Abstract
Tredimensjonal (3D) kulturen er en mer fysiologisk relevante metode for å modellere oppførselen celle in vitro enn todimensjonale kultur. Karsinomer, inkludert brystkarsinomer, er komplekse 3D vev sammensatt av kreft epitelceller og stromale komponenter, inkludert fibroblaster og ekstracellulære matriks (ECM). Men de fleste in vitro-modeller av bryst-karsinom bestå bare av kreft epitelceller, utelatelse av stroma og derfor 3D-arkitekturen av en tumor in vivo. Passende 3D modellering av carcinoma er viktig for presis forståelse av tumorbiologi, adferd og respons på behandling. Imidlertid er varigheten av kulturen og volum av 3D-modeller begrenset av tilgjengeligheten av oksygen og næringsstoffer i kulturen. Heri viser vi en fremgangsmåte hvor brystkreft epitelceller og stromale fibroblaster er innlemmet i ECM for å generere en 3D-brystkreft surrogat som inneholder stroma og kan dyrkes som enfast 3D-struktur, eller ved hjelp av en perfusjon bioreaktor system for å levere oksygen og næringsstoffer. Følgende oppsett og en innledende vekstperioden, kan surrogater brukes til prekliniske narkotika testing. Alternativt kan de cellulære og matriks-komponenter av surrogat modifiseres for å ta opp en rekke biologiske spørsmål. Etter at kulturen blir surrogater fiksert og bearbeidet til parafin, på en måte som ligner på behandlingen av kliniske bryst karsinom prøver, for evaluering av parametere av interesse. Evalueringen av en slik parameter, tettheten av celler som er tilstede, er beskrevet, hvor ImageJ og CellProfiler bildeanalyse programvaresystemer blir tilført mikrofotografier av histologiske snitt av surrogater for å kvantifisere antallet kjerneholdige celler pr området. Dette kan brukes som en indikator på endringen i celletallet over tid, eller forandringen i celletallet som følge av varierende vekstbetingelser og behandlinger.
Introduction
Tredimensjonale (3D) kultur modeller som mer nøyaktig etterligner svulsten arkitektur og mikromiljøet in vivo er viktig for studier med sikte å dissekere det komplekse samspillet mellom celler og deres mikromiljøet og for å teste effekten av kandidat terapi. Tumor dimensionality påvirker oksygen og næringsstoffer gradienter, ensartethet av legemiddeleksponering, interstitiell trykk / blodstrøm, og 3D-arkitektur 1-4. Tilstedeværelsen av en passende stromal mikromiljø bidrar til tumor dimensjonalitet og påvirker celle-ECM-signalisering og parakrin signalering mellom stromale celler og maligne epitelceller. Effektene av svulst dimensjonalitet og mikromiljøet på cellular funksjon er godt etablert, med begge faktorer forandre narkotika respons 1,3,5-8. I tillegg cellulære vekstkinetikk, metabolske priser og cellesignalisering skiller mellom todimensjonal (2D) kultur og kultur i 3D, med disse faktorene Affecting cellulær respons 1,3,8-10.
In vitro, kan svulsten surrogat mikromiljøet moduleres ved å ta representative ECM bestanddeler og stromale cellepopulasjoner. Ondartede epitelceller er påvirket av ECM og kreft-assosiert stromale celler enten i en synergistisk / beskyttende måte for å fremme tumorprogresjon eller i en undertrykkende måte for å hemme ytterligere tumorutbredelse 5,6,10. I begge sammenheng kan stroma påvirke behandlingsrespons og legemiddelavlevering via parakrin signalering og / eller ved å øke trykket interstitielt i tumoren som resulterer i redusert medikamentavgivelse 1,6. Derfor vil tilsetning av ECM og stromale celler inn i prekliniske modeller hjelp rekapitulere aspekter av tumor som ikke kan modelleres godt i 2D kultur.
Heri en metode for å etablere brystkreft surrogater som inneholder en recapitulative mikromiljøet, blant annet ECM bestanddeler og stromal celler, i et 3D-volum, er beskrevet. I bryst karsinom, er det stromale cellepopulasjon overveiende består av kreft forbundet fibroblaster (CAF) og stromal ECM er i stor grad består av kollagen type I med en mindre andel av matriks-komponenter som er funnet i basalmembranen, inkludert laminin og kollagen type IV 1,4,11-13. Derfor er disse komponentene av brystkreft mikromiljøet (dvs. CAF, kollagen jeg, og basalmembran) har blitt innarbeidet i surrogater. Denne fremgangsmåten kan brukes til å generere faststoff, un-perfusert 3D surrogater (figur 1A) eller kan tilpasses til å omfatte perfusjon av medium gjennom surrogat via en bioreaktor system (figur 1B). Begge tilnærmingene er beskrevet her. Denne metoden kan også bli modifisert for å inkludere andre stromale elementer, så som tumor-assosierte makrofager, eller for å modellere andre faste tumorer ved å justere de cellulære og ECM-komponenter, etter behov.
