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Cancer Research

Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना

Published: October 20, 2016 doi: 10.3791/53990
Automatic Translation
1, 2, 3, 4
1New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University, 2Department of Physiology and Medical Physics, Royal College of Surgeons in Ireland, 3The Feinstein Institute for Medical Research at North Shore-LIJ, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Gruss Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine

Abstract

ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (ग्रेड चतुर्थ glioma) 1 साल के बाद निदान के एक औसत अस्तित्व के साथ एक बहुत आक्रामक मानव कैंसर है। आणविक घटनाओं है कि glioblastomas को जन्म दे की वृद्धि की समझ के बावजूद, इस कैंसर अभी भी अत्यधिक पारंपरिक इलाज करने के लिए आग रोक बनी हुई है। उच्च ग्रेड ब्रेन ट्यूमर की शल्य लकीर glioblastoma कोशिकाओं की अत्यधिक infiltrative प्रकृति के कारण शायद ही कभी पूरा हो गया है। चिकित्सकीय दृष्टिकोण जो ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण attenuate इसलिए एक आकर्षक विकल्प है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों है कि ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज और microglia (निवासी मस्तिष्क मैक्रोफेज) दृढ़ता ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रोत्साहित दिखाया है। प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित ग्लियोब्लास्टोमा-बृहतभक्षककोशिका / microglia बातचीत में इन विट्रो संस्कृति assays का उपयोग करने के लिए मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है। यह दृष्टिकोण बहुत विकास और / या दवाओं है कि मैक्रोफेज के साथ संचार को बाधित की खोज की है कि इस घातक बिहेव सक्षम बनाता सुविधा कर सकते हैंआईओआर। 10 गुना - हम दो मजबूत coculture आक्रमण assays जहां microglia / मैक्रोफेज द्वारा 5 glioma सेल आक्रमण को प्रोत्साहित स्थापना की है। ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट मार्कर या अनिवार्यता से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त के साथ लेबल मैट्रिक्स लेपित पॉली कार्बोनेट चैम्बर सम्मिलित करता है पर बिना और साथ मैक्रोफेज / microglia चढ़ाया या एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं। सेल आक्रमण फिल्टर के नीचे पर छवि के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग और केवल आक्रामक कोशिकाओं की गिनती द्वारा मूल्यांकन किया है। इन assays का प्रयोग, कई औषधीय inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, और Semapimod), पहचान की गई है जो बृहतभक्षककोशिका ब्लॉक / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रेरित किया।

Introduction

ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी निदान 1,2 के समय से लगभग 12 महीने के एक औसत अस्तित्व के साथ एक आक्रामक मानव मस्तिष्क कैंसर है। ग्लयोब्लास्टोमा सबसे घातक और नैदानिक ​​चुनौतीपूर्ण कैंसर में से एक यह मानक रसायन चिकित्सा और शल्य लकीर को आग रोक के रूप में है। ग्लियोब्लास्टोमा के फैलाना प्रकृति ट्यूमर कोशिकाओं को उन्नत ट्यूमर व्यावहारिक रूप से शल्य चिकित्सा पूरी तरह से बांटना असंभव बना सामान्य मस्तिष्क भर में प्रसार करने के लिए सक्षम बनाता है। यह बेहद आक्रामक पहलू ग्लियोब्लास्टोमा और अन्य उन्नत astrocytomas की एक बानगी सुविधा है। इसलिए, अधिक से अधिक शोध का ध्यान केंद्रित ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की आणविक तंत्र पर किया गया है। ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर microenvironment द्रोह 3-6 स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण 7.8 बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार होने के लिए दिखाया गया है। इन अध्ययनों से ज्यादातर लेकिन का उपयोग कर मैक्रोफेज / microglia के प्रभाव को मापाassays जो शारीरिक रूप से उन्हें glioblastoma कोशिकाओं से अलग। हमारी प्रयोगशाला बाहर स्थापित किया है सुधार assays जो हमें अध्ययन कैसे ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पर cocultures में मैक्रोफेज / microglia निर्भर है और आक्रमण के दौरान उन दोनों के बीच शारीरिक संपर्क की छवि के लिए हमें सक्षम करने की अनुमति उत्पन्न करते हैं।

