Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Abstract

Glioblastoma multiforme (grad IV gliom) er en meget aggressiv human cancer med en median overlevelse på 1 år efter diagnosen. Trods af den øgede forståelse af de molekylære begivenheder, der giver anledning til glioblastomer, denne kræft stadig yderst refraktære over for konventionel behandling. Kirurgisk resektion af høj kvalitet hjernetumorer er sjældent udført på grund af den meget infiltrativ karakter glioblastomceller. Terapeutiske tilgange, som dæmper glioblastom celleinvasion derfor er en attraktiv mulighed. Vores laboratorium og andre har vist, at tumor associerede makrofager og mikroglia (hjemmehørende hjerne makrofager) kraftigt stimulere glioblastom invasion. Den i dette dokument protokol bruges til at modellere glioblastoma-makrofag / microglia interaktion anvendelse af in vitro kultur assays. Denne tilgang kan i høj grad lette udviklingen og / eller opdagelse af lægemidler, der forstyrrer kommunikationen med makrofager, der giver dette ondartet Behavior. Vi har etableret to robuste cokultur invasion assays, hvor mikroglia / makrofager stimulerer gliom celleinvasion 5 - 10 gange. Glioblastomceller mærket med en fluorescerende markør eller konstitutivt udtrykker et fluorescerende protein udplades uden og med makrofager / mikroglia på matrix-coatede polycarbonat kammer skær eller indlejret i en tredimensional matrix. Celleinvasion vurderes ved hjælp af fluorescensmikroskopi af billedet og tælle kun invasive celler på undersiden af ​​filteret. Under anvendelse af disse assays, adskillige farmakologiske inhibitorer (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, og Semapimod), er blevet identificeret som blokerer makrofag / microglia stimulerede glioblastoma invasion.

Introduction

Glioblastoma multiforme er en aggressiv menneskelige hjerne kræft med en median overlevelse på ca. 12 måneder fra tidspunktet for diagnosen ^1,2. Glioblastoma er en af ​​de mest dødbringende og klinisk udfordrende kræftformer det er refraktære over for standard kemoterapi og kirurgisk resektion. Den diffuse natur af glioblastom muliggør tumorceller at spredes over hele den normale hjerne gør den avancerede tumor praktisk taget umuligt at kirurgisk resecere fuldstændigt. Denne yderst invasive aspekt er kendetegnende træk ved glioblastom og andre avancerede astrocytomer. Derfor har været genstand for megen forskning i molekylære mekanisme af glioblastom celleinvasion. Den glioblastomtumor mikromiljø spiller afgørende roller i etableringen malignitet ^3-6. Tumor forbundet makrofager / mikroglia viste sig at være ansvarlig for at fremme glioblastom invasion ^7,8. De fleste af disse undersøgelser imidlertid målte virkningen af ​​makrofager / mikroglia under anvendelseanalyser som fysisk adskiller dem fra glioblastom celler. Vores laboratorium har sat sig for at generere forbedrede analyser, der giver os mulighed for at undersøge, hvordan glioblastom invasion afhænger af makrofager / mikroglia i cokultureme og gøre os i stand til at afbilde den fysiske vekselvirkning mellem dem under invasionen.

Klassiske assays til måling af celle invasion omfatter "standard" Boyden kammer kemotaksi og chemoinvasion formater. Her cellerne, der skal undersøges udplades i en plastik kammer, som indeholder et polycarbonat filter på bunden, der har porer af en bestemt størrelse (i almindelighed mellem 0,4 og 8 um i diameter). Processen med celleinvasion involverer en fysisk barriere, der normalt består af ekstracellulær matrix protein. I chemoinvasion assay foretrukne anvendte matrix er Matrigel (i det følgende benævnt "matrix"), et ekstracellulært matrixprotein blanding udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarcomaceller og hovedsageligt består af kollagen type IV og laminin. Kamrene anbringes derefter i en vævskultur brønd, som indeholder cellekulturmedier med eller uden vækstfaktorer, som mistænkes for at stimulere invasion. Celler, der har en højere invasiv kapacitet vil invadere gennem den ekstracellulære matrix coatet filter ved en højere frekvens og klæbe til undersiden af ​​filteret. Vi har modificeret denne assay for at vurdere rollen af ​​mikroglia og tumorassocierede makrofager på glioblastoma celleinvasion.

