Abstract
Glioblastoma multiforme (grado IV glioma) è un tumore umano molto aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 1 anno dopo la diagnosi. Nonostante la maggiore comprensione degli eventi molecolari che danno origine a glioblastomi, questo tipo di tumore rimane ancora molto refrattario al trattamento convenzionale. La resezione chirurgica dei tumori cerebrali di alto grado è raramente completa a causa della natura altamente infiltrante di cellule di glioblastoma. approcci terapeutici che attenuano l'invasione delle cellule di glioblastoma è quindi un'opzione attraente. Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i macrofagi e microglia tumore (macrofagi cerebrali residenti) fortemente stimolare glioblastoma invasione associati. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato per modellare glioblastoma-macrofagi / microglia interazione mediante saggi in vitro di cultura. Questo approccio può facilitare notevolmente lo sviluppo e / o la scoperta di farmaci che interrompono la comunicazione con i macrofagi che permette a questo behav malignaior. Abbiamo stabilito due robusti saggi co-coltura di invasione dove microglia / macrofagi stimolano l'invasione delle cellule di glioma da 5 - 10 volte. cellule di glioblastoma marcate con un marcatore fluorescente o esprimono costitutivamente una proteina fluorescente sono placcati senza e con macrofagi / microglia su inserti camera policarbonato matrice rivestite o incorporati in una matrice tridimensionale. invasione cellulare viene valutata mediante microscopia a fluorescenza ad immagine e contare le cellule invasive solo sulla parte inferiore del filtro. L'utilizzo di questi test, diversi inibitori farmacologici (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, e Semapimod), sono stati identificati che bloccano macrofagi / microglia stimolata glioblastoma invasione.
Introduction
Glioblastoma multiforme è un cancro aggressivo cervello umano con una sopravvivenza media di circa 12 mesi dal momento della diagnosi 1,2. Glioblastoma è uno dei tumori più letali e clinicamente impegnativi in quanto è refrattario alla chemioterapia standard e la resezione chirurgica. La natura diffusa del glioblastoma permette alle cellule tumorali di diffondersi in tutto il cervello normale rendendo il tumore avanzato praticamente impossibile chirurgicamente resecare completamente. Questo aspetto altamente invasiva è una caratteristica segno distintivo di glioblastoma e altri astrocitomi avanzate. Pertanto, l'attenzione di molte ricerche è stato sul meccanismo molecolare di invasione delle cellule di glioblastoma. Il microambiente tumorale glioblastoma gioca un ruolo fondamentale nella creazione di malignità 3-6. Tumore associato macrofagi / microglia hanno dimostrato di essere responsabile della promozione di glioblastoma invasione 7,8. La maggior parte di questi studi tuttavia misurato l'effetto di macrofagi / microglia usandosaggi che fisicamente li separano dalle cellule di glioblastoma. Il nostro laboratorio ha stabilito per generare saggi miglioramento che ci permettono di studiare come glioblastoma invasione dipende macrofagi / microglia in co-colture e ci consentono di immagine l'interazione fisica tra di loro durante l'invasione.
saggi classici per misurare l'invasione delle cellule includono i chemiotassi camera di Boyden "standard" e formati chemioinvasione. Qui le cellule da studiare sono placcati in una camera di plastica che contiene un filtro di policarbonato sul fondo che ha pori di una dimensione specificata (in genere tra 0,4 e 8 micron di diametro). Il processo di invasione delle cellule comporta una barriera fisica, generalmente composto da proteine della matrice extracellulare. Nel saggio chemioinvasione, la matrice preferito utilizzato è Matrigel (di seguito denominato "matrice"), una miscela di proteine della matrice extracellulare secreta dalle Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma ed è costituito in gran parte di collagen tipo IV e laminina. Le camere vengono poi poste in un pozzo di coltura tissutale, che contiene mezzi di coltura cellulare, con o senza fattori di crescita che sono sospettati di stimolare l'invasione. Le cellule che hanno una maggiore capacità invasiva invaderanno attraverso il filtro rivestito matrice extracellulare ad una frequenza superiore e aderire alla parte inferiore del filtro. Abbiamo modificato questo test al fine di valutare il ruolo della microglia e macrofagi tumore associati su invasione delle cellule di glioblastoma.