क्लासिक assays को मापने के लिए सेल आक्रमण 'मानक' Boyden कक्ष chemotaxis और chemoinvasion प्रारूपों में शामिल हैं। यहाँ कोशिकाओं का अध्ययन किया जा करने के लिए एक प्लास्टिक चैम्बर जो नीचे है कि एक निर्दिष्ट आकार (व्यास में 0.4 और 8 के बीच आम तौर माइक्रोन) के के छिद्रों पर एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर होता है में चढ़ाया जाता है। सेल आक्रमण करने की प्रक्रिया एक शारीरिक बाधा है, आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से बना शामिल है। chemoinvasion परख में, वरीय इस्तेमाल किया मैट्रिक्स Matrigel (इसके बाद के रूप में "मैट्रिक्स" कहा जाता है), एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन मिश्रण Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) द्वारा स्रावित माउस सार्कोमा कोशिकाओं और कर्नल के बड़े पैमाने पर होते हैंlagen प्रकार चतुर्थ और laminin। कक्षों तो एक अच्छी तरह से टिशू कल्चर के साथ जो या वृद्धि कारक है कि आक्रमण को प्रोत्साहित करने के संदेह कर रहे हैं बिना सेल संस्कृति मीडिया में शामिल है में रखा जाता है। कोशिकाओं जो एक उच्च आक्रामक क्षमता एक उच्च आवृत्ति पर बाह्य मैट्रिक्स लेपित फिल्टर के माध्यम से आक्रमण और फिल्टर के नीचे का पालन करना होगा है। हम आदेश ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण पर microglia और ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज की भूमिका का आकलन करने के लिए इस परख संशोधित किया है।

10 गुना 9,10 - हम इस कागज कि microglia द्वारा 5 दो ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों के आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते भीतर वर्णित coculture assays का उपयोग निर्धारित करने के लिए सक्षम किया गया है। यह दर्शाता है जो ग्लियोब्लास्टोमा के पशु मॉडल में मनाया जाता है। इसके अलावा, हम एक तीन आयामी आक्रमण परख जहां glioblastoma कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच बातचीत / microglia अधिक सीधे जांच की जा सकती विकसित की है। ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की हद macropha से प्रेरितGES / 3D परख में microglia क्या मैट्रिक्स लेपित चैम्बर दृष्टिकोण का उपयोग कर देखा जाता है के बराबर है। इसी assays के पहले आक्रमण 11-13 दौरान मैक्रोफेज के साथ स्तन कार्सिनोमा बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए। दोनों ही तरीकों से इस पत्र में वर्णित glioblastoma कोशिकाओं के बृहतभक्षककोशिका / microglia उत्तेजित आक्रमण की आणविक तंत्र (s) काटना करने की क्षमता में सहायता करनी चाहिए।

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Protocol

1. कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग

नोट: लेबल ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ 9 microglia। वैकल्पिक रूप से, सेल लाइनों 14 में वर्णित है कि अनिवार्यता से ऐसे GFP / आरएफपी के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उत्पन्न करते हैं।

  1. धुंधला के दिन पर 80% मिला हुआ - एक 6 अच्छी तरह से थाली पर प्लेट कोशिकाओं ऐसी है कि वे 70 हो जाएगी। Murine ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन GL261 और मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइन U87, प्लेट के लिए 1 एक्स 10 6 और 1.5 x 10 6 कोशिकाओं क्रमश: धुंधला से पहले एक 6 सेमी पकवान 24 घंटा पर।
  2. , DMSO में फ्लोरोसेंट सेल दाग डाई समाधान तैयार है और मीडिया के लिए 5 सुक्ष्ममापी डाई जोड़ सकते हैं या तो रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान मध्यम (RPMI) या Macrophage सीरम मुक्त मध्यम (MSFM), भंवर अच्छी तरह से।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और 5% सीओ 2 के लिए डाई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. डाई युक्त मीडिया निकालें और कोशिकाओं को नए सिरे से मीडिया (RPMI या MSFM) जोड़ें।
  5. 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। नोट: प्रकोष्ठों अब कर रहे हैंसना हुआ और तैयार प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा।