Aktuelle analyse av de surrogater er avgjørende for å oppnå relevant informasjon angående cellulær funksjon i respons til behandling eller andre manipulasjoner. Surrogater kan bli analysert ved forskjellige metoder, inkludert direkte avbildning av intakte surrogater ved hjelp av konfokal mikroskopi eller andre former for ikke-invasiv avbildning, indirekte cellulær analyse ved analysering av kondisjonerte medier, eller perfusatet, for utskilte produkter eller analyse på histologiske snitt etter fiksering og prosessering tilparafin. En slik parameter som kan evalueres på histologiske snitt er celletetthet. Vi presenterer en metode for å måle celletetthet (dvs. antallet kjerneholdige celler pr tverrsnittsarealet) ved hjelp av semi-automatisert bildeprosesseringsteknikker anvendt på mikrofotografier av surrogat histologiske snitt farget med hematoksylin og eosin (H & E). Celletettheten kan bli brukt som en indikator for den relative endringen i celletallet over tid, eller som et resultat av varierende vekstbetingelser og behandlinger.
Figur 1. 3D-volum og bioreaktor systemet. A) Skjematisk av prosessen for å generere solide 3D surrogater. Øverst: tegneserie av solid 3D volum som inneholder ECM (rosa), epitelceller carcinoma celler (gul), og CAF (oransje); Bunn:. Ovenfra 8-brønn kammer lysbilde som inneholder surrogater B) Skjematisk av prosessen for å generere dynket 3D surrogater. Top: cartoon av 3D-volumet med kanaler for å tillate medium perfusjon og som inneholder ECM (rosa), epitelceller carcinomceller (gul), og CAF (oransje); Midten: bilde av PDMS strømningskanalen inneholder PDMS skum (svart pil) skal injiseres med celle + ECM og gjennomsyret av polymer-belagt rustfritt ståltråder (rosa pil) som måler 400 mikrometer i diameter; Bunn:. Bildet av PDMS strømningskanal inneholdende et surrogat og koblet til bioreaktoren system for å muliggjøre kontinuerlig medium perfusjon (peristaltisk pumpe og media reservoaret ikke vist) C) bilder fra behandlingstrinn for både faste og perfuserte surrogater etter kultur. Venstre: bilde av cryomold inneholder prøven behandlingen gel og surrogat; Midten: bilde av en parafinblokk som inneholder et fast og behandlet surrogat; Høyre:. Bilde av en glassplate med en H & E-fargede histologisk snitt av en surrogat Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture
- Tine BM komponent natten ved 4 ° C, på is.
- Varme medium til 37 ° C. For å støtte vekst av både 231 celler og CAF, bruker Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) pluss 10% føtalt bovint serum (FBS).
Merk: Mediene brukes vil være avhengig av celletype og eksperimentelle mål. - Fjern medium fra kulturen fatet (10 cm) av nær konfluent 231 celler og tilsett 1,5 ml Trypsin / EDTA. Inkuber i 1 til 3 minutter ved 37 ° C, overvåking for celle løsgjøring. Når cellene begynner å runde og kommer av platen, stopp reaksjonen ved å tilsette 3 ml av medium inneholdende serum. Pipetter medium og celler i et 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger medium og celler ved 150 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten, og re-suspen cellepelleten i 2 ml medium.
- Tell antall celler pr volum ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer. Celleviabilitet bør være større enn 90%.
- GjentaProsessen med andre celletyper som skal inngå i surrogat. For surrogat som er beskrevet her, blir prosessen gjentatt med den CAF.
- Bestemme den passende volum av hver cellesuspensjon for å oppnå det ønskede antall celler.
