Abstract
Le glioblastome multiforme (grade IV gliome) est un cancer très agressif humain avec une survie médiane de diagnostic 1 an après. En dépit de la meilleure compréhension des événements moléculaires qui donnent lieu à des glioblastomes, ce cancer reste encore très réfractaire au traitement conventionnel. La résection chirurgicale des tumeurs cérébrales de haut grade est rarement complète en raison de la nature hautement infiltrant des cellules de glioblastome. Les approches thérapeutiques qui atténuent l'invasion des cellules de glioblastome est donc une option intéressante. Notre laboratoire et d'autres ont montré que la tumeur des macrophages et des cellules microgliales (macrophages résidents du cerveau) stimulent fortement l'invasion de glioblastome sont associés. Le protocole décrit dans le présent document est utilisé pour modéliser le glioblastome-macrophage / microglie interaction en utilisant des tests de culture in vitro. Cette approche peut grandement faciliter le développement et / ou la découverte de médicaments qui perturbent la communication avec les macrophages qui permet à cette behav maligneIOR. Nous avons établi deux essais d'invasion de coculture robustes où microglie / macrophages stimulent l'invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. les cellules de glioblastome marquées avec un marqueur fluorescent ou exprimant constitutivement une protéine fluorescente sont plaquées sans et avec les macrophages / microglie en polycarbonate inserts de chambre de matrice revêtue ou enrobée dans une matrice à trois dimensions. L'invasion cellulaire est évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence à l'image et compter uniquement les cellules invasives sur le côté inférieur du filtre. L'utilisation de ces essais, plusieurs inhibiteurs pharmacologiques (JNJ-28312141, PLX3397, géfitinib et Semapimod), ont été identifiés qui bloquent les macrophages / microglie stimulé l'invasion de glioblastome.
Introduction
Le glioblastome multiforme est un cancer du cerveau humain agressif avec une survie médiane d'environ 12 mois à partir du moment du diagnostic 1,2. Glioblastome est l'un des cancers les plus mortels et cliniquement difficile car il est réfractaire à une chimiothérapie standard et la résection chirurgicale. Le caractère diffus de glioblastome permet aux cellules tumorales de se propager dans le cerveau normal rendant la tumeur avancée pratiquement impossible de chirurgicalement réséquer complètement. Cet aspect très invasive est une caractéristique marque de glioblastome et d'autres astrocytomes avancées. Par conséquent, l'objet de beaucoup de recherches a été mis sur le mécanisme moléculaire de l'invasion des cellules de glioblastome. Le microenvironnement glioblastome tumorale joue un rôle essentiel dans l' établissement d'une tumeur maligne 3-6. Tumeur associée macrophages / microglie se sont révélés être responsable de la promotion glioblastome invasion 7,8. La plupart de ces études ont cependant mesuré l'effet des macrophages / microglie utilisantdes essais qui les séparent physiquement à partir des cellules de glioblastome. Notre laboratoire a défini pour générer des tests améliorés qui nous permettent d'étudier la façon dont l'invasion de glioblastome dépend de macrophages / microglie dans cocultures et nous permettent à l'image de l'interaction physique entre eux lors de l'invasion.
tests classiques pour mesurer l'invasion des cellules comprennent les Boyden chimiotaxie "standard" de la chambre et les formats de chemoinvasion. Ici, les cellules à étudier sont plaquées dans une chambre en matière plastique qui contient un filtre en polycarbonate sur le fond qui comporte des pores d'une taille donnée (généralement comprise entre 0,4 et 8 um de diamètre). Le processus d'invasion cellulaire implique une barrière physique, habituellement composé de protéines de la matrice extracellulaire. Dans l'essai de chemoinvasion, la matrice utilisée est préférée Matrigel (ci-après dénommée «matrice»), un mélange de protéines de la matrice extracellulaire sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de souris et se compose essentiellement de colType lagen IV et la laminine. Les chambres sont ensuite placées dans une culture bien de tissu qui contient des milieux de culture de cellules avec ou sans facteurs de croissance qui sont soupçonnés de stimuler l'invasion. Les cellules qui ont une capacité d'invasion ultérieure va envahir à travers la matrice extracellulaire filtre revêtu à une fréquence supérieure et adhèrent à la face inférieure du filtre. Nous avons modifié cet essai afin d'évaluer le rôle de la microglie et des macrophages associés à une tumeur sur l'invasion des cellules de glioblastome.