2. पूर्व लेपित मैट्रिक्स चैंबर coculture आक्रमण परख

  1. Phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) 15 का उपयोग THP-1 कोशिकाओं को अलग।
    1. प्लेट 2 - 3 x 10 5 THP-1 RPMI / 10% FBS के 1.5 मिलीलीटर में एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में कोशिकाओं। इसके तत्काल बाद चढ़ाना के बाद 100 एनएम पीएमए जोड़ सकते हैं और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
      नोट: 48 घंटे के बाद, THP-1 कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक भेदभाव आया है पक्षपाती हो सकता है और अच्छी तरह से एक गोल आकृति विज्ञान पर लेने की तह तक फैल जाएगा।
    2. 1x पीबीएस के साथ एक बार धोने से पीएमए निकालें और ताजा RPMI / 10% FBS के साथ बदलें। एक और 48 घंटा रुको जब तक कोशिकाओं परख में उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
  2. उन्हें एक अच्छी तरह से अकेले मीडिया के 500 μl युक्त (कोई सीरम) में रखने और शीर्ष करने के लिए अकेले मीडिया के 500 μl जोड़कर मैट्रिक्स पूर्व लेपित कक्षों संतुलित करना। 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए कक्षों सेते हैं।
    सामग्री / उपकरण की तालिका देखें।
  3. धीरे कोशिकाओं (fluorescently लेबल ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों और microglia / मैक्रोफेज) को अलग करने के लिए, आकांक्षा से कोशिकाओं से मीडिया को दूर। 2 मिमी EDTA / पीबीएस के साथ पकवान पर कोशिकाओं को धो लें। 2 मिमी EDTA / पीबीएस के 500 μl जोड़ें और 5 के लिए सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल इनक्यूबेटर में 10 मिनट और 5% सीओ 2।
  4. मीडिया के 5 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं से युक्त 0.3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए)।
  5. 120 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और MSFM / 0.3% बीएसए मीडिया में resuspend गोली या RPMI / 0.3% बीएसए (U87 और THP-1 कोशिकाओं के लिए) (GL261 कोशिकाओं और microglia के लिए) ऐसी कोशिकाओं की एकाग्रता 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के बराबर होता है कि । कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें।
  7. 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति 500 ​​μl मीडिया / 0.3% बीएसए जोड़ें।
  8. कक्षों कि कम से कम 2 घंटा (2.2 कदम) के लिए equilibrated किया गया है से मीडिया निकालें। प्लेस chambeअच्छी तरह से 500 μl मीडिया / 0.3% बीएसए (कदम 2.7) युक्त रु।
  9. अवरोधकों बृहतभक्षककोशिका पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है / microglia glioma आक्रमण को प्रेरित किया, दोनों नीचे और चैम्बर के शीर्ष भाग के लिए उपयुक्त एकाग्रता जोड़ें।
    नोट: सीएसएफ-1R की सांद्रता प्रेरित GL261 ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण संदर्भ 9 में पाया जा सकता है पूरी तरह से microglia को बाधित करने के लिए इस्तेमाल अवरोध करनेवाला।
  10. माउस glioblastoma (2.10.1) और मानव glioblastoma (2.10.2): सेल का इस्तेमाल किया तर्ज पर निर्भर करता है, शीर्ष चैम्बर अगले दो चरणों में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को जोड़ने।
    1. मिक्स 1.5 x 10 5 GL261 (ग्लियोब्लास्टोमा) कोशिकाओं (150 μl) और 5 एक्स 10 4 माउस microglia (50 μl) (मीडिया विवरण के लिए कदम 2.6 देखें)। 300 μl MSFM / 0.3% बीएसए जोड़कर 500 μl मात्रा लाओ। शीर्ष चैम्बर के लिए सेल मिश्रण जोड़ें और 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
      नोट: Murine microglia रूप में मुझे बताया नवजात चूहों से अलग कर रहे हैंn 1 6।

मिक्स 7.5 x 10 4 U87 (ग्लियोब्लास्टोमा) कोशिकाओं (75 μl) और 2.5 x 10 4 THP1 (बृहतभक्षककोशिका) कोशिकाओं (25 μl)। 400 μl RPMI / 0.3% बीएसए जोड़कर 500 μl में मात्रा लाओ। शीर्ष चैम्बर के लिए सेल मिश्रण जोड़ें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं।

  1. ऊष्मायन के बाद, कोमल आकांक्षा द्वारा चैम्बर के शीर्ष से कोशिकाओं को हटाने और पीबीएस में 3.7% formaldehyde में रखकर कक्षों को ठीक। कक्षों (या रात में 4 डिग्री सेल्सियस) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लगानेवाला में रहने के लिए अनुमति दें। कोमल आकांक्षा द्वारा लगानेवाला निकालें और पीबीएस 1x 500 μl के साथ बदलें। छवि विश्लेषण के लिए धारा 4 के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: प्रयोग इस समय रुका हुआ है और 1x पीबीएस में इमेजिंग के लिए बचाया जा सकता है। फ्लोरोसेंट रंजक संकेतों निर्धारण के बाद अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए पता लगाया जा सकता है।