Merk: For surrogat som er beskrevet her, en celletetthet på 2,1 x 10 6 celler pr 100 ul ECM, med et 2: 1 forhold av epitelceller til fibroblaster (1,4 x 10 6 231 celler og 7 x 10 5 CAF per 100 ul ECM), blir brukt. Denne celletetthet er et godt utgangspunkt; Imidlertid vil den optimale celletettheten er avhengig av celletype, varigheten av kulturen, og målene for eksperimentet. - Plasser det passende volum av hver cellesuspensjon inn i en 15 ml konisk rør (ett rør for hver celletype). Sentrifuger medium og celler ved 150 xg i 5 minutter.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten, re-suspendere en celletype i cellekulturkvalitet vann (178,8 ul, se tabell 1) og den andre celletype i 10x DMEM (100 ul, se tabell 1, som inneholdt fenolrødt for å overvåke pH). Plasser rørene inneholdende cellene på is og gå raskt til fremstilling av ECM nedenfor. Begrense tiden at cellene forblir i vann for å bevare levedyktighet.
Merk: Begge 10x DMEM og cellekultur grade vann er nødvendige komponenter av ECM; Derfor har vi valgt å re-suspendere celler i begge. Her vilkårlig valgte vi å re-suspendere 231 celler i cellekultur grade vann og CAF i 10x DMEM, selv om begge celletype kan være re-suspendert i en av disse to komponentene.
2. Fremstilling av celler i ECM (6 mg / ml bovint Collagen Type I + 10% BM)
Merk: En ECM bestående av 90% collagen I + 10% BM ble valgt for å modellere invasiv brystkreft fordi svulsten stroma i denne malignitet består hovedsakelig av kollagenI med komponenter av BM, slik som laminin, kollagen IV, og entactin, som omfatter en mindre del av ECM 12,13,18,19.
- På is, legge til komponentene som er oppført i tabell 1, i rekkefølge, inn i et 2 ml mikrosentrifugerør.
Merk: Dette beløpet er nok til 8 faste surrogater eller ved hjelp av bioreaktor systemet beskrevet her, 4 perfuserte surrogater.
| Fremstilling av celler i ECM (6 mg / ml bovint Collagen Type I + 10% BM) | |
| 178,8 μl | Cellekulturkvalitet vann inneholdende det ønskede antall av 231-celler (bestemt ovenfor) |
| 606 mikroliter | Collagen I (10 mg / ml storfe), legg dråpe for dråpe |
| 100 pl | Basalmembran, tinte |
| 100 pl | 10x DMEM (som inneholdt fenolrødt) med det ønskede antall CAF (bestemt ovenfor) |
| 15.2 mL | 7,5% (volum / volum) natriumbikarbonat, tilsett dråpevis |
Tabell 1. Tilberedning av celler i ECM.
- Bland forsiktig med pipettering, unngå dannelse av bobler. Overvåk pH-nivået ved hjelp av fenol rødt i 10x DMEM. Sjekk at blandingen er en oransje / rosa farge som indikerer en pH av ~ 7. Dersom pH er for lav (for gul), langsomt tilsette ytterligere 7,5% natriumbikarbonat en dråpe om gangen (~ 5 mL) inntil den riktige fargen er nådd.
- Hold blandingen på is og arbeide raskt for å forhindre for tidlig ECM polymerisasjon.
3. Surrogat Forberedelse
- For faste 3D kulturer (Figur 1a):
- Arbeid i en cellekultur hetten med steril teknikk, merke lokket av en steril 8-brønn kammer lysbilde for å indikere noen eksperimentelle variasjoner i surrogater.
- Å holde kammeret lysbildet på is for å forhindre for tidlig polymerisering ECM, langsomt pipette 100 ul av celle + ECM blandingen i hver brønn av den 8-brønns kammer lysbilde.
Merk: pipettering celle + ECM blanding rundt kantene av brønnen første bidrar til å bedre fordele celle + ECM blanding i brønnen. - Inkuber surrogater ved 37 ° C, 5% CO2 i 45 min for å tillate ECM polymerisasjon.
- Etter ECM polymerisering, tilsett 100 ul kulturmedium til hver brønn og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 i løpet av eksperimentetendring av dyrkningsmedium annenhver dag.
- For perfuserte 3D-kulturer i bioreaktor et system (figur 1B):
- Sterilisere alle reaktorkomponenter for 3D-kultur-konfigurasjonen (dvs. bioreaktor, rør, tang, og beslag som er nødvendige for bioreaktor oppsett) ved hjelp av den fremgangsmåten som er spesifikke for bioreaktor som skal brukes.