Siamo stati in grado di determinare con saggi co-coltura descritti in questo documento che la microglia possono stimolare l'invasione di due linee cellulari di glioblastoma da 5 - 10 volte 9,10. Questo riflette ciò che viene osservato in modelli animali di glioblastoma. Inoltre, abbiamo sviluppato un saggio a tre invasione tridimensionale in cui le interazioni tra cellule di glioblastoma e macrofagi / microglia possono essere esaminate in modo più diretto. L'entità della invasione delle cellule di glioblastoma stimolato da macrophaGes / microglia nel dosaggio 3D è paragonabile a quello che si vede usando l'approccio camera di matrice rivestita. Test simili sono stati precedentemente sviluppato per studiare le interazioni di carcinoma della mammella con macrofagi durante l'invasione 11-13. Entrambi i metodi descritti in questo documento dovrebbe aiutare nella capacità di sezionare il meccanismo molecolare (s) di macrofagi / microglia stimolata invasione delle cellule di glioblastoma.
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Protocol
1. Etichettatura fluorescente di cellule
Linee cellulari di glioblastoma Label e microglia con coloranti fluorescenti 9: NOTA. In alternativa, generare linee cellulari che esprimono costitutivamente proteine fluorescenti come la GFP / RFP come descritto in 14.
- cellule piastra su una piastra 6 bene tale che essi saranno in 70 - 80% confluenti il giorno della colorazione. Per la linea murino di cellule di glioblastoma GL261 e la linea U87 di cellule di glioblastoma umano, piatto 1 x 10 6 e 1,5 x 10 6 cellule, rispettivamente, su un piatto di 6 centimetri 24 ore prima della colorazione.
- Preparare la soluzione colorante fluorescente macchia cellule in DMSO e aggiungere colorante 5 micron a mezzi di comunicazione, sia di medie Roswell Park Memorial Institute (RPMI) o macrofagi siero libero Medium (MSFM), vortex bene.
- Incubare le cellule con la tintura per 30 minuti a 37 ° C e 5% CO 2.
- Rimuovere colorante supporti contenenti e aggiungere mezzi freschi (RPMI o MSFM) alle cellule.
- Incubare le cellule per 30 min. Nota: Le cellule sono oramacchiata e pronto per essere utilizzato nell'esperimento.
2. Pre-rivestito Assay Matrix Camera coculture Invasion
- Differenziare le cellule THP-1 usando acetato forbolo miristato (PMA) 15.
- Tavola 2 - 3 x 10 5 THP-1 le cellule in 1,5 ml di RPMI / 10% FBS in una piastra di coltura 6 bene. Subito dopo la placcatura aggiungere 100 nM PMA e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
NOTA: Dopo 48 ore, cellule THP-1 che hanno superato differenziazione saranno aderente e diffuso al fondo del pozzo assumere una morfologia rotonda. - Rimuovere PMA lavando una volta con PBS 1x e sostituirlo con fresco RPMI / 10% FBS. Aspetta un altro 48 ore fino a quando le cellule sono pronte per l'uso in test.
- Tavola 2 - 3 x 10 5 THP-1 le cellule in 1,5 ml di RPMI / 10% FBS in una piastra di coltura 6 bene. Subito dopo la placcatura aggiungere 100 nM PMA e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
- Equilibrare matrice camere di pre-rivestiti mettendoli in un pozzetto contenente 500 ml di mezzi da solo (senza siero) e l'aggiunta di 500 ml di mezzi da solo verso l'alto. Incubare camere per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
Tabella dei materiali / attrezzature. - Per staccare delicatamente le cellule (linee di cellule di glioblastoma fluorescente e le microglia / macrofagi), rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione. Lavare le cellule sul piatto con 2 mM EDTA / PBS. Aggiungere 500 ml di 2 mM EDTA / PBS e incubare per 5 - 10 min in un incubatore cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
- Risospendere le cellule in 5 ml di supporti contenenti 0,3% di sieroalbumina bovina (BSA).