Nous avons été en mesure de déterminer en utilisant des tests de coculture décrits dans le présent document que les microglies peuvent stimuler l'invasion de deux lignées de cellules de glioblastome par 5-10 fois 9,10. Cela reflète ce que l'on observe dans les modèles animaux de glioblastome. En outre, nous avons développé un essai de trois invasion dimensions où les interactions entre les cellules de glioblastome et les macrophages / microglie peuvent être examinés plus directement. L'étendue de l'invasion des cellules stimulées par le glioblastome macrophaGes / microglie dans le test 3D est comparable à ce qui est vu en utilisant l'approche de la chambre de matrice recouverte. Des essais similaires ont déjà été mis au point pour étudier les interactions de carcinome du sein avec les macrophages lors de l' invasion 11-13. Les deux procédés décrits dans le présent document devraient contribuer à la capacité à disséquer les mécanismes moléculaires (s) de macrophages / microglies invasion stimulée par des cellules de glioblastome.
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Protocol
1. Le marquage fluorescent des cellules
Des lignées de cellules de glioblastome étiquettes et microglie avec des colorants fluorescents 9: NOTE. En variante, générer des lignées cellulaires qui expriment constitutivement les protéines fluorescentes telles que la GFP / DP comme décrit dans le 14.
- cellules de la plaque sur une plaque à 6 puits de telle sorte qu'ils seront 70 - 80% de confluence le jour de la coloration. Pour la lignée murine de cellules de glioblastome GL261 et cellules de glioblastome ligne U87 humaine, plaque 1 x 10 6 et 1,5 x 10 6 cellules, respectivement sur une boîte de 6 cm 24 heures avant la coloration.
- Préparer la solution de colorant fluorescent tache de cellules dans du DMSO et ajouter 5 uM de colorant aux médias, soit rpmi (RPMI) ou macrophage milieu sans sérum (MSFM), vortex bien.
- Incuber les cellules avec le colorant pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Retirez le support contenant des colorants et ajouter du milieu frais (RPMI ou MSFM) aux cellules.
- Incuber les cellules pendant 30 min. Note: Les cellules sont désormaisteinté et prêt à être utilisé dans l'expérience.
2. Dosage prélaqué Matrice chambre coculture Invasion
- Différencier cellules THP-1 en utilisant l' acétate de phorbol myristate (PMA) 15.
- Planche 2 - 3 x 10 5 cellules THP-1 dans 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS dans une plaque de culture 6 puits. Immédiatement après le placage ajouter 100 nM de PMA et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
NOTE: Après 48 h, THP-1 cellules qui ont subi avec succès la différenciation seront adhérentes et se propager au fond du puits prenant une morphologie ronde. - Retirer PMA par lavage une fois avec PBS 1x et remplacer avec des produits frais RPMI / 10% de FBS. Attendre une autre 48 heures jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à l'emploi dans le test.
- Planche 2 - 3 x 10 5 cellules THP-1 dans 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS dans une plaque de culture 6 puits. Immédiatement après le placage ajouter 100 nM de PMA et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
- Equilibrer la matrice des chambres de pré-revêtues en les plaçant dans un puits contenant 500 ul de milieu seul (sans sérum) et en ajoutant 500 ul de milieu seul vers le haut. Incuber les chambres pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
tableau des matériaux / équipement. - Pour les cellules (lignées cellulaires de glioblastome marquées par fluorescence et les microglie / macrophages) détacher doucement, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d' EDTA / PBS et incubation pendant 5 - 10 min dans un incubateur de cellules à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de sérumalbumine bovine (BSA).