3. आक्रमण परख "3 डी" द मैट्रिक्स में Glioma और मैक्रोफेज / Microglia -embedding

  1. 4 डिग्री सेल्सियस रात भर पिघलना मैट्रिक्स मिश्रण। हुड में बर्फ पर मैट्रिक्स का उपयोग कर आगे की सभी जोड़तोड़ प्रदर्शन।
  2. 10 मिलीग्राम / एमएल मैट्रिक्स के मीडिया में बर्फ पर 0.3% BSA के साथ एकाग्रता (MSFM या RPMI) तैयार करें।
    नोट: मैट्रिक्स के शेयर एकाग्रता आम तौर पर लगभग 15 मिग्रा / मिली है।
  3. मैट्रिक्स में निलंबन के लिए कोशिकाओं (चरण 1 में लेबल) तैयार करने के लिए, आकांक्षा से कोशिकाओं से मीडिया को दूर। 2 मिमी EDTA / पीबीएस के साथ पकवान पर कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं के लिए 2 मिमी EDTA / पीबीएस के 500 μl जोड़ें और 5 के लिए सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10 मिनट और 5% सीओ 2।
  4. 0.3% बीएसए युक्त मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend।
  5. 120 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  6. गोली से महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। मीडिया / 0.3% BSA में resuspend गोली कि इस तरह की कोशिकाओं की एकाग्रता 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के बराबर है। कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें।
  7. (150 μl में) + 5 एक्स 10 4 microglia कोशिकाओं (50 μl में) 1.5 x 10 5 GL261 कोशिकाओं को एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में जोड़ें।2 एक्स 10 5 GL261 कोशिकाओं (200 μl) एक अलग 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: अकेले microglia बिना GL261 कोशिकाओं को एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  8. 120 x जी 5 मिनट के लिए microfuge में स्पिन कोशिकाओं।
  9. 200 μl बर्फ पर ठंड मैट्रिक्स में कोशिकाओं Resuspend।
  10. प्लेट 50 μl (50,000 कोशिकाओं) 8 माइक्रोन रोमकूप आकार चैम्बर डालने के शीर्ष कम्पार्टमेंट के केंद्र पर।
  11. polymerization होने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  12. कम अच्छी तरह से करने के लिए ऊपरी सदन और 700 μl सीरम युक्त सेल मध्यम विकास के लिए 200 μl सीरम मुक्त मध्यम जोड़ें।
  13. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
  14. ऊष्मायन के बाद, कोमल आकांक्षा द्वारा चैम्बर के शीर्ष से कोशिकाओं को हटाने और पीबीएस में 3.7% formaldehyde में रखकर कक्षों को ठीक। कक्षों (या रात में 4 डिग्री सेल्सियस) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए लगानेवाला में रहने के लिए अनुमति दें। कोमल आकांक्षा द्वारा लगानेवाला निकालें और पीबीएस 1x 500 μl के साथ बदलें। धारा 4 के लिए आगे बढ़नाआर छवि विश्लेषण।

4. इमेजिंग Assays

  1. 3.7% formaldehyde से कक्षों में निकालें और अच्छी तरह से धो पीबीएस 1x ताजा 500 μl युक्त।
    ध्यान दें: कक्षों को सुखाने के लिए अनुमति न दें।
  2. एक कपास इत्तला दे दी applicator का प्रयोग, धीरे फिल्टर सतह scraping द्वारा फिल्टर के शीर्ष भाग (पक्ष चैम्बर के अंदर का सामना करना पड़) से गैर इनवेसिव कोशिकाओं को साफ। धीरे शुरू करें और धीरे-धीरे दबाव बढ़ाने के लिए। चैम्बर प्रति यह कम से कम 3 बार करें।
  3. या तो एक गिलास तली डिश में कक्षों की जगह या एक 24 अच्छी तरह से थाली में छोड़ दें।
  4. एक epifluorescent या लेजर confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप कैमरा और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर 9,10 के साथ सुसज्जित के मंच पर नमूना रखें।
  5. प्रतिनिधि क्षेत्रों के कई 10X 20X या छवियों ले लो।
  6. ImageJ जैसे, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, glioblastoma कोशिकाओं है कि नीचे 9,10 करने के लिए फिल्टर पार कर दी है की संख्या गिनती।
  7. "3 डी इमेजिंग हैं। "आक्रमण परख (धारा 3 में वर्णित), फिल्टर के नीचे पर आक्रामक सेल की आबादी छवि के लिए एक फ्लोरोसेंट लेजर confocal खुर्दबीन 5-6 का उपयोग कर एक जेड ढेर श्रृंखला उत्पन्न, प्रोटोकॉल का पालन करें कदम 4.2 - 4.6 ऊपर वर्णित है।