Vi har været i stand til at bestemme ved hjælp cokultur assays beskrevet i dette dokument, at mikroglia kan stimulere invasionen af to glioblastom cellelinier 5 - 10 gange ^9,10. Dette afspejler, hvad der er observeret i dyremodeller af glioblastom. Derudover har vi udviklet et tredimensionelt invasion assay, hvor samspillet mellem glioblastom celler og makrofager / mikroglia kan undersøges mere direkte. Omfanget af glioblastom celleinvasion stimuleret af macrophaGES / mikroglia i 3D-assayet er sammenlignelig med det, der ses ved anvendelse af matrix overtrukket kammer tilgang. Lignende assays blev tidligere udviklet til at studere breast carcinoma interaktioner med makrofager under invasion ^11-13. Begge metoder er beskrevet i dette dokument skal hjælpe med evnen til at dissekere den molekylære mekanisme (r) af makrofag / microglia-stimuleret invasion af glioblastomceller.

Protocol

1. Fluorescerende mærkning af celler

BEMÆRK: Label glioblastom cellelinjer og mikroglia med fluorescerende farvestoffer ^9. Alternativt generere cellelinier, som konstitutivt udtrykker fluorescerende proteiner, såsom GFP / RFP som beskrevet i ^14.

1. Plate celler på en 6 brønds plade, således at de er 70 - med 80% konfluent på dag af farvning. For den murine glioblastoma-cellelinien GL261 og human glioblastoma-cellelinie U87, plade 1 x 10 ⁶ og 1,5 x 10 ⁶ celler, henholdsvis på en 6 cm skål 24 timer før farvning.
2. Forbered fluorescerende celle plet farveopløsning i DMSO og tilsættes 5 uM farvestof til medier, enten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) eller makrofag Serum Gratis Medium (MSFM), vortex godt.
3. Cellerne inkuberes med farvestoffet i 30 minutter ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Fjern farvestof indeholdende medier og tilsæt friske medier (RPMI eller MSFM) til cellerne.
5. Cellerne inkuberes i 30 minutter. Bemærk: Celler er nufarvede og klar til at blive anvendt i eksperimentet.