- Centrifugare per 5 min a 120 x g.
- Aspirare il surnatante e risospendere pellet in mezzi BSA MSFM / 0,3% (per celle GL261 e microglia) o RPMI / 0.3% BSA (per U87 e cellule THP-1) tale che la concentrazione di cellule è pari a 1 x 10 6 cellule / ml . Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.
- Aggiungere 500 microlitri media / 0.3% BSA per pozzetto di 24 pozzetti.
- Rimuovere i supporti dalle camere che sono state equilibrate per almeno 2 ore (fase 2.2). luogo Chambers in pozzetto contenente 500 microlitri media / 0,3% di BSA (passo 2,7).
- Se inibitori vengono utilizzati per studiare il loro effetto sulla macrofagi / microglia stimolati glioma invasione, aggiungere la concentrazione appropriata sia inferiore e superiore porzioni della camera.
NOTA: Le concentrazioni di CSF-1R inibitore utilizzato per inibire completamente microglia stimolata GL261 glioblastoma invasione può essere trovato in riferimento 9. - A seconda delle linee cellulari, aggiungere le cellule nella camera superiore come descritto nei due passaggi successivi: glioblastoma mouse (2.10.1) e glioblastoma umano (2.10.2).
- Mescolare 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellule (150 ml) e 5 x 10 4 microglia mouse (50 ml) (vedere il punto 2.6 per i dettagli dei media). Portare il volume a 500 ml con l'aggiunta di 300 ml MSFM / 0,3% di BSA. Aggiungere miscela di cellule nella camera superiore e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
NOTA: microglia murino sono isolati da topi neonati come ho descritton 1 6.
- Mescolare 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellule (150 ml) e 5 x 10 4 microglia mouse (50 ml) (vedere il punto 2.6 per i dettagli dei media). Portare il volume a 500 ml con l'aggiunta di 300 ml MSFM / 0,3% di BSA. Aggiungere miscela di cellule nella camera superiore e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
Mescolare 7.5 x 10 4 U87 (glioblastoma) cellule (75 ml) e 2,5 x 10 4 THP1 (macrofagi) cellule (25 ml). Portare il volume a 500 ml con l'aggiunta di 400 ml RPMI / 0,3% di BSA. Aggiungere la miscela di cellule nella camera superiore. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore.
- Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera di aspirando delicatamente e fissare camere mettendo in 3,7% di formaldeide in PBS. Consentire camere di rimanere in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C). Rimuovere fissativo delicatamente aspirazione e sostituire con 500 microlitri PBS 1X. Procedere alla sezione 4 per l'analisi delle immagini.
NOTA: esperimento può essere messo in pausa in questo momento e salvato per l'imaging in 1x PBS. segnali colorante fluorescente possono essere rilevati fino a 2 settimane dopo la fissazione.
3. Invasione Assay "3D" -embedding glioma e macrofagi / microglia a Matrix
- mix di matrice Scongelare a 4 ° C durante la notte. Eseguire tutte le ulteriori manipolazioni che impiegano una matrice sul ghiaccio nel cappuccio.
- Preparare 10 mg / ml concentrazione di matrice nei media (MSFM o RPMI) con 0,3% BSA in ghiaccio.
NOTA: Archivio concentrazione della matrice è tipicamente circa 15 mg / ml. - Per preparare le celle (etichettate al punto 1) per la sospensione di Matrix, rimuovere i supporti dalle cellule mediante aspirazione. Lavare le cellule sul piatto con 2 mM EDTA / PBS. Aggiungere 500 ml di 2 mM EDTA / PBS alle cellule e incubare per 5 - 10 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Risospendere le cellule in 5 ml di supporti contenenti 0,3% di BSA.