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Representative Results

यहाँ उल्लिखित तरीकों का उपयोग करना, हम पता चला है कि microglia और मैक्रोफेज काफी ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते हैं। दो अलग अलग आक्रमण assays कार्यरत हैं और चित्रा 1 में चित्रित कर रहे हैं। चित्रा 2 में, GL261 कोशिकाओं है कि अनिवार्यता से फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry व्यक्त करने के साथ और 48 घंटे के लिए microglia बिना पूर्व लेपित कक्षों पर चढ़ाया गया। GL261 कोशिकाओं को अपने दम पर न्यूनतम इनवेसिव लेकिन जब सुसंस्कृत microglia के साथ आक्रामक क्षमता लगभग 10 गुना की वृद्धि हुई थी।

हम मानव कोशिका लाइनों का उपयोग कर एक समान प्रभाव निरीक्षण करते हैं। चित्रा 3 में, U87 कोशिकाओं (साथ 5 chloromethylfluorescein diacetate (CMFDA) हरी दाग) जब विभेदित THP-1 कोशिकाओं के साथ cocultured 5-6 गुना अधिक आक्रमण से पता चलता है। THP-1 एक मानव monocytic सेल लाइन (एक तीव्र monocytic ल्यूकेमिया मरीज से प्राप्त) है कि हो सकता है diएक बृहतभक्षककोशिका की तरह राज्य phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) 15 का उपयोग करने में fferentiated। विभेदित THP-1 कोशिकाओं साइटोकाइन स्राव और phagocytosis बाहर ले जाने की क्षमता के रूप में मानव मैक्रोफेज की विशेषताओं के कई प्रदर्शित करते हैं।

वैकल्पिक रूप से, सेल आक्रमण उन्हें मैट्रिक्स में embedding और एक कक्ष डालने में फिल्टर पर सीधे इस चढ़ाना द्वारा मापा जा सकता है। लेजर confocal माइक्रोस्कोपी है कि एक तीन आयामी प्रतिनिधित्व (जेड ढेर) का उत्पादन छवियों की एक श्रृंखला का उत्पादन किया जा सकता है। क्या मैट्रिक्स लेपित चैम्बर परख में मनाया जाता है के समान (आंकड़े में दिखाया गया है 2 - 3), microglia की coculture (CMPTX लाल के साथ दाग) GL261 कोशिकाओं (CMFDA हरा) को बढ़ावा देने पर आक्रमण करने के रूप में कोशिकाओं की संख्या पार कर दी है द्वारा मापा फिल्टर के नीचे करने के लिए (चित्रा 4)। इस प्रारूप glio के बीच संभावित सेल सेल बातचीत की कल्पना करने में सक्षम होने का जोड़ा लाभ हैब्लास्टोमा कोशिकाओं और आक्रमण के दौरान microglia। दरअसल, microglia बारीकी से 3 डी मैट्रिक्स (चित्रा 5) में निलंबित कर दिया glioma कोशिकाओं के साथ संबद्ध करने के लिए लग रहे हैं। केवल समापन बिंदु विश्लेषण की आवश्यकता है और एक लेजर confocal उपयोग के लिए उपलब्ध नहीं है, तो सेल कक्षों के रूप में मैट्रिक्स लेपित कक्षों के लिए वर्णित साफ किया जा सकता है। तो फिर शेष (आक्रामक) कोशिकाओं की संख्या छवियों का उपयोग एक मानक epifluorescent खुर्दबीन से प्राप्त की गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। फिल्म 1 इस तरह के एक परख के तीन आयामी विधानसभा से पता चलता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Microglia / बृहतभक्षककोशिका उत्तेजित ग्लयोब्लास्टोमा सेल परख के लिए दो अलग अलग प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आक्रमण शीर्ष पैनल पूर्व लेपित मैट्रिक्स चैम्बर आक्रमण परख (धारा 2) को दिखाता है। नीचे पैनल 3 डी मैट्रिक्स आक्रमण परख (धारा 3) को दिखाता है। चित्रा से अनुकूलित9। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. Microglia (एमजी) को बढ़ाने GL261 ग्लयोब्लास्टोमा सेल आक्रमण। (ए) अनुपस्थिति में GL261 कोशिकाओं (mCherry व्यक्त) पर हमला करने की छवियों प्रतिनिधि (बाएं पैनल; अकेले GL261) या microglia की उपस्थिति (सही पैनल; GL261 + एमजी) संयुक्त और मैट्रिक्स लेपित कक्षों पर चढ़ाया गया, 48 के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा मानव संसाधन और फिर कोशिकाओं है कि फिल्टर पार कर दी है की संख्या का मूल्यांकन। छवियाँ 10X उद्देश्य का उपयोग कर लिया। स्केल बार = 400 माइक्रोन। (बी) परख केवल आक्रामक GL261 कोशिकाओं (लाल) की गिनती के quantitation। दिखाया गया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब ± SEM कर रहे हैं। (सी) presenc में microglia उत्तेजित GL261 आक्रमण के quantitationऔषधीय अवरोधकों gefitinib (5 माइक्रोन) के, JNJ-28312141 (10 माइक्रोन) के, PLX3397 (1 माइक्रोन), PLX5562 (1 माइक्रोन) के ई। दिखाया गया डेटा मतलब है छह स्वतंत्र प्रयोगों से ± SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. THP1 मैक्रोफेज U87 ग्लयोब्लास्टोमा सेल आक्रमण बढ़ाएँ। (ए) U87 कोशिकाओं CMFDA हरे रंग के साथ दाग पर हमले की छवियों प्रतिनिधि मैट्रिक्स लेपित कक्षों पर अकेले चढ़ाया (बाएं पैनल; U87) या विभेदित THP1 मैक्रोफेज के साथ (सही पैनल; U87 + THP1), 24 घंटा और फिर से मूल्यांकन के लिए ऊष्मायन द्वारा पीछा कोशिकाओं है कि फिल्टर पार कर दी है की संख्या। छवियाँ एक 10X उद्देश्य का उपयोग कर लिया। स्केल बार = 400 माइक्रोन। (बी) परख केवल गिनती के quantitationआक्रामक U87 कोशिकाओं (हरा)। दिखाया गया डेटा मतलब दस स्वतंत्र प्रयोगों से ± SEM हैं।