2. Pre-belagt Matrix Chamber cokultur Invasion Assay

1. Differentiere THP-1-celler under anvendelse phorbolmyristatacetat (PMA) ^15.
   1. Plate 2 - 3 x 10 ⁵ THP-1-celler i 1,5 ml RPMI / 10% FBS i en 6 brønds dyrkningsplade. Umiddelbart efter udpladning tilsættes 100 nM PMA og inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
      BEMÆRK: Efter 48 timer vil THP-1-celler, der med succes undergået differentiering være klæbende og spredes til bunden af ​​brønden at tage på en rund morfologi.
   2. Fjern PMA ved vask en gang med 1 x PBS og erstat med frisk RPMI / 10% FBS. Vente endnu 48 timer, indtil cellerne er klar til brug i assayet.
2. Ækvilibrere matrix præcoatede kamre ved at placere dem i en brønd indeholdende 500 pi medier alene (ingen serum) og tilsætning 500 pi medie alene til toppen. Inkuber kamre i 2 timer ved 37 ° C og _5% CO2.
   tabel Materialer / udstyr.
3. Til forsigtigt frigøre celler (fluorescensmærkede glioblastomcellelinier og microglia / makrofager), fjerne mediet fra cellerne ved aspiration. Vask cellerne på fad med 2 mM EDTA / PBS. Der tilsættes 500 pi 2 mM EDTA / PBS og inkuberes i 5 - 10 min i en celle inkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Resuspender celler i 5 ml medium indeholdende 0,3% bovint serumalbumin (BSA).
5. Centrifuger i 5 minutter ved 120 x g.
6. Aspirer supernatanten og resuspender pellet i MSFM / 0,3% BSA medier (GL261 celler og mikroglia) eller RPMI / 0,3% BSA (for U87 og THP-1 celler) sådan, at koncentrationen af celler er lig med 1 x 10 ⁶ celler / ml . Brug et hæmocytometer at tælle cellerne.
7. Tilføj 500 pi medie / 0,3% BSA pr brønd af 24-brønds plade.
8. Fjern medier fra kamre, der er blevet ækvilibreret i mindst 2 timer (trin 2.2). Place chambers i brønd indeholdt 500 pi medium / 0,3% BSA (trin 2.7).
9. Hvis inhibitorer bliver brugt til at undersøge deres virkning på makrofag / microglia stimuleret gliom invasion, tilsættes en passende koncentration til både nederste og øverste dele af kammeret.
   BEMÆRK: Koncentrationerne af CSF-1R-inhibitor bruges til fuldt ud at hæmme mikroglia stimuleret GL261 glioblastom invasion kan findes i henvisning ^9.
10. Afhængigt af de anvendte cellelinier, tilføje celler til topkammeret som beskrevet i de næste to trin: muse glioblastoma (2.10.1) og humant glioblastom (2.10.2).
    1. Bland 1,5 x 10 ⁵ GL261 (glioblastom) celler (150 pi) og 5 x 10 ⁴ mus mikroglia (50 pi) (se trin 2.6 for medierne detaljer). Der fortyndes til 500 pi ved tilsætning 300 pi MSFM / 0,3% BSA. Tilføj celleblandingen til toppen kammer og inkuber ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
       BEMÆRK: Murint mikroglia isoleres fra neonatale mus som beskrevet in ^{1 6.}

Bland 7,5 x 10 ⁴ U87 (glioblastoma) celler (75 pi) og 2,5 x 10 ⁴ THP1 (makrofag) celler (25 pi). Bring volumen i 500 pi ved tilsætning 400 pi RPMI / 0,3% BSA. Tilføj celleblandingen til topkammeret. Cellerne inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.

1. Efter inkubation fjerne celler fra toppen af ​​kammeret ved forsigtig aspiration og løse kamre ved at placere i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillad kamre til at forblive i fiksativ i 15 minutter ved stuetemperatur (eller natten over ved 4 ° C). Fjern fiksativ ved forsigtig aspiration og erstatte med 500 pi 1x PBS. Fortsæt til afsnit 4 for billedanalyse.
   BEMÆRK: Eksperimenter kan sættes på pause i dette øjeblik og gemmes til billeddannelse i 1x PBS. kan detekteres fluorescerende farvestof signaler i op til 2 uger efter fiksering.