- For eksempel bioreaktor system anvendes her, bruker en kombinasjon av autoklavering (f.eks, 12 minutter eksponering ved 121,1 ° C med 15 min tørking) og inkubering i 70% etanol i 1 time.
- Forbered og montere den delen av bioreaktor systemet som skal huse surrogat.
- For eksempel bioreaktor systemet som brukes her, setter en PDMS skum ryggrad inn i PDMS strømningskanalen tubing bruker tang. Skyv fire (400 mikrometer) polymerbelagt rustfritt stål ledningene inn i PDMS skum for å generere parallelle microchannels.
- I en cellekultur hette, ved hjelp av sterile teknikk og en 26 gauge nål med sprøyte, injiserer celle + ECM blandingen i området av perfusjonen bioreaktor er utformet for å inneholde celler. Fortsett raskt til neste trinn.
- For å sikre en mer jevn fordeling av celler i surrogater, plasserer bioreaktoren komponenthuset surrogater inn i et 50 ml konisk rør (under cellekulturen hette) og kontinuerlig rotere på ~ 18 rpm mens inkubering ved 37 ° C i 45 minutter for å tillate ECM polymeriseringen.
Merk: Rotasjon kan gjennomføres ved anvendelse av en rotator i kuvøse eller en ovn med en innebygd rotator slik som en hybridiserings-ovn innstilt på 37 ° C. - Koble bioreaktor enheten inneholder surrogat til perfusjon pumpen ved hjelp av produsentens instruksjoner.
Merk: De nærmere detaljer i denne prosessen vil variere avhengig av bioreaktoren og pumpe som brukes.- For eksempel bioreaktor systemet som brukes her, fjerne rustfritt stål ledninger før du kobler bioreactor enheten til pumpen.
- Start medium perfusjon (bulk strømningshastighet på 167,1 mL / min, mikrokanalveggskjærspenning av en dyn / cm 2) i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
Merk: Hastigheten for mediet perfusjonen kan bli justert, avhengig av bioreaktoren oppsett og målene og utformingen av forsøket. - Fortsett medium perfusjon i løpet av eksperimentet, endring av dyrkningsmediet hver syvende dag.
- Sterilisere alle reaktorkomponenter for 3D-kultur-konfigurasjonen (dvs. bioreaktor, rør, tang, og beslag som er nødvendige for bioreaktor oppsett) ved hjelp av den fremgangsmåten som er spesifikke for bioreaktor som skal brukes.
4. Surrogat Fiksering og Processing (figur 1C)
- Merk cryomolds og kassetter plast vev for surrogat fiksering og behandling.
- Deretter EnCase surrogater i prøvebehandlings gel, som er en vandig materiale som er flytende ved høye temperaturer, men størkner ved romtemperatur. Prøven behandling gel hjelper til å holde surrogater intakt under behandling og forenkler histologisk seksjonering 14,20-22.
- Smelte prøven behandlingen gel i et 60 ° C vannbad for å kondensere den, og holder ved denne temperatur inntil den er klar til bruk. Flytt bioreaktor med surrogat til en biosikkerhet kabinett.
- Pipetter ca. 300 ul prøvebehandlings gelen inn i bunnen av det merkede cryomold (figur 1C, venstre panel).
- Ved hjelp av en skalpell blad (nr 10 foretrukket) og pinsett forsiktig fjerne surrogat fra bioreaktor eller fra brønnen av en 8-brønn kammer lysbilde og plassere den i cryomold inneholder prøven behandling gel.
Merk: Tissue merking fargestoffer (se Materialer / utstyrsliste for et spesifikt eksempel) av forskjellige farger kan brukes for å markere surrogater, for derved å tillate flere prøver som skal inngå i en vev kassett på en identifiserbar måte. - Pipetter ca. 300 pl prøven behandling av gelen for å dekke surrogat i cryomold og inkuber ved 4 ° C i 30 minutter for å solidify.
- Når prøven behandling gel har stivnet, tar prøven behandling gel som inneholder surrogat fra cryomold, og plassere den i en vev kassett.
- Plasser vev kassetten som inneholder den surrogat i 10% nøytral buffret formalin for 10 til 12 timer ved romtemperatur for å tillate fullstendig fiksering.
- Etter fiksering, flytte vev kassett som inneholder surrogat til 70% etanol til bearbeides til parafin.
