumwafel (a) werd gebruikt als een matrijs voor zowel brede en smalle PDMS microkanalen (b). Identieke collageen concentraties werden getrokken door beide kanalen en individuele vezels (pijlpunten, c, d), uitgelijnd met de stromingsrichting (pijl) in kleine microkanalen (D). Wide microkanalen leverde meer willekeurige matrices. fiber angles ten opzichte van de onderkant van het beeld werden geteld en weergegeven in (e) en (f). Schaal bar = 26 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D collageen gels zijn een waardevolle aanvulling op onze gereedschapskist om te begrijpen hoe cellen interpreteren en te reageren op de lokale micro-omgeving. Dit manuscript een basisprotocol bedoeld inbedden van cellen in een 3D collageenmatrix en reproduceerbaar produceren matrices met willekeurige of uitgelijnd collageenvezels. Beide protocollen werken als flexibele platforms waarbij verschillende isovormen collageen, verknopingsmiddelen of andere matrixeiwitten mogelijk bij de polymerisatie worden toegevoegd. Het is ook gemakkelijk om de platformen te wijzigen om verschillende tijdsbestekken en eindpunten voor genexpressie en eiwitproductie beoordelen. Imaging, het beoordelen van eiwitten en RNA-spiegels, en het lezen van metabole profielen zijn allemaal erg compatibel is met deze 3D-technieken.
Zoals is belangrijk bij alle technieken, is het belangrijk om de kwaliteit van het gel en de test te evalueren. Een teken van een goede kwaliteit collageengel is die handmatige manipulatie aankan. Bijvoorbeeld, een 1 ml [1 mg / ml] Collageengel uitgegoten in een zes puts plaat worden gemakkelijk met een tang geplukt en gemanipuleerd. Als de gel scheuren of fragmenten, de kwaliteit van de gel niet optimaal zijn, en stappen moeten worden genomen om de collageen polymerisatie te verbeteren. Temperatuur en de pH zijn de belangrijkste parameters die nodig zijn voor een goede vorming en het geleren vezels. Beginnen met het oplossen van problemen proces zorgt ervoor dat alle componenten zijn op ijs bewaard totdat klaar voor gelering optreden. Het is ook heel belangrijk om ervoor te zorgen dat de neutralisatie buffer en collageen stamoplossing worden grondig gemengd. Vervolgens controleert u of de pH van de neutralisatie buffer bij pH 7,4. Een HEPES gebufferde PBS aanbevolen omdat het erg compatibel weefselkweek, heeft een breed scala buffering en voorraadoplossingen meestal zeer stabiel bij 4 ° C te zijn gedurende lange perioden. Het heeft ook het extra voordeel van het produceren van langere en gebogen vezels die meer lijkt op de fysiologische toestand 15 zijn. NaOH is een andere commolleen gebruikt neutraliseren oplossing, maar moet nauwer worden getitreerd. Ook blijkt het effect van het produceren kortere, dikkere vezels 15 hebben. Ongeacht dient de pH van de geneutraliseerde collageen bij een pH van 7,4. Als al deze voorwaarden wordt voldaan, en de integriteit van de gels is nog steeds niet bevredigend is, dan is het probleem ligt bij de voorraad collageen oplossing. Hoewel de voorraad collageen oplossing een genoteerde houdbaarheid van 6 maanden bij 4 ° C, hebben wij gevonden dat het in het algemeen korter dan commerciële bronnen krijgen wanneer gebruikt voor 3D gels. Gooi de oude fles, en de bestelling van een nieuwe partij. Het is niet ongebruikelijk dat de kwaliteit van collageen van de fabrikant aanzienlijk verschillen van partij tot partij.
Naast het identificeren kwaliteit collageen gelen, is het ook belangrijk om de stappen die essentieel zijn voor de vorming van goede afstemming binnen de PDMS microkanaal identificeren. Het onderliggende principe van deze techniek is dat de snelheid van collagen stroming door de microkanaal vervolgens induceert filament uitlijning. Daarom is de meest cruciale stap in het regelen van de graad van vezel uitlijning juiste modulatie van de vacuümdruk. Voor willekeurige collageen uitlijnen in een microkanaal, moet de onderdruk laag zijn, en de collageen moet langzaam naar beneden stromen kanaal. Wanneer het collageen te snel door stroomt, zullen de vezels beginnen te lijnen. Een bredere kanaal maakt deze stelling eenvoudiger. Omgekeerd goede collageen uitlijning hogere vacuümdrukken worden gebruikt en de collageenoplossing moet sneller worden doorgetrokken. Een tweede kritische stap in het genereren uitgelijnde matrices is de temperatuur. Het is zeer belangrijk om ervoor te zorgen dat alle componenten en oplossingen worden gekoeld op ijs voor gebruik. Wanneer de kanalen niet vóór gebruik worden gekoeld, wordt het collageen in de kanalen te snel polymeriseren en leidt tot dunnere, kleinere vezels. Indien de geneutraliseerde collageen wordt afgekoeld tot 4 ° C en niet op ijs, de audiotoebed kiemvorming zal leiden tot grotere vezeldiameters die moeilijker te lijnen door flow. Het is ook belangrijk om de microkanaal koelen zelf. Zonder voorafgaande koelen, zal het kleine volume van collageen zeer snel opwarmen opleveren slechte resultaten.