3. Invasion Assay "3D" -embedding gliom og makrofager / Mikroglia i Matrix

1. Thaw matrix mix ved 4 ° C natten over. Udfør alle yderligere manipulationer bruger matrix på is i hætten.
2. Forbered 10 mg / ml koncentration af matrix i medier (MSFM eller RPMI) med 0,3% BSA på is.
   BEMÆRK: Stock koncentration af matrix er typisk omkring 15 mg / ml.
3. Til fremstilling celler (mærket i trin 1) til suspension i matrix, fjerne mediet fra cellerne ved aspiration. Vask cellerne på fad med 2 mM EDTA / PBS. Der tilsættes 500 pi 2 mM EDTA / PBS til cellerne og inkuberes i 5 - 10 min i inkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Resuspender celler i 5 ml medium indeholdende 0,3% BSA.
5. Centrifuger i 5 minutter ved 120 x g.
6. Aspirer supernatanten fra pelleten. Resuspender pellet i medier / 0,3% BSA, således at koncentrationen af celler er lig med 1 x 10 ⁶ celler / ml. Brug et hæmocytometer at tælle cellerne.
7. Tilføj 1,5 x 10 ⁵ GL261 celler (i 150 pi) + 5 x 10 ⁴ microglia-celler (i 50 pi) i et 1,5 ml mikrofugerør.Tilsæt 2 x 10 ⁵ GL261 celler (200 pi) i en separat 1,5 ml mikrofugerør.
   BEMÆRK: GL261 celler alene uden mikroglia tjener som kontrol.
8. Spin celler i mikrofuge i 5 minutter ved 120 x g.
9. Resuspender celler i 200 pi kold matrix på is.
10. Plade 50 pi (50.000 celler) på midten af ​​det øverste rum på 8 uM porestørrelse kammer insert.
11. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter til polymerisation at forekomme.
12. Tilsæt 200 pi serumfrit medium til det øvre kammer og 700 pi serum indeholdende celle vækstmedium til den nedre brønd.
13. Der inkuberes ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
14. Efter inkubation fjerne celler fra toppen af ​​kammeret ved forsigtig aspiration og løse kamre ved at placere i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillad kamre til at forblive i fiksativ i 15 minutter ved stuetemperatur (eller natten over ved 4 ° C). Fjern fiksativ ved forsigtig aspiration og erstatte med 500 pi 1x PBS. Fortsæt til afsnit 4 for billedanalyse.

4. Imaging Analyser

1. Fjern kamre fra 3,7% formaldehyd og vask i brønd indeholdende frisk 500 pi 1x PBS.
   BEMÆRK: Lad ikke kamre tørre.
2. Ved hjælp af en bomuld tippes applikator, forsigtigt rense non-invasive celler fra den øverste del af filteret (side mod indersiden af ​​kammeret) ved skrabning filteroverfladen. Start forsigtigt og øge presset gradvist. Gør dette mindst 3 gange pr kammer.
3. Placer kamre i enten en glas-bund fad eller efterlade i en plade med 24.
4. Anbring prøven på scenen af en epifluorescerende eller laser konfokal fluorescerende mikroskop udstyret med kamera og billedoptagelse software ^9,10.
5. Tag flere 10X eller 20X billeder af repræsentative områder.
6. Ved hjælp af en billedanalyse software, såsom ImageJ, tælle antallet af glioblastom celler, der har passeret filteret til undersiden ^9,10.
7. Hvis afbilde "3D. "Invasion assay (beskrevet i afsnit 3), generere en Z stak serie ved hjælp af en fluorescerende laser konfokal mikroskop ^5-6 Til billedet den invasive cellepopulation på undersiden af filteret, skal du følge protokollen trin 4,2-4,6 beskrevet ovenfor.

Representative Results

Brug metoderne her, har vi vist, at mikroglia og makrofager væsentligt kan stimulere glioblastom celle invasion. To forskellige invasion assays anvendes og er afbildet i figur 1. I figur 2 blev GL261 celler, som konstitutivt udtrykker det fluorescerende protein mCherry udpladet på præcoatede kamre med og uden mikroglia i 48 timer. GL261 celler minimalt invasiv på deres egne men når de dyrkes med mikroglia den invasive kapacitet steg med ca. 10 gange.

Vi observerer en lignende effekt ved hjælp af humane cellelinjer. I figur 3 U87-celler (farvet med 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) grøn) viser 5-6 gange højere invasion når samdyrket med differentierede THP-1-celler. THP-1 er en human monocytisk cellelinie (afledt af en akut monocytisk leukæmi patient), der kan være differentiated til en makrofag-lignende tilstand vha phorbolmyristatacetat (PMA) ^15. Differentierede THP-1 celler udviser mange af de karakteristika af humane makrofager såsom cytokinsekretion og evnen til at udføre fagocytose.