- Centrifuger pendant 5 min à 120 x g.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans MSFM / 0,3% de milieu de BSA (pour les cellules de GL261 et la microglie) ou RPMI / 0,3% de SAB (pour U87 et cellules THP-1) , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml . Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
- Ajouter 500 ul media / 0,3% de BSA par puits de plaque à 24 puits.
- Retirez le support de chambres qui ont été équilibrées pendant au moins 2 h (étape 2.2). Lieu chambers en puits contenant 500 ul media / 0,3% de BSA (étape 2.7).
- Si les inhibiteurs sont utilisés pour étudier leur effet sur macrophage / microglie stimulé l'invasion de gliome, ajouter la concentration appropriée à la fois le fond et les parties supérieures de la chambre.
NOTE: Les concentrations de CSF-1R inhibiteur utilisé pour inhiber totalement la microglie stimulée GL261 glioblastome invasion peut être trouvée dans la référence 9. - Selon les lignées cellulaires utilisées, ajouter des cellules à la chambre supérieure comme décrit dans les deux étapes suivantes: glioblastome de la souris (2.10.1) et glioblastome humain (2.10.2).
- Mélanger 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastome) cellules (150 pi) et 5 x 10 4 microglies de souris (50 pi) (voir l' étape 2.6 pour plus de détails dans les médias). Amener le volume à 500 pi en ajoutant 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules dans la chambre supérieure et faire incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
NOTE: microglie murin sont isolées à partir de souris néonatales comme décrit in 1 6.
- Mélanger 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastome) cellules (150 pi) et 5 x 10 4 microglies de souris (50 pi) (voir l' étape 2.6 pour plus de détails dans les médias). Amener le volume à 500 pi en ajoutant 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules dans la chambre supérieure et faire incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
Mélanger 7,5 x 10 4 U87 (glioblastomes) des cellules (75 pi) et 2,5 x 10 4 THP1 (macrophage) des cellules (25 pi). Amener le volume dans 500 ul en ajoutant 400 pl RPMI / 0,3% de BSA. Ajouter le mélange de cellules à la chambre supérieure. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 24 heures.
- Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 pour l'analyse d'image.
NOTE: L'expérience peut être interrompue à ce moment et enregistré pour l'imagerie dans PBS 1x. des signaux de colorant fluorescent peut être détectée pendant jusqu'à 2 semaines après la fixation.
3. Invasion Assay "3D" -embedding gliome et Macrophages / microglie dans Matrix
- Décongeler mélange de matrice à 4 ° C pendant une nuit. Effectuer toutes autres manipulations à l'aide de la matrice sur la glace dans la hotte.
- Préparer 10 mg / ml de concentration de la matrice dans les médias (MSFM ou RPMI) avec 0,3% de BSA sur la glace.
NOTE: la concentration du stock de matrice est généralement autour de 15 mg / ml. - Pour préparer les cellules (marquées à l'étape 1) de suspension dans la matrice, retirer les supports des cellules par aspiration. Laver les cellules sur le plat avec 2 mM EDTA / PBS. Ajouter 500 ul de 2 mM d' EDTA / PBS aux cellules et incuber pendant 5 - 10 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu contenant 0,3% de BSA.
- Centrifuger pendant 5 min à 120 x g.
- Aspirer le surnageant de pastille. Resuspendre le culot dans du milieu / 0,3% de BSA , de telle sorte que la concentration des cellules est égale à 1 x 10 6 cellules / ml. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
- Ajouter 1,5 x 10 5 cellules GL261 (dans 150 ul) + 5 x 10 4 cellules microgliales (dans 50 ul) dans un tube de 1,5 ml.Ajouter 2 x 10 5 cellules GL261 (200 pi) dans un tube de 1,5 ml microfuge séparé.