Merk: Overføre surrogat fra formalin til etanol forhindrer over-fiksering med formalin som kan føre til tap av immunreaktivitet av noen epitoper 23. Lengden av tiden i etanol er ikke kritisk. Denne endringen av fiksativ er viktig hvis surrogat vil bli brukt for immunhistokjemi eller immunfluorescens. Den faste surrogat er nå klar for behandling til parafin (figur 1C, midtre panel). Denne behandling utføres vanligvis i et vev prosessor plassert i en ca.opriately utstyrt histologi laboratorium. En kortere program er anbefalt på grunn av størrelsen og delikat natur surrogater. 24
5. Seksjonering og H & E Farging (figur 1C, høyre panel)
- Etter behandlingen av surrogater til en parafin blokk, seksjon dem ved hjelp av en standard mikrotom for seksjonering av formalinfikserte, parafininnstøpte vev 24,25.
Merk: Dette kan utføres på en kvalifisert histologi laboratorium, eller i et forskningslaboratorium, hvis riktig utstyrt og erfarne. Tykkelsen av de histologiske snitt kan variere avhengig av den tilsiktede bruk av seksjonene; men vi bruker vanligvis deler som er 5 mikrometer i tykkelse. PDMS skum som brukes her i perfuserte surrogater enkelt seksjonert med en mikrotom. - Plasser seksjoner på vanlig glass histologiske lysbilder.
- Etter seksjonering, bake histologiske snitt på 58 ° C i 10-12 timer for å forberede seg på fargingmed hematoksylin og eosin (H & E). Baking smelter parafin og gir også bedre etterlevelse av seksjoner til glass-slide.
- H & E farging:
- Sett opp stasjonene som er beskrevet i tabell 2 i Coplin krukker eller glass fargings retter, avhengig av antall lysbilder til flekken. Når reagenser er satt opp, flytte seksjonene gjennom hver stasjon, i rekkefølge, ruger for tiden angitt nedenfor 24.
- Monter en dekkglass til hvert lysbilde med feste medier.
- Tillat monterings media tørke før bildebehandling.
| H & E Farging | ||
| Stasjon | Løsning | Tid |
| 1 | xylen | 5 min |
| 2 | xylen | <td> 5 min|
| 3 | xylen | 5 min |
| 4 | 100% etanol | 5 min |
| 5 | 100% etanol | 5 min |
| 6 | 95% Etanol | 5 min |
| 7 | 95% Etanol | 5 min |
| 8 | Spring vann | 5 min |
| 9 | Avionisert vann | 5 min |
| 10 | hematoxylin 7211 | 5 min |
| 11 | Spring vann | 5 min |
| 12 | Clarifier * | 10 dips |
| * Richard Allan # 7401 eller 70% etanol + 0,5% HCl | ||
| 1. 3 | Spring vann | 5 min |
| 14 | bluing Reagens | 30 sek |
| 15 | Spring vann | 5 min |
| 16 | 95% Etanol | 10 dips |
| 17 | Eosin Y | 1 min |
| 18 | 95% Etanol | 10 dips |
| 19 | 95% Etanol | 10 dips |
| 20 | 100% etanol | 10 dips |
| 21 | 100% etanol | 10 dips |
| 22 | 100% etanol | 5 min |
| 23 | xylen | 10 dips |
| 24 | 5 min | |
Tabell 2. H & E farging.
6. Måling celletetthet
- Bilde minst en hel H & E beiset histologisk snitt av surrogat hjelp lysfelt mikroskopi ved 400x forstørrelse, sparer bildene som TIF-filer.
Merk: Bildebehandlings beskrevet har bare blitt gjennomført ved hjelp av fargebilder. Mens uprøvd, mener vi det samme behandlingen bør også være aktuelt for gråtonebilder. - Last CellProfiler fra Broad Institute 26 (http://cellprofiler.org/download.shtml) og ImageJ fra National Institutes of Health (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), som begge som er offentlig tilgjengelig uten ekstra kostnader.
- For å måle arealet av surrogat i hvert bilde, åpen ImageJ, velg "Set Målinger" (under fanen "Analyze"), velg "Area", og velg deretter "OK & #34 ;.
- Åpne et bilde (.tif-fil) av surrogat. Bruke polygonverktøyet i ImageJ (se figur 2), skissere området av surrogat i bildet ved å dra musen og klikke for å gjøre ankerpunkter. Bruk kantene på ECM som en veiledning. Når skissert, velg "Mål" under "Analyser" -fanen.