Alternativt kan celleinvasion måles ved indlejring dem i matrix og udpladning dette direkte på filteret i et kammer insert. Laser konfokal mikroskopi kan anvendes til at fremstille en serie billeder, der frembringer en tredimensionel repræsentation (Z-stack). Svarende til hvad der observeres i matrixen-coatede kammer assay (vist i figur 2 - 3), den cokultur af mikroglia (farvet med CMPTX rød) stimulerer GL261 celler (CMFDA grøn) at invadere som målt ved antallet af celler, som har krydset til undersiden af filteret (Figur 4). Dette format har den yderligere fordel af at kunne visualisere potentielle celle-celle interaktioner mellem gliobiastom celler og mikroglia under invasion. Faktisk mikroglia synes at arbejde tæt sammen med de gliom celler suspenderet i 3D matrix (figur 5). Hvis der kræves kun endpoint analyse og en laser konfokal er ikke til rådighed til brug, kan celle kamre rengøres som beskrevet for de matrix coatede kamre. Så antallet af de resterende (invasive) celler kan bestemmes ved tælling under anvendelse af billeder opnået fra en standard epifluorescensmikroskop. Movie 1 viser den tredimensionale samling af et sådant assay.

Figur 1:. Skematisk af to forskellige protokoller til analyse Mikroglia / makrofag-stimuleret glioblastoma Cell Invasion Top panel illustrerer pre-coated matrix kammer invasion assay (afsnit 2). Bundpanel illustrerer 3D matrix invasion assay (afsnit 3). Figur tilpasset fra9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Mikroglia (MG) Forbedre GL261 glioblastoma Cell Invasion. (A) Repræsentative billeder af invaderende GL261 celler (udtrykker mCherry) i fravær (venstre panel, GL261 alene) eller tilstedeværelse af mikroglia (højre panel, GL261 + MG) blev kombineret og udsået på matrix-coatede kamre, efterfulgt af inkubation i 48 time og derefter evaluering af antallet af celler, der har passeret filteret. Billeder taget med 10X mål. Scale bar = 400 uM. (B) Kvantificering af assayet kun medregner invasive GL261 celler (rød). De viste data er gennemsnit ± standardfejl fra tre uafhængige forsøg. (C) Kvantificering af mikroglia-stimuleret GL261 invasion i presence af farmakologiske hæmmere gefitinib (5 uM), JNJ-28.312.141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM). De viste data er gennemsnit ± SEM fra seks uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. THP1 Makrofager Enhance U87 glioblastoma celleinvasion. (A) Repræsentative billeder af invaderende U87 celler farvet med CMFDA grøn udpladet på matrix-coatede kamre alene (venstre panel, U87) eller med differentierede THP1 makrofager (højre panel; U87 + THP1), efterfulgt af inkubation i 24 timer og derefter evaluering af antallet af celler, der har passeret filteret. Billeder taget ved anvendelse af et 10X objektiv. Scale bar = 400 um. (B) Kvantificering af assayet kun medregnetinvasive U87-celler (grøn). De viste data er gennemsnit ± SEM fra ti uafhængige forsøg.

. Figur 4. 3D Invasion Assay af GL261 og microgliale cokultur (A) Billeder viste er fremskrivninger fra en Z-serie af billeder af GL261 celler (farvet med CMFDA grøn) indlejret i matrix alene (venstre panel, GL261) eller med murine mikroglia ( mærket med CMPTX rød, højre panel, GL261 + MG). Z-fremspring var af de nederste 4 udsnit af billedet stakken som omfatter bunden af ​​kammeret filter og repræsenterer derfor invasive celler. Scale bar = 200 uM. (B) Kvantificering af GL261 celler (grøn) bestemt til at være på undersiden af filteret som beskrevet ovenfor. Det samlede antal invaderende GL261 celler blev bestemt og normaliseret til den i GL261 celler i monokultur. De viste data repræsenterer gennemsnit ± SEM af 3 uafhængige forsøg, udført i to eksemplarer (figur tilpasset fra ^10). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Billede fra en Slice i 3D Stak af GL261 (grøn) og Mikroglia (rød) cokultur Indlejret i Matrix. GL261 og mikroglia celle-interaktioner er fremhævet med hvide pile. Scale bar = 100 uM.