NOTE: les cellules GL261 seul sans microglie sert de contrôle. - cellules de spin dans microcentrifugeuse pendant 5 min à 120 x g.
- Resuspendre les cellules dans 200 pi matrice froide sur la glace.
- 50 ul de la plaque (50.000 cellules) sur le centre du compartiment supérieur de la chambre 8 pm de taille de pore insert.
- Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour la polymérisation de se produire.
- Ajouter du milieu sans sérum 200 ul de la chambre supérieure et contenant un milieu de croissance cellulaire 700 ul de sérum dans le puits inférieur.
- Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
- Après incubation, éliminer les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixer des chambres en plaçant dans 3,7% de formaldéhyde dans du PBS. Les chambres permettent de rester dans un fixatif pendant 15 min à température ambiante (ou pendant une nuit à 4 ° C). Retirer fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 ul 1x PBS. Passez à la section 4 foanalyse de l'image r.
4. Imagerie Assays
- Retirer les chambres de 3,7% de formaldéhyde et laver à puits contenant 500 ul frais 1x PBS.
REMARQUE: Ne laissez pas les chambres à sécher. - L'aide d'un coton-tige, nettoyer doucement les cellules non-invasives de la partie supérieure du filtre (côté tourné vers l'intérieur de la chambre), en grattant la surface du filtre. Commencez doucement et augmenter progressivement la pression. Pour ce faire, au moins 3 fois par chambre.
- Placez chambres soit dans un plat à fond de verre ou de laisser dans une plaque 24 puits.
- Placer l' échantillon sur la scène d'un épifluorescence ou laser confocal microscope à fluorescence équipé d' une caméra et la capture d' image logiciel 9,10.
- Prenez plusieurs 10X ou 20X images de champs représentatifs.
- En utilisant un logiciel d'analyse d'image, comme ImageJ, compter le nombre de cellules de glioblastome qui ont traversé le filtre sur le côté inférieur 9,10.
- Si l'imagerie de la "3D. "Essai d'invasion (décrit dans la section 3), générer une série Z de pile à l' aide d' un laser fluorescent microscope confocal 5-6 Pour l' image de la population cellulaire invasive sur la face inférieure du filtre, suivez les étapes du protocole 04/02 à 04/06 décrit ci - dessus.
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Representative Results
En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la microglie et les macrophages peuvent stimuler considérablement l'invasion des cellules de glioblastome. Deux tests d'invasion différents sont utilisés et sont représentés sur la figure 1. Sur la figure 2, les cellules qui expriment constitutivement GL261 la protéine fluorescente mCherry ont été étalées sur des chambres de pré-enduit avec ou sans microglie pendant 48 heures. cellules GL261 étaient peu invasive sur leur propre mais lorsqu'elles sont cultivées avec microglie la capacité invasive a augmenté d'environ 10 fois.
On observe un effet similaire en utilisant des lignées cellulaires humaines. Sur la figure 3, les cellules U87 (colorées avec du 5-chlorométhylfluorescéine diacétate (CMFDA) vert) montre une invasion 6/5 fois plus élevé lorsque co - cultivées avec des cellules différenciées THP-1. THP-1 humaine est une lignée cellulaire monocytaire (provenant d'un patient atteint de leucémie monocytaire aiguë) qui peut être differentiated dans un état de type macrophage en utilisant l' acétate de phorbol myristate (PMA) 15. Differentiated cellules THP-1 présentent un grand nombre des caractéristiques des macrophages humains tels que la sécrétion de cytokines et la capacité de mener à bien la phagocytose.