Figur 2. ImageJ analyse. Skjermbilde av ImageJ behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Gjenta for hvert bilde av vevet surrogat. Lagre målinger og tilhørende bilde identifikatorer til et regnearkprogram.
- Last opp bildefiler som brukes til å måle området i ImageJ inn CellProfiler ved å dra bildefilene til "File List". Tildele et navn til bildene importert iden "NamesAndTypes" inngangsmodul og velg bildetypen (dvs. "Color Image").
Figur 3. CellProfiler eksempel rørledning. Skjermbilde av rørledningen designet for å måle antall kjerneholdige celler i CellProfiler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Lag en analyse rørledning som inneholder følgende moduler for å beregne antall celler per bilde, ved å klikke på "+" tegnet ved siden av "Adjust Module" (figur 3, nederst på venstre panel). Legge til hver av modulene nedenfor.
- Velg "ColorToGray" (figur 4).
- Velg inngangsbildenavnet fra rullegardinmenyen, navnet på utskriftsbildet og velge originalbildetype (<em> dvs. RGB hvis fargebilde inngang).
Merk: Denne modulen vil ikke være nødvendig hvis du bruker gråtonebilder
- Velg inngangsbildenavnet fra rullegardinmenyen, navnet på utskriftsbildet og velge originalbildetype (<em> dvs. RGB hvis fargebilde inngang).
- Velg "ImageMath" (figur 5).
- Velg "Inverter" operasjon, navngi utgang bilde, og velg gråtonebilde i "select første bildet" -kategorien.
- Velg "IdentifyPrimaryObjects" (figur 6).
- Velg inngangs bilde (bilde etter matte korreksjon), navngi den primære objektet som skal identifiseres (kjerner), og skriv inn diameterområdet for objektene som skal måles i piksel enheter (ca. 25 til 65). Velg "adaptive" terskel strategi med "Otsu" thresholding metoden med "tre klasser". Ikke endre noen andre parametere fra standardinnstillingene.
Merk: Optimal rekke diametre bør bestemmes ved å åpne et bilde i inngangsbildet modulen og måling av diameteren av kjerner (dvs.den primære formål) ved hjelp av målelengden verktøyet.
- Velg inngangs bilde (bilde etter matte korreksjon), navngi den primære objektet som skal identifiseres (kjerner), og skriv inn diameterområdet for objektene som skal måles i piksel enheter (ca. 25 til 65). Velg "adaptive" terskel strategi med "Otsu" thresholding metoden med "tre klasser". Ikke endre noen andre parametere fra standardinnstillingene.
- Velg "IdentifySecondaryObjects" (figur 7).
- Velg inngangsbildet (bildet etter matte korreksjon), velger inngangs objekter (kjerner), og navngi gjenstandene for å bli identifisert (celler). Velg "forplantning" metode for å identifisere sekundære objekter, bruke "adaptive" terskel strategi og "Otsu" metoden med "to klasser" minimere "vektet varians". Velg "ingen glatting" og en terskel korreksjonsfaktor på 1, nedre og øvre grenser for 0 og 1, og en regularisering faktor på 0,05. Ikke endre noen andre parametere fra standardinnstillingene.
- Velg "MeasureObjectSizeShape" (Figur 8).
- Velger celler (sekundær objekt) og kjerner (primære objekt) som de gjenstander som skal måles.
- Velg "FilterObjects" (figur 9
- Navn utgangs objektene og velg kjerner (primære objekt) som objektet for å filtrere.
- Hold de neste to parametere som per standardinnstillingene. Velg "AreaShape" som måle å filtrere etter kategori, og "formfactor" som målingen.
- Velg "Ja" for å filtrere ved hjelp av et minimum måleverdi og legge til en minimumsverdi på 0,52.
- Velg "Nei" for å filtrere ved hjelp av en maksimal måling.
- Velg "Ja" for å beholde konturene av filtrerte gjenstander og navngi den skisserte bildet.
- Velg "ColorToGray" (figur 4).
- Velg "ExportToSpreadsheet" (figur 10)
- Velg hvor du vil lagre filen, og navnet "Output filer".
- Etter analysen rørledning er generert (trinn 6.7.1 til 6.7.7.1), start "Test Mode" i CellProfiler og vurdere hvert trinn, herunder at kjernen i testbildet er riktig filtrert, for å sikre optimal pameterne ble valgt for å identifisere celler. Figur 11 viser et utgangsbilde fra CellProfiler etter filtrering, hvor kjerner er riktig identifisert (innringet i grønt), og bakgrunnen er filtrert ut.