- Centrifugare per 5 min a 120 x g.
- Aspirare il surnatante dai pellet. Risospendere pellet in media / 0.3% BSA tale che la concentrazione di cellule è uguale a 1 x 10 6 cellule / ml. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule.
- Aggiungere 1,5 x 10 5 cellule GL261 (in 150 ml) + 5 x 10 4 cellule microgliali (in 50 ml) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.Aggiungere 2 x 10 5 cellule GL261 (200 ml) in un tubo separato da microcentrifuga 1,5 ml.
NOTA: le cellule GL261 da solo senza microglia serve come controllo. - celle Spin in microcentrifuga per 5 min a 120 x g.
- Risospendere le cellule in 200 ml di matrice fredda su ghiaccio.
- Piatto 50 microlitri (50.000 cellule) sul centro del vano superiore dell'inserto camera di dimensione dei pori 8 mM.
- Incubare a 37 ° C per 30 minuti per la polimerizzazione a verificarsi.
- Aggiungere 200 microlitri mezzo privo di siero per la camera superiore e 700 microlitri di siero contenente terreno di crescita cellulare ai minori bene.
- Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.
- Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera di aspirando delicatamente e fissare camere mettendo in 3,7% di formaldeide in PBS. Consentire camere di rimanere in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C). Rimuovere fissativo delicatamente aspirazione e sostituire con 500 microlitri PBS 1X. Procedere alla sezione 4 FOanalisi delle immagini r.
4. Saggi di imaging
- Rimuovere camere da 3,7% di formaldeide e lavare in ben contenente fresco 500 microlitri PBS 1x.
NOTA: Non lasciare le camere si asciughino. - Usando un applicatore con punta di cotone, pulire delicatamente le cellule non invasive dalla porzione superiore del filtro (lato rivolto verso l'interno della camera) raschiando la superficie del filtro. Inizia con delicatezza e aumentare gradualmente la pressione. Fate questo almeno 3 volte per ogni camera.
- Mettere camere sia in un piatto fondo di vetro o di lasciare in un piatto ben 24.
- Collocare il campione sul palcoscenico di un epifluorescente o laser confocale microscopio a fluorescenza dotato di telecamera e l'acquisizione di immagini software di 9,10.
- Prendere diversi 10X o 20X immagini di campi rappresentative.
- Utilizzando un software di analisi delle immagini, come ad esempio ImageJ, contare il numero di cellule di glioblastoma che hanno attraversato il filtro alla parte inferiore 9,10.
- Se l'imaging del "3D. "Saggio di invasione (descritto nella sezione 3), generare una serie Z pila utilizzando un laser a fluorescenza confocale 5-6 Per un'immagine popolazione cellulare invasivo sul lato inferiore del filtro, seguire il protocollo passi 4.2 - 4.6 sopra descritto.
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Representative Results
Utilizzando i metodi descritti qui, abbiamo dimostrato che la microglia e macrofagi possono stimolare notevolmente l'invasione delle cellule di glioblastoma. Due diversi saggi di invasione sono impiegati e sono descritte nella Figura 1. Nella figura 2, le cellule GL261 che costitutivamente esprimono la proteina fluorescente mCherry sono stati piastrati su camere prerivestiti con e senza microglia per 48 ore. cellule GL261 erano minimamente invasiva per conto proprio ma quando coltivate con microglia la capacità invasiva è aumentata di circa 10 volte.
Osserviamo un effetto simile usando linee cellulari umane. In figura 3, le cellule U87 (colorate con 5-chloromethylfluorescein diacetato (CMFDA) verde) indica 5-6 volte superiore invasione quando messi in coltura con differenziate cellule THP-1. THP-1 è una linea umana monocitica cellulare (derivata da un paziente di leucemia monocitica acuta) che può essere differentiated in uno stato macrofago-come l'utilizzo di acetato di forbolo miristato (PMA) 15. Differenziate cellule THP-1 mostrano molte delle caratteristiche di macrofagi umani, come la secrezione di citochine e la capacità di effettuare fagocitosi.