चित्रा 4
। चित्रा 4. 3 डी आक्रमण GL261 और microglial coculture की परख (ए) दिखाया छवियाँ अकेले मैट्रिक्स में एम्बेडेड GL261 कोशिकाओं की छवियों (CMFDA हरे रंग के साथ दाग) की एक जेड श्रृंखला से अनुमानों हैं (बाएं पैनल; GL261) या murine microglia के साथ ( CMPTX लाल के साथ लेबल, सही पैनल; GL261 + एमजी)। जेड अनुमानों छवि ढेर जो चैम्बर फिल्टर के नीचे के तल शामिल 4 स्लाइस के थे और इसलिए आक्रामक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन। (बी) GL261 कोशिकाओं (हरा) के quantitation के रूप में ऊपर वर्णित फिल्टर के नीचे पर होना करने के लिए निर्धारित की। हमलावर GL261 कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित किया है और मोनोकल्चर में GL261 कोशिकाओं की है कि सामान्यीकृत था। दिखाया गया डेटा मतलब ± एस प्रतिनिधित्व3 स्वतंत्र प्रयोगों, डुप्लिकेट (10 से अनुकूलित आंकड़ा) में प्रदर्शन के ईएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
GL261 (हरा) और Microglia (लाल) coculture मैट्रिक्स। GL261 और microglia सेल बातचीत में एंबेडेड के 3 डी ढेर के भीतर एक टुकड़ा से चित्रा 5. छवि सफेद तीर के साथ डाला जाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन।

आकृति 1
फिल्म 1:। GL261 (हरा) और microglia (लाल) coculture से लिए गए चित्रों की पूरी जेड श्रृंखला के एक 3 डी प्रोजेक्शन के एक्स धुरी के चारों ओर 3 डी रोटेशन में ग्लयोब्लास्टोमा और Microglia इंटरेक्शन एमए में एम्बेडेडट्रिक्स। स्लाइस 5 माइक्रोन के वेतन वृद्धि में कर रहे हैं। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

उच्च ग्रेड astrocytomas और glioblastoma के अत्यधिक आक्रामक प्रकृति इन मस्तिष्क के कैंसर बहुत घातक हैं। सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण इसलिए यह ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण की आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने की है। ज्यादातर ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पहले से ही 17 साल की प्रक्रिया के बारे में सीखा गया है। 10 गुना - इस पत्र में विस्तृत परख प्रारूपों का उपयोग करना, हमारी प्रयोगशाला दोनों माउस और मानव मॉडल है कि ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज द्वारा 5 glioma सेल आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते में दिखाया गया है। इस coculture मॉडल ईमानदारी glioblastoma कोशिकाओं की क्षमता को शारीरिक रूप से मैक्रोफेज / microglia बातचीत करने के लिए जो पैराक्राइन और juxtacrine बातचीत के लिए अनुमति होगी कि संभावित बीच द्विदिश संचार में शामिल हैं (जैसे पायदान-डेल्टा और Ephrin-Ephs के रूप में ligand रिसेप्टर प्रणालियों के माध्यम से) प्रतिकृति ट्यूमर कोशिकाओं और मैक्रोफेज। अन्य परख स्वरूप जो glioma सेल आक्रमण पर मैक्रोफेज के प्रभाव की खोज के लिए की तलाश में आम तौर पर कोशिकाओं हैशारीरिक रूप से अलग रूप में मैक्रोफेज अच्छी तरह से नीचे पर चढ़ाया जाता है और glioblastoma कोशिकाओं चैम्बर 3,4 पर हैं। नतीजतन, इन अध्ययनों बृहतभक्षककोशिका उत्तेजित glioma आक्रमण (2 गुना) में एक अधिक विनम्र वृद्धि दिखा। इस coculture परख इस आशय पर सुधार (5 - 10 गुना) की संभावना बृहतभक्षककोशिका दौरान juxtacrine बातचीत के महत्व को दर्शाता है / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रेरित किया।