- Når parametrene er evaluert og fast bestemt på å være tilstrekkelig, lagre prosjektet, og klikk deretter på "Analyze bilder". Dette prosjektet kan brukes flere ganger for fremtidig analyse.
Merk: Når parametrene er etablert, er programmet satt til å analysere alle bildene i "File List", sekvensielt. Dette vil resultere i flere vinduer som åpner for hvert bilde analyseres, noe som fører til en lengre behandlingstid.- For å unngå en lengre behandlingstid, klikker du på ikonet øye på alle moduler unntatt "ExportToSpreadsheet" under "Analysis moduler" -delen.
- Når alle surrogat bildene er behandlet av CellProfiler, åpne regnearket som inneholder bildedata som genereres av Cell Profiler og regnearket som inneholder området målt med ImageJ. Kopier de filtrerte kjerner data (kolonne D i CellProfiler regneark) og bilde identifikatorer (kolonne R) og lime dem inn i regneark som inneholder de målte området data.
- Beregn summen av alle målingene som oppnås for antallet kjerner pr bilde av surrogat.
- Beregn summen av målingene erholdt for surrogat området fra hvert bilde av surrogat. Del totale arealet målt med 1x10 6.
- Dividere det totale antall kjerner av det totale arealet måling i trinnet ovenfor for å oppnå en verdi for antall celler pr 1x10 6 piksler 2.
Figur 4. CellProfiler rørledning: endre bildet til gråtoner Skjermbilde av "ColortoGray" modul..s: //www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig4highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. CellProfiler rørledning.. Invertere bilde Skjermbilde fra "ImageMath" modul Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. CellProfiler rørledning.. Identifisering kjerner Skjermbilde fra "IdentifyPrimaryObjects" modul Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. CellProfiler rørledning.. Identifisere celler Skjermbilde fra "IdentifySecondaryObjects" modul Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. CellProfiler rørledning.. Måleobjekter Skjermbilde fra "MeasureObjectSizeShape" modul Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. CellProfiler rørledning. Filtrering gjenstander Skjermbilde av "FilterObjects "modul. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. CellProfiler rørledning.. Eksportere data Skjermbilde fra "ExportToSpreadsheet" modul Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11. CellProfiler utgang etter filtrering. Skjermbilde av produksjonen skjermen i celle profiler følgende objekt filtrering. Klikk her for å se et større Versipå denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både faste og perfuserte 3D brystkreft surrogater ble fremstilt som beskrevet ovenfor og dyrket i 7 dager. Deretter surrogater ble fiksert, bearbeidet til parafin, seksjonert og farget med hematoksylin og eosin, som beskrevet ovenfor. Antallet nukleerte celler per område (både 231 celler og CAF) av hvert surrogat ble målt. Som kan sees i figur 12, representative mikrofotografier av H & E-fargede seksjoner viser en høyere konsentrasjon av celler som er tilstede i de perfuserte surrogater (figur 12A) i forhold til de faste surrogater (figur 12B), selv om tettheten av celler innledningsvis inkorporert i surrogater var den samme i både faste og perfuserte betingelser. Denne visuell representasjon av cellevekst er støttet av en høyere gjennomsnittlig antall celler per areal (tetthet) i det perfuserte surrogater (n = 3) i forhold til de faste surrogater (n = 3), som bestemt ved than CellProfiler analyse (figur 12C). For å oppnå dataene i figur 12C, ble en komplett histologisk tverrsnitt av hver surrogat avbildes, krever flere bilder for hver surrogat, og bildene ble analysert som beskrevet ovenfor. Deretter ble det totale antall kjerner for hver surrogat dividert med det totale arealet av surrogat (uttrykt som antall kjerner / 1 x 10 6 piksler 2), som gir en celletetthet for hver surrogat. For å validere bruk av CellProfiler for kjernedannelse celle kvantifisering ble resultatene ved hjelp av CellProfiler programmet sammenlignet med de som ble oppnådd ved ganske enkelt å manuelt å telle antallet celler tilstede per område i hver av de 6 surrogater (tabell 3). Den celletetthet på hver surrogat ble beregnet som beskrevet ovenfor. Ingen signifikant forskjell ble funnet i celletettheter som oppnås ved manuell telling og CellProfiler analyse for enten perfuserte surrogater (p = 0,855) eller faste surrogater ( p = 0,553). For å understøtte at forskjellen i celletetthet mellom de faste og perfundert surrogater korrelerer med en forskjell på cellevekst, ble celleformering av hver surrogat evaluert via immunohistokjemisk analyse av Ki-67 merking (figur 12D) 27. Den samme tendensen ble funnet, med en betydelig høyere andel av voksende celler i perfuserte surrogater (n = 3) i forhold til det solide surrogater (n = 3), noe som indikerer en høyere vekst i perfuserte surrogater og korrelere med økt celletetthet av disse surrogater. Mens celletype (dvs. brystkreft epitel eller CAF) ble ikke undersøkt i disse målingene, farging for celletypespesifikke markører kan brukes for bedre å forstå den vekst eller fordeling av en spesifikk cellepopulasjon. Protokoller detaljering denne prosessen har tidligere blitt publisert 25,28.