In alternativa, l'invasione delle cellule può essere misurata incorporandoli in matrice e placcatura questo direttamente sul filtro in un inserto da camera. Laser microscopia confocale può essere usato per produrre una serie di immagini che produce una rappresentazione tridimensionale (Z-stack). Analogamente a quanto si osserva nel saggio camera di matrice rivestita (illustrata nelle figure 2 - 3), la co-coltura di microglia (colorate con CMPTX rosso) stimola cellule GL261 (CMFDA verdi) di invadere misurata dal numero di cellule che hanno attraversato alla parte inferiore del filtro (figura 4). Questo formato ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare potenziali interazioni cellula-cellula tra gliocellule blastoma e microglia durante l'invasione. Infatti, microglia sembrano associare strettamente con le cellule di glioma sospese in 3D a matrice (Figura 5). Se è richiesto solo analisi endpoint e confocale laser non è disponibile per l'uso, camere di cellule possono essere pulite come descritto per le camere di matrice rivestita. Allora il numero dei rimanenti cellule (invasivi) può essere determinato contando utilizzando immagini ottenute da un microscopio epifluorescente standard. Film 1 mostra tre assemblaggio tridimensionale di un tale test.
Figura 1:. Schema di due diversi protocolli per il saggio microglia / macrofagi stimolati Glioblastoma cellulare Invasion Pannello superiore illustra saggio di invasione camera di matrice pre-verniciato (sezione 2). Pannello inferiore illustra saggio di matrice invasione 3D (sezione 3). Figura adattato da9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La microglia (MG) Migliorare GL261 Glioblastoma cellulare Invasion. (A) Immagini rappresentative della invadere le cellule GL261 (che esprimono mCherry) in assenza (pannello di sinistra; GL261 da solo) o la presenza di microglia (pannello di destra; GL261 + MG) sono stati combinati e placcati in camere di matrice rivestita, seguita da incubazione per 48 hr e valutazione del numero di cellule che hanno attraversato il filtro. Immagini scattate con obiettivo 10X. Barra di scala = 400 micron. (B) Quantificazione del conteggio test solo le cellule GL261 invasive (rosso). I dati indicati sono media ± SEM di tre esperimenti indipendenti. (C) Quantificazione della microglia stimolata GL261 invasione nel Presence di inibitori farmacologici gefitinib (5 micron), JNJ-28.312.141 (10 micron), PLX3397 (1 micron), PLX5562 (1 micron). I dati indicati sono media ± SEM di sei esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. THP1 macrofagi Migliora U87 Glioblastoma cellulare Invasion. (A) Immagini rappresentative della invadere le cellule U87 colorate con CMFDA verde placcato in camere di matrice rivestita da solo (pannello di sinistra, U87) o con i macrofagi THP1 differenziate (pannello di destra; U87 + THP1), seguita da incubazione per 24 ore e poi la valutazione di il numero di cellule che hanno attraversato il filtro. Le immagini scattate con un obiettivo 10X. Scala grafica = 400 micron. (B) Quantificazione di contare solo testcellule U87 invasive (verde). I dati indicati sono media ± SEM da dieci esperimenti indipendenti.
. Figura 4. 3D Invasione del saggio di GL261 e microglia co-coltura (A) Le immagini mostrate sono proiezioni da una Z-serie di immagini di cellule GL261 (colorate con CMFDA verde) incorporati in una matrice da solo (a sinistra del pannello; GL261) o con microglia murina ( etichettato con CMPTX rosso; pannello di destra; GL261 + MG). Le Z-proiezioni erano delle 4 fette di fondo della pila di immagini che comprende il fondo della camera di filtro e rappresenta pertanto cellule invasive. Barra di scala = 200 pM. (B) Quantificazione di cellule GL261 (verde) determinato per essere sul lato inferiore del filtro come descritto sopra. Il numero totale di cellule GL261 invasione è stata determinata e normalizzata a quello delle cellule GL261 in monocoltura. I dati indicati rappresentano la media ± SEM di 3 esperimenti indipendenti, condotti in doppio (figura adattato da 10). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Immagine da una fetta all'interno dello stack 3D di GL261 (verde) e microglia (rosso) co-coltura incorporato in Matrix. GL261 e le interazioni delle cellule microgliali sono evidenziati con frecce bianche. Barra di scala = 100 micron.