Film 1:. Glioblastoma og Mikroglia Interaction in 3D Rotation omkring X-aksen af en 3D projektion af hele Z serie af billeder taget fra GL261 (grøn) og mikroglia (rød) cokultur indlejret i matrix. Skiver er i 5 uM intervaller. Klik her for at se denne video.

Discussion

Den stærkt invasive karakter høje kvalitet astrocytomer og glioblastoma gør disse hjernecancere meget dødbringende. Det er derfor af afgørende betydning for at forstå de molekylære og cellulære mekanismer glioblastom invasion. Meget er blevet lært om processen med glioblastom invasion allerede ^17. Brug af assay-formater er beskrevet i dette dokument, har vores laboratorium vist i både murine og humane modeller, tumorassocierede makrofager kan stimulere gliom celleinvasion 5 - 10 gange. Denne cokultur model trofast replikerer evne glioblastom celler til fysisk interagerer med makrofager / mikroglia som ville give mulighed for parakrine og juxtacrine interaktioner (via ligand-receptor-systemer såsom Notch-Delta og Ephrin-Ephs), der er potentielt involveret i tovejskommunikation mellem tumorceller og makrofager. Øvrige testformater der søger at opdage effekten af ​​makrofager på gliom celleinvasion har typisk cellernefysisk adskilt som makrofagerne udplades på bunden af brønden og glioblastomceller er på kammeret ^3,4. Derfor er disse undersøgelser viser en mere beskeden stigning i makrofag-stimuleret gliom invasion (2 gange). Denne cokultur assay forbedrer denne effekt (5 - 10 gange) sandsynligvis om betydningen af ​​juxtacrine interaktioner under makrofag / microglia stimuleret glioblastom invasion.

Protokollen er skitseret i grønbogen omfatter flere trin, der skal udføres omhyggeligt for at opnå tilfredsstillende resultater. Hvis forsøget udføres som beskrevet her, og ingen invaderende celler ses, kan det fluorescerende farvestof er udløbet, som vil føre til meget svag eller ikke-eksisterende farvning. For invasionen assays under anvendelse af de præcoatede kamre, er det vigtigt at bruge friske invasion kamre, som ikke forbi udløbsdatoen og er blevet holdt frosset hele tiden indtil udførelse af eksperimentet. Chambers, der blev efterladtved stuetemperatur i over 12 timer viste sig at være utilfredsstillende ved, at matrixen barriere ikke længere var intakt og celler invaderet på et langt højere frekvens end normalt. For 3D-assay, er det helt afgørende at holde alle pipetter og rør på is. Hvis ved stuetemperatur i en længere periode, vil matrixen polymerisere og kan ikke anvendes til resuspendering af cellerne i det. Det anbefales, at en lille bakke fyldt med is bruges i hætten til at holde alle materialer, som vil komme i kontakt med matricen. Protokollen kan modificeres til at indbefatte en højere celletæthed, men dette kan påvirke længden af ​​tid, der kræves for at se den optimale effekt på gliom invasion. Det ville være interessant at se, om der kan tilføjes andre celletyper i cokultur analysen, og hvilke potentielle virkninger, de kan have på invasion. Endelig anerkender vi, at hjernen mikromiljø er unik og vanskelig at replikere in vitro. En begrænsning ved denne protokol er at invasionen lmAmbers anvendt her mangler de typiske komponenter af normal hjerne, som glioblastom celler vil støde på under invasion (dvs. tætpakkede neuroner og astrocytter). Selv med dette forbehold, den stimulerende virkning af makrofager / mikroglia i dette assay er i overensstemmelse med, hvad der observeres in vivo og kan anvendes til at forudsige, hvilke inhibitorer og / eller proteiner kan forstyrre denne proces.