प्रोटोकॉल इस पत्र में उल्लिखित कई कदम है जो ध्यान से किया जाना चाहिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए शामिल है। प्रयोग के रूप में यहाँ वर्णित किया जाता है और कोई हमलावर कोशिकाओं में देखा जाता है, तो फ्लोरोसेंट रंजक समाप्त हो गई हो सकता है जो बहुत कमजोर या न के बराबर धुंधला करने के लिए नेतृत्व करेंगे। पूर्व लेपित कक्षों का उपयोग कर आक्रमण assays के लिए, यह ताजा आक्रमण कक्षों जो अतीत समाप्ति की तारीख नहीं हैं और प्रयोग प्रदर्शन जब तक पूरे समय तक जमे हुए रखा गया है का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। मंडलों जो छोड़ दिया गया12 से अधिक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बाहर है कि मैट्रिक्स बाधा में असंतोषजनक नहीं रह बरकरार है और सामान्य से एक बहुत उच्च आवृत्ति पर आक्रमण किया था कोशिकाओं होना पाया गया है। 3 डी परख के लिए, यह पूरी तरह से बर्फ पर सभी pipets और ट्यूबों रखने के लिए महत्वपूर्ण है। समय का एक महत्वपूर्ण अवधि के लिए कमरे के तापमान पर हैं, मैट्रिक्स भाजन होगा और उस में कोशिकाओं resuspend करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। यह सिफारिश की है कि एक छोटे से बर्फ से भरा ट्रे सभी सामग्री जो मैट्रिक्स के साथ संपर्क में आ जाएगा धारण करने के लिए हुड में प्रयोग किया जाता है। प्रोटोकॉल हालांकि इस glioma आक्रमण पर इष्टतम प्रभाव देखने के लिए आवश्यक समय की लंबाई को प्रभावित कर सकता है एक उच्च घनत्व सेल शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह देखने के लिए कि अन्य प्रकार की कोशिकाओं coculture परख में जोड़ा जा सकता है और क्या संभावित प्रभाव वे आक्रमण पर हो सकता है ब्याज की हो जाएगा। अंत में, हम स्वीकार करते हैं कि मस्तिष्क microenvironment इन विट्रो में दोहराने के लिए अद्वितीय है और मुश्किल है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि आक्रमण CHयहां इस्तेमाल Ambers सामान्य मस्तिष्क जो glioblastoma कोशिकाओं आक्रमण के दौरान मुठभेड़ जाएगा (यानी, घनी पैक न्यूरॉन्स और astrocytes) के विशिष्ट घटकों की कमी है। यद्यपि कि चेतावनी, मैक्रोफेज के उत्तेजक प्रभाव से / इस परख में microglia क्या विवो में मनाया जाता है और जो अवरोधकों और / या प्रोटीन इस प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत है।