Film 1:. Glioblastoma e microglia interazione in 3D Rotazione attorno all'asse X di una proiezione in 3D di tutta la serie Z di immagini tratte da GL261 (verde) e microglia (rosso) co-coltura integrato in maTrix. Fette sono in 5 micron incrementi. Cliccate qui per vedere il video.
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Discussion
La natura altamente invasiva di astrocitoma alto grado e glioblastoma rendono questi tumori cerebrali molto mortale. E 'quindi di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di glioblastoma invasione. Molto è stato imparato a conoscere il processo di glioblastoma invasione già 17. Utilizzando i formati di test descritti in questo documento, il nostro laboratorio ha dimostrato sia in mouse e modelli umani che di tumore associato macrofagi possono stimolare l'invasione delle cellule di glioma da 5 - 10 volte. Questo modello di co-coltura replica fedelmente la capacità delle cellule di glioblastoma di interagire fisicamente con i macrofagi / microglia che consentirebbe paracrini e juxtacrine interazioni (tramite sistemi ligando-recettore, come Notch-Delta e efrina-EPHS) che sono potenzialmente coinvolte nella comunicazione bidirezionale tra la cellule tumorali e macrofagi. Altri formati di analisi che cercano di scoprire l'effetto dei macrofagi sulla invasione delle cellule di glioma in genere hanno le celluleseparati fisicamente i macrofagi sono placcati sul fondo del pozzo e le cellule di glioblastoma sono sulla camera di 3,4. Di conseguenza, questi studi dimostrano un più modesto aumento della invasione glioma macrofagi-stimolata (2 volte). Questo test coculture migliora su questo effetto (5 - 10 volte) probabile che indica l'importanza delle interazioni juxtacrine durante macrofagi / microglia stimolata glioblastoma invasione.
Il protocollo descritto in questo documento prevede diversi passaggi che devono essere eseguite con attenzione per ottenere risultati soddisfacenti. Se l'esperimento viene eseguito come descritto qui e non le cellule invasori sono considerati, il colorante fluorescente potrebbe essere scaduto che porterà alla colorazione molto debole o inesistente. Per i saggi di invasione utilizzando camere prerivestiti, è indispensabile utilizzare camere invasione freschi che non sono oltre la data di scadenza e sono stati tenuti congelati per tutto il tempo fino l'esecuzione dell'esperimento. Camere che sono stati lasciatia temperatura ambiente per più di 12 ore sono risultati insoddisfacenti in quella barriera matrice non era più intatto e cellule invase ad una frequenza molto superiore al normale. Per il saggio 3D, è assolutamente essenziale per mantenere tutte pipette e provette su ghiaccio. Se a temperatura ambiente per un periodo significativo di tempo, la matrice polimerizzare e non può essere utilizzato per risospendere le cellule in esso. Si raccomanda che un piccolo vassoio con ghiaccio è utilizzato nella cappa per contenere tutti i materiali che entrano in contatto con la matrice. Il protocollo può essere modificato per includere una densità cellulare più elevato, tuttavia questo può influenzare il tempo necessario per vedere l'effetto ottimale su glioma invasione. Sarebbe interessante vedere se altri tipi di cellule possono essere aggiunti nel saggio co-coltura e quali effetti potenziali che possono avere sul invasione. Infine, riconosciamo che il microambiente del cervello è unico e difficile da replicare in vitro. Una limitazione di questo protocollo è che l'invasione chambre utilizzati qui mancano i componenti tipici di cervello normale che le cellule di glioblastoma si incontrano durante l'invasione (vale a dire, i neuroni densamente e astrociti). Anche se con tale riserva, l'effetto stimolante dei macrofagi / microglia in questo saggio è coerente con quanto osservato in vivo e può essere utilizzato per prevedere quali inibitori e / o proteine possono interferire con questo processo.