En variante, l'invasion des cellules peut être mesurée par leur incorporation dans la matrice et le placage ceci directement sur le filtre dans un insert de chambre. La microscopie confocale laser peut être utilisé pour produire une série d'images qui produit une représentation en trois dimensions (Z-pile). Semblable à ce qui est observé dans l'essai de chambre matrice époxy (représentée sur les figures 2 - 3), la coculture de la microglie (colorées avec CMPTX rouge) stimule les cellules GL261 (CMFDA vert) pour envahir telle que mesurée par le nombre de cellules qui ont franchi à la partie inférieure du filtre (figure 4). Ce format a l'avantage supplémentaire d'être en mesure de visualiser les interactions potentielles cellule-cellule entre glioles cellules de la microglie et blastoma lors de l'invasion. En effet, les microglies semblent associer étroitement avec les cellules de gliome en suspension dans la matrice 3D (Figure 5). Si seule l'analyse point d'extrémité est requis et un microscope confocal laser ne sont pas disponibles pour l'utilisation, les chambres de cellules peuvent être nettoyées de la manière décrite pour la matrice revêtue chambres. Ensuite , le nombre de cellules restantes (invasives) peut être déterminée en comptant à partir d' images obtenues à partir d' un microscope à épifluorescence standard. Film 1 montre l'ensemble trois dimensions d'un tel essai.
Figure 1:. Schématiques de deux protocoles différents pour le dosage microglie / macrophages stimulés glioblastome cellules Invasion Top panel illustre l' invasion dosage de la chambre de matrice pré-enduit (section 2). Panneau inférieur illustre 3D test d'invasion de la matrice (section 3). La figure adaptée de9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. microglie (MG) Améliorer GL261 glioblastome cellulaire Invasion. (A) images représentatives de l' invasion des cellules GL261 (exprimant mCherry) en l'absence (de panneau de gauche; GL261 seul) ou en présence de la microglie (panneau de droite; GL261 + MG) ont été combinés et étalées sur des chambres de matrice à revêtement, suivie par une incubation de 48 h, puis l'évaluation du nombre de cellules qui ont traversé le filtre. Images prises avec objectif 10X. Barre d'échelle = 400 uM. (B) Quantification de dosage ne comptant que les cellules GL261 invasives (rouge). Les données présentées sont la moyenne ± ETM de trois expériences indépendantes. (C) Quantification de GL261 invasion microglie stimulée dans le presence d'inhibiteurs pharmacologiques gefitinib (5 uM), JNJ-28312141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM). Les données présentées sont la moyenne ± SEM de six expériences indépendantes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. THP1 Macrophages Améliorer U87 glioblastome cellulaire Invasion. (A) Des images représentatives de l' invasion des cellules U87 colorées avec CMFDA vert plaqué sur des chambres de matrice revêtu seul (panneau de gauche; U87) ou avec des macrophages THP1 différenciés (panneau de droite; U87 + THP1), suivie d' une incubation pendant 24 heures, puis l' évaluation des le nombre de cellules qui ont traversé le filtre. Images prises en utilisant un objectif 10X. Barre d' échelle = 400 uM. (B) Quantification de dosage ne comptant quecellules U87 invasives (vert). Les données présentées sont la moyenne ± SEM de dix expériences indépendantes.
. Figure 4. 3D Invasion Assay de GL261 et microglial coculture (A) Les images présentées sont des projections à partir d' un Z-série d'images de cellules GL261 (colorées avec CMFDA vert) incorporés dans la matrice seule (panneau de gauche; GL261) ou avec des microglies murin ( marqué avec CMPTX rouge; panneau de droite; GL261 + MG). Les Z sont des saillies du fond 4 de la pile de tranches d'image qui englobe la partie inférieure du filtre de la chambre et représente par conséquent les cellules invasives. Barre d'échelle = 200 uM. (B) Quantification des cellules GL261 (vert) déterminée comme étant sur le côté inférieur du filtre tel que décrit ci - dessus. Le nombre total de cellules envahissantes de GL261 a été déterminée et normalisées par rapport à celle des cellules dans GL261 monocultures. Les données indiquées représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes, effectuées en double (figure adaptée de 10). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. image à partir d' une tranche dans le Stack 3D GL261 (vert) et microglie (rouge) coculture embarqué dans Matrix. GL261 et interactions des cellules microgliales sont mis en évidence avec des flèches blanches. Barre d'échelle = 100 uM.