Het collageen microkanalen zijn zeer nuttige techniek, maar er zijn bepaalde beperkingen. Voor een, de uitlijning in een stromingsgeïnduceerde microkanalenplaat is nooit perfect, en zal nooit gelijk zijn aan een rek geïnduceerde alignment techniek. Er zullen altijd enkele vezels loodrecht op de stromingsrichting, maar de reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid en gebruiksgemak opwegen tegen de kleine variaties in uitlijning binnen het kanaal. Belangrijker zijn cellen aangetoond effectief detecteren kleine veranderingen in de uitlijning en antwoorden met meer aanhoudende migratie in deze kanalen 3,15. De cellen zal ook de uitlijning van het kanaal als hun aantal toenemen en beginnen ze te migreren. Als een betere afstemming is vereist, kan de microkanalen PDMS eenvoudig worden aangepast om smallere afmetingen of kleine vernauwingen uitlijning zich bergen. Beide zijn effectief gebleken, maar hebben andere bijbehorende trade-offs 16. Een andere beperking van het microkanaal techniek is dat het PDMS kanaal weinig doorlatend middelen of fluorescerende kleurstoffen. Dit betekent dat deze verbindingen moeten diffunderen beneden het kanaal vanuit de havens, die verrassend traag, en kan moeilijkheden bij het uitwassen behandelingen opleveren.
Hoewel er bepaalde beperkingen aan deze microkanaal platform, biedt het een aantal voordelen ten opzichte van bestaande technieken. Het is experimenteel toegankelijk is niet omvangrijk instrumenten 3,13 of kleine populaties van cellen voor het genereren van uitlijning vereisen. Het maakt ook niet nodig exogene magnetische korrels 13,14 die meestal autofluorescente zijn en kunnen kunstmatig verknopen van het collageen netwerk. Het collageen microkanaal isOok gewoon meer kosteneffectief en economisch. Naast de huidige voordelen, maar heeft ook talrijke voordelen die kunnen worden ingezet in toekomstige toepassingen. Voor één, kan het collageen microkanaal worden ontworpen of aangepast in bijna elke configuratie of experiment. Geavanceerde ontwerpen laten de kanalen collageen holle buizen of 3D structuren aan de architectuur van vereenvoudigde organen of tumoren 22 nabootsen. Bovendien kunnen de kanalen worden gemaakt van andere materialen dan PDMS. Dit zou kunnen verschillende mechanische eigenschappen over te brengen naar de geïntegreerde collageen netwerken of matrices. Tenslotte kan de kleine hoeveelheid reagentia die voor deze test ook aantrekkelijk en economisch voor kleinere high throughput schermen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs willen graag subsidie nummers UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 en T32-GM008692-18 erkennen voor de financiering van dit werk. We hebben ook erkennen Jeremy Bredfelt en Yuming Liu loci voor de ontwikkeling van en bijstand bij de CT-FIRE analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Concentration Rat Tail Collagen | Corning | 354249 | |
| SylGard184 elastomer kit | Corning | NC9285739 | Elastomer for PDMS channels |
| HEPES | Fisher | BP310 | For HEPES neutralization buffer |
| KCl | Fisher | BP366 | For HEPES neutralization buffer |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | For HEPES neutralization buffer |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | For HEPES neutralization buffer |
| NaCl | Fisher | BP358 | For HEPES neutralization buffer |
| Levy Improved Neubauer Hemacytometer | Fisher | 15170-208 | cell counting |
| 6-well non-tissue culture plate | Corning | 351146 | |
| 50 mm glass bottom dish | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art Plastic Vacuum Desiccator | Bel-Art | F4200-2021 | Degassing chamber for PDMS |
| transparency film | 3M | pp2950 | Plastic film for pouring pdms channels |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | Hot plate for curing PDMS microchannels |
| Vacuum regulator | Precision Medical | PM3100 | Vacuum regulator for collagen microchannels |
| 8" x 8" rubber sheet | Amazon - Rubber-Cal | Silicone - 60A | rubber sheet for pouring PDMS microchannel |
| 8" x 8" x 0.125" acrylic sheet | Amazon | Plexiglass sheets | for pouring PDMS microchannels |
| 10 lb weights | Amazon | CAP Barbell | for pouring PDMS microchannels |
| 15 ml Conical tubes | Fisher | 352097 | |
| 50 ml Conical tubes | Fisher | 352098 | |
| Plastic pipets | Dot Scientific | 229202B, 229206B, and 667225B | 2 ml, 5 ml, and 25 ml |
| 70% EtOH | Fisher | NC9663244 |
References
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38 (2006).
- Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
- Even-Ram, S., Yamada, K. M.
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
- Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
- Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
- Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
- Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
- Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18 (2008).
- Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14 (2013).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007 (2014).
- Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12 (2015).