Imitando il microambiente tumorale nella cultura è un compito arduo dato il numero di vario tipi di cellule e proteine della matrice sono presenti nei tumori a vari stadi di malignità. Eppure ragionevolmente accurata in modelli in vitro di interazione del tumore con i componenti del microambiente sarebbe notevolmente facilitare la scoperta di nuove strade terapeutiche. Ora è apprezzato che le cellule come i macrofagi hanno un ruolo fondamentale in diversi aspetti connessi con la progressione di malignità tra cui l'angiogenesi, l'invasione, l'evasione immunitaria e la resistenza ai farmaci. il coculture saggio di invasione qui descritto utilizza il rapporto delle cellule tumorali di macrofagi che si osserva nei pazienti con glioblastomi di alto grado (circa 3: 1; 5). È stato dimostrato che la capacità di macrofagi / microglia stimolare glioblastoma invasione dipende CSF-1R e segnalazione EGFR l'inibizione farmacologica di questi percorsi utilizzando JNJ-28.312.141, PLX3397 (CSF-1R) e gefitinib (EGFR) attenua fortemente l'aumento nell'invasione 9. Inoltre, usando il saggio matrice incorporata, è stato dimostrato che Semapimod, una piccola molecola nota per indirizzare macrofagi e microglia, possono anche bloccare microglia stimolata glioblastoma invasione 10. I risultati di questi esperimenti co-coltura fornito l'impulso per convalidare questi composti utilizzando modelli in vivo. In linea con i dati dei test in vitro descritti in questo documento, il blocco di CSF-1R con il PLX3397 inibitore (che attraversa la barriera emato-encefalica) in gran parte bloccato lacapacità delle cellule di glioma GL261 di invadere nel cervello dei topi C57BL / 6 9. Allo stesso modo, Semapimod consegnato nel cervello ha dimostrato di inibire l'invasione e di sinergizzare con il trattamento standard di radiazioni a prolungare notevolmente la sopravvivenza dei topi che ospitano tumori GL261 10. Entrambi questi approcci può rivelarsi efficace nella clinica.
E 'ormai ben apprezzato il fatto che il sistema dei macrofagi è molto importante per la progressione di vari tumori alla malignità 3-6, 11-13. E 'stato chiaramente stabilito nei modelli di seno e il cancro al cervello che i macrofagi associati al tumore sono fondamentali per l'invasione delle cellule tumorali e metastasi. Inoltre, i macrofagi sono suscettibili di essere molto importante per mediare la fuga immunitario come i macrofagi (cellule e dei relativi stirpe come le cellule dendritiche) funzione di cellule professionali presentanti l'antigene che orchestrano l'immunità adattativa in risposta alle infezioni 18. Ora è chiaro che uno dei ph normalefunzioni ysiological del sistema immunitario adattativo è quello di prevenire la proliferazione incontrollata da distruggere le cellule aberranti. L'immunità verso le cellule tumorali è probabilmente dovuto al fatto che la natura altamente mutageno della cellula tumorale genera neo-antigeni che sono riconosciuti come estranei dal sistema immunitario adattativo. Infatti il processo di "evasione immune" è postulata essere una parte importante di malignità come le cellule tumorali devono evitare che il sistema immunitario (in particolare linfociti citotossici cellule killer naturali e macrofagi infiammatori) di distruggere il tumore. Si spera il test descritto in questo documento si facilita lo studio delle interazioni con glioblastoma macrofagi e potenzialmente consentire l'ampliamento delle tipologie di domande siamo in grado di affrontare sul cancro maligno utilizzando saggi in coltura in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
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