संस्कृति में ट्यूमर microenvironment नकल उतार दिया कितने विविध प्रकार की कोशिकाओं और मैट्रिक्स प्रोटीन द्रोह के विभिन्न चरणों में ट्यूमर में मौजूद हैं एक चुनौतीपूर्ण काम है। फिर भी microenvironment के घटकों के साथ बातचीत का ट्यूमर इन विट्रो मॉडल में काफी सटीक बहुत नई चिकित्सकीय रास्ते की खोज की सुविधा होगी। अब यह सराहना की है कि इस तरह के मैक्रोफेज कोशिकाओं के रूप में angiogenesis, आक्रमण, प्रतिरक्षा चोरी और दवा प्रतिरोध सहित द्रोह के लिए प्रगति के साथ जुड़े कई पहलुओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। coculture आक्रमण परख यहाँ वर्णित मैक्रोफेज कि उच्च ग्रेड glioblastomas के साथ रोगियों में मनाया जाता है को ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करता है (लगभग 3: 1, 5)। यह दिखाया गया है कि ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रोत्साहित करने के मैक्रोफेज / microglia की क्षमता पर सीएसएफ-1R और इन का उपयोग रास्ते के औषधीय अवरोध के रूप में EGFR सिगनल निर्भर है JNJ-28312141, PLX3397 (सीएसएफ -1 R) और gefitinib (EGFR) की जोरदार वृद्धि attenuates आक्रमण 9 में। इसके अलावा, एम्बेडेड मैट्रिक्स परख का उपयोग कर, यह प्रदर्शन किया गया है कि Semapimod, एक छोटे से मैक्रोफेज और microglia निशाना बनाने के लिए है, यह भी microglia ब्लॉक कर सकते हैं जाना जाता अणु ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण 10 को प्रेरित किया। इन coculture प्रयोगों से परिणाम प्रोत्साहन विवो मॉडल में उपयोग करते हुए इन यौगिकों को मान्य करने के लिए प्रदान की है। इन विट्रो assays इस पत्र में वर्णित से डेटा के साथ संगत, अवरोध PLX3397 साथ सीएसएफ-1R (जो रक्त मस्तिष्क बाधा पार) की नाकाबंदी काफी हद तक अवरुद्धGL261 glioma कोशिकाओं की क्षमता C57BL / 6 चूहों 9 के दिमाग में आक्रमण करने के लिए। इसी तरह, Semapimod छुड़ाया में मस्तिष्क आक्रमण को बाधित करने के लिए और बहुत GL261 ट्यूमर 10 को शरण चूहों के अस्तित्व के समय को बढ़ाने में मानक विकिरण उपचार के साथ तालमेल कायम करने के लिए दिखाया गया था। इन तरीकों के दोनों क्लिनिक में कारगर साबित हो सकता है।

अब यह अच्छी तरह से सराहना की है कि बृहतभक्षककोशिका प्रणाली विभिन्न तरह के कैंसर को बढ़ने से 3-6, 11-13 द्रोह करने के लिए काफी महत्वपूर्ण है। यह स्पष्ट रूप से स्तन कैंसर और मस्तिष्क मॉडल है कि ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज ट्यूमर सेल आक्रमण और मेटास्टेसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं में स्थापित किया गया है। इसके अलावा, मैक्रोफेज पेशेवर प्रतिजन कोशिकाओं जो संक्रमण से 18 के जवाब में प्रतिरक्षा अनुकूली आर्केस्ट्रा के रूप में मैक्रोफेज के रूप में प्रतिरक्षा बच (और इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं के रूप में संबंधित वंश की कोशिकाओं) समारोह में मध्यस्थता के लिए बहुत महत्वपूर्ण होने की संभावना है। अब यह स्पष्ट है कि सामान्य पीएच में से एक हैअनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के ysiological कार्यों न्यायपालिका कोशिकाओं को नष्ट करके अनियंत्रित प्रसार को रोकने के लिए है। ट्यूमर कोशिकाओं की ओर प्रतिरक्षण तथ्य यह है कि कैंसर कोशिका का अत्यधिक mutagenic प्रकृति उत्पन्न नव-एंटीजन कि अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा विदेशी के रूप में पहचाने जाते हैं के कारण होने की संभावना है। दरअसल "प्रतिरक्षा चोरी" की प्रक्रिया द्रोह का एक महत्वपूर्ण हिस्सा बनने के लिए के रूप में कैंसर कोशिकाओं को ट्यूमर को नष्ट करने से प्रतिरक्षा प्रणाली (विशेष साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और भड़काऊ मैक्रोफेज में) को रोकने की जरूरत माने है। यह परख इस पत्र में वर्णित मैक्रोफेज के साथ ग्लियोब्लास्टोमा बातचीत के अध्ययन की सुविधा है और संभावित प्रश्नों के प्रकार हम घातक कैंसर विट्रो संस्कृति assays में उपयोग के बारे में पता कर सकते हैं के विस्तार की अनुमति देगा आशा व्यक्त की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix Corning/Fisher Scientific Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) Life Technologies 12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye Life Technologies/Molecular Probes C34552
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies/Molecular Probes C2925
GL261 cell line National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line American Tissue Type Culture Collection HTB-14
THP-1 cell line American Tissue Type Culture Collection ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml) Life Technologies/Gibco 11875-093
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. Corning CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS) Life Technologies Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisherscientific BP1600-100
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific 15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich P8139-1MG

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References

  1. Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
  2. Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
  3. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
  4. Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
  5. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
  6. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
  7. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
  8. Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
  9. Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
  10. Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
  11. Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
  12. House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
  13. Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
  14. Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
  15. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  16. Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
  17. Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
  18. See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).

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कैंसर रिसर्च अंक 116 आक्रमण glioma glioblastoma microglia microenvironment दुष्टता
Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना
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Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).

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