Film 1:. Glioblastome et microglie Interaction en 3D Rotation autour de l'axe X d'une projection 3D de toute la série Z des images prises à partir de GL261 (vert) et la microglie (rouge) coculture intégré dans matrix. Les tranches sont en 5 uM incréments. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
La nature hautement invasive des astrocytomes de haut grade et glioblastome rendre ces cancers du cerveau très meurtrière. Il est donc d'une importance primordiale pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l'invasion de glioblastome. On a beaucoup appris sur le processus de glioblastome invasion déjà 17. En utilisant les formats d'analyse détaillés dans ce document, notre laboratoire a montré à la fois la souris et des modèles humains que les macrophages associés aux tumeurs peuvent stimuler l'invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. Ce modèle de coculture reproduit fidèlement la capacité des cellules de glioblastome d'interagir physiquement avec les macrophages / microglie qui permettrait les interactions paracrines et juxtacrine (par l'intermédiaire de systèmes récepteur-ligand, tels que Notch-Delta et éphrine-Eph) qui sont potentiellement impliqués dans la communication bidirectionnelle entre l' les cellules tumorales et les macrophages. D'autres formats d'essais visant à découvrir l'effet des macrophages sur l'invasion des cellules de gliome ont typiquement des cellulesphysiquement séparés les macrophages sont plaquées sur le fond du puits , et les cellules de glioblastome sont sur la chambre de 3,4. Par conséquent, ces études montrent une augmentation plus modeste dans l'invasion de gliome macrophage stimulée (2 fois). Ce test de coculture améliore cet effet (5-10 fois) ce qui indique probablement l'importance des interactions juxtacrine pendant macrophage / microglie stimulé l'invasion de glioblastome.
Le protocole décrit dans ce document comporte plusieurs étapes qui doivent être réalisées avec soin pour obtenir des résultats satisfaisants. Si l'expérience est réalisée comme décrit ici et pas de cellules envahissantes sont considérées, le colorant fluorescent peut avoir expiré qui conduira à une coloration très faible, voire inexistante. Pour les essais d'invasion en utilisant les chambres pré-enduit, il est essentiel d'utiliser des chambres d'invasion frais qui ne sont pas passé la date d'expiration et ont été conservés congelés tout le temps jusqu'à ce que l'exécution de l'expérience. Chambers, qui ont été laissésà la température ambiante pendant plus de 12 heures se sont révélées insatisfaisantes en ce que la matrice barrière était plus intactes et les cellules envahies à une fréquence beaucoup plus élevée que la normale. Pour le test 3D, il est absolument essentiel de garder toutes les pipettes et tubes sur la glace. Si, à la température ambiante pendant une période de temps significative, la matrice va polymériser et ne peut être utilisée pour remettre en suspension les cellules dans elle. Il est recommandé qu'un petit bac rempli de glace est utilisé dans la hotte pour contenir tous les matériaux qui entreront en contact avec la matrice. Le protocole peut être modifié pour inclure une densité cellulaire plus élevée, mais cela peut affecter la durée de temps nécessaire pour voir l'effet optimal sur l'invasion de gliome. Il serait intéressant de voir si d'autres types de cellules peuvent être ajoutés dans le dosage de coculture et quels effets potentiels qu'ils peuvent avoir sur l'invasion. Enfin, nous reconnaissons que le microenvironnement du cerveau est unique et difficile à reproduire in vitro. Une limitation de ce protocole est que l'invasion chambres utilisés ici manquent des composants typiques de cerveau normal lequel les cellules de glioblastome rencontreront lors de l' invasion (c. -à- neurones denses et astrocytes). Même si , avec cette mise en garde, l'effet stimulant des macrophages / microglie dans cet essai est conforme à ce qui est observé in vivo et peut être utilisé pour prédire quels inhibiteurs et / ou des protéines peuvent interférer avec ce processus.