Efterligning tumormikromiljøet i kultur er en skræmmende opgave i betragtning af hvor mange varierede celletyper og matrix proteiner er til stede i tumorer på forskellige stadier af malignitet. Endnu rimelig nøjagtig in vitro modeller for tumor interaktion med komponenter i mikromiljøet vil i høj grad lette opdagelsen af nye terapeutiske veje. Det er nu klart, at celler, såsom makrofager spiller en kritisk rolle i flere aspekter, der er forbundet med progression til malignitet herunder angiogenese, invasion, immun unddragelse og medikamentresistens. p-pillerneULTUR invasion assay beskrives her bruger forholdet af tumorceller til makrofager, der er observeret hos patienter med højkvalitets glioblastomer (ca. 3: 1; ^5). Det er blevet vist, at evnen hos makrofager / mikroglia at stimulere glioblastom invasion er afhængig af CSF-1R og EGFR-signalering som farmakologisk inhibering af disse veje under anvendelse JNJ-28.312.141, PLX3397 (CSF-1R) og gefitinib (EGFR) dæmper stærkt stigningen i invasionen ^9. Endvidere hjælp af den integrerede matrix assay blev det påvist, at Semapimod, et lille molekyle vides at målrette makrofager og mikroglia, kan også blokere mikroglia stimuleret glioblastoma invasion ^10. Resultater fra disse cokultur eksperimenter gav stødet til at validere disse forbindelser ved hjælp af in vivo modeller. I overensstemmelse med data fra de in vitro-assays beskrevet i dette papir, blokade af CSF-1R med hæmmeren PLX3397 (som krydser blod-hjerne-barrieren) stort set blokeretevne GL261 gliomaceller at invadere i hjernerne hos C57BL / 6-mus ^9. Tilsvarende Semapimod afgives til hjernen blev vist at inhibere invasion og at virke synergistisk med standard strålebehandling i høj grad forlænge overlevelsen af mus, der huser GL261 tumorer ^10. Begge disse fremgangsmåder kan vise sig effektiv i klinikken.

Det er nu godt forstås, at makrofag-systemet er ganske vigtigt for udviklingen af forskellige kræftformer malignitet ^{3-6, 11-13.} Det er blevet klart fastslået i bryst- og hjerne modeller, tumor-associerede makrofager er kritiske for tumor celle invasion og metastase. Desuden makrofager sandsynligvis være meget vigtigt for mediering immune escape som makrofager (og celler med beslægtet afstamning, såsom dendritiske celler) fungerer som professionelle antigen-præsenterende celler, som orkestrerer adaptiv immunitet som reaktion på infektion ^18. Det er nu klart, at en af ​​den normale physiological funktioner adaptive immunsystem er at forhindre ukontrolleret proliferation ved at ødelægge afvigende celler. Immunitet mod tumorcellerne skyldes sandsynligvis det faktum, at den meget mutagene natur cancercellen genererer neo-antigener, der genkendes som fremmed af det adaptive immunsystem. Faktisk processen med "immun unddragelse" postuleres at være en vigtig del af malignitet som kræftceller nødt til at forhindre immunsystemet (især cytotoksiske lymfocytter, naturlige dræberceller og inflammatoriske makrofager) i at ødelægge tumoren. Det er håbet, at analysen er beskrevet i dette dokument vil letter studiet af glioblastom interaktion med makrofager og potentielt tillade en udvidelse af de typer af spørgsmål, vi kan tage fat om ondartet kræft ved hjælp af in vitro kultur assays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix	Corning/Fisher Scientific	Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)	Life Technologies	12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C34552
CellTracker Green CMFDA Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C2925
GL261 cell line	National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line	American Tissue Type Culture Collection	HTB-14
THP-1 cell line	American Tissue Type Culture Collection	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack.	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS)	Life Technologies	Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisherscientific	BP1600-100
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich	P8139-1MG