Imitant le microenvironnement de la tumeur dans la culture est une tâche ardue étant donné le nombre varié de types cellulaires et des protéines de la matrice sont présents dans les tumeurs à différents stades de malignité. Pourtant raisonnablement précis dans des modèles in vitro de l' interaction de la tumeur avec des composants du microenvironnement faciliterait grandement la découverte de nouvelles avenues thérapeutiques. Il est maintenant reconnu que les cellules telles que les macrophages jouent un rôle critique dans plusieurs aspects associés à la progression de tumeurs malignes, y compris l'angiogenèse, l'invasion, l'évasion immunitaire et la résistance aux médicaments. Le cocULTURE essai d'invasion décrit ici utilise le rapport des cellules tumorales aux macrophages qui sont observés chez les patients atteints glioblastomes de haut grade (environ 3: 1; 5). Il a été montré que la capacité des macrophages / microglies pour stimuler l'invasion de glioblastome est dépendante du CSF-1R et la signalisation de l'EGFR que l'inhibition pharmacologique de ces voies à l'aide JNJ-28312141, PLX3397 (CSF-1R) et le gefitinib (EGFR), atténue fortement l'accroissement dans l' invasion 9. En outre, en utilisant le test de la matrice intégrée, il a été démontré que Semapimod, une petite molécule connue pour cibler les macrophages et les cellules microgliales, peut également bloquer l' invasion de cellules microgliales stimulé 10 glioblastome. Les résultats de ces expériences de coculture ont donné l'impulsion pour valider ces composés en utilisant des modèles in vivo. Conformément aux données des essais in vitro décrits dans le présent document, le blocage de CSF-1R avec le PLX3397 inhibiteur (qui traverse la barrière hémato - encéphalique) largement bloqué laGL261 capacité des cellules de gliome envahisse dans le cerveau des souris C57BL / 6 9. De même, Semapimod délivrée dans le cerveau a été montré pour inhiber l' invasion et une synergie avec un traitement par rayonnement standard prolongeant considérablement la survie de souris portant des tumeurs de 10 GL261. Ces deux approches peuvent se révéler efficaces dans la clinique.
Il est maintenant bien apprécié que le système de macrophage est très important pour la progression de divers cancers à la malignité 3-6, 11-13. Il a été clairement établi dans des modèles de cancer du sein et du cerveau que les macrophages associés aux tumeurs sont critiques pour l'invasion des cellules tumorales et des métastases. En outre, les macrophages sont susceptibles d'être très importante pour la médiation immunitaire fuite que les macrophages (et des cellules de la lignée apparentée telles que des cellules dendritiques) fonctionnent comme des cellules présentatrices d'antigène professionnelles qui orchestrent l' immunité adaptative en réponse à une infection 18. Il est maintenant clair que l'un des ph normalefonctions ysiological du système immunitaire adaptatif est d'empêcher la prolifération incontrôlée en détruisant les cellules aberrantes. L'immunité contre les cellules tumorales est probablement due au fait que le caractère hautement mutagènes de la cellule cancéreuse génère des néo-antigènes qui sont reconnus comme étrangers par le système immunitaire adaptatif. En effet, le processus de «l'évasion immunitaire» est postulé pour être une partie importante de la malignité que les cellules cancéreuses ont besoin pour prévenir le système immunitaire (en particulier les lymphocytes cytotoxiques, les cellules tueuses naturelles et les macrophages inflammatoires) de détruire la tumeur. On espère que le test décrit dans cet article sera facilite l'étude de l' interaction avec les macrophages glioblastome et potentiellement permettre l'expansion des types de questions que nous pouvons aborder au sujet du cancer malin en utilisant dans des essais de culture in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
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