les / ftp_upload / 54004 / 54004fig12.jpg "/>
Figur 12. Representative Resultater. A) Representant bilde av en H & E-fargede delen fra en dynket surrogat dyrket i 7 dager (400X opprinnelig forstørrelse). B) Representant bilde av en H & E-fargede delen fra en solid surrogat dyrket i 7 dager med medium endret hver 2 dager (400X opprinnelig forstørrelse). C) Sammenligning av det midlere antall av kjerneinneholdende celler per område, eller celletettheten, etter 7 dager vekst av perfusert (ingen endring av mediet) og faste surrogater (media endret etter 2 dager). D) Sammenligning av ki- 67-merkeindeksen (dvs. prosentandelen av celler i en populasjon som uttrykker Ki-67), er et mål på celleproliferasjon, etter 7 dager vekst av perfusert og faste surrogater. Data representerer gjennomsnittet ± SEM, n = 3 per tilstand, ** indikerer p≤0.01 og *** angir p≤0.001 (t-test).tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperiment | CellProfiler: kjernedannet celler per område | Manuell: kjernedannet celler per område | Gjennomsnittlig CellProfiler | Gjennomsnittlig Manual | P-verdi (unpaired t Test) |
| Dynket Surrogat 1 | 88,178 | 75,532 | 97,225 | 99,901 | 0,855 |
| Dynket Surrogat 2 | 107,528 | 117,812 | |||
| Dynket Surrogat 3 | 95,967 | 106,359 | |||
| SOlid Surrogat 1 | 19,797 | 17,480 | 16,491 | 12,991 | 0,553 |
| Solid Surrogat 2 | 8,612 | 5,650 | |||
| Solid Surrogat 3 | 21,065 | 15,844 |
Tabell 3. Celle tettheter oppnås ved manuell eller CellProfiler analyse for 3 faste og 3 perfuserte surrogater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri, har en fremgangsmåte for 3D-kultur er beskrevet som innbefatter komponenter av vevet mikromiljøet, inkludert den ekstracellulære matriks (ECM) og humane stromale fibroblaster, i et volum som mer nøye modeller human brystcancer for å muliggjøre utvikling av en recapitulative 3D morfologi . 3D dyrkningsmetode som er beskrevet er mer representativt for humane sykdommer enn tradisjonelle 2D cellekultur ved at flere celletyper er inkorporert i et 3D-volum av ECM. Det er blitt bemerket at disse parameterne (dvs. flere celletyper, ECM, og 3D-volum) tilveiebringe en mer bevilget sammenheng å studere biologiske prosesser fordi vevsarkitektur, signaler fra mikromiljøet, og dimensjonalitet blir tatt hensyn til 1,8. Andre metoder for 3D kultur er tidligere blitt beskrevet, inkludert, kulturen av celler på toppen av en 3D-matrise 29, genereringen av kuler 30, cutlures hengende dråpe 31, ennd bruken av microfluidic enheter 32. Selv om hver av disse systemene har unike fordeler, samlet de ikke klarer å inkludere enten matrisekomponenter, stromal celle populasjoner, eller en representant dimensjonalitet. Fremgangsmåten for 3D-kultur som er beskrevet her omfatter hver av disse parametrene og kan etableres ved hjelp av en bioreaktor system for å muliggjøre lengre vekstperioder som er vanskelig å oppnå ved anvendelse av fast 3D-kultur. I tillegg perfusjon av surrogater gir en større grad av vekst sammenlignet med faste surrogater.
Et annet trekk ved denne tilnærmingen for in vitro kultur er fleksibilitet i hvilke typer analyser som kan utføres ved hjelp av surrogat "vev". En rekke endepunkter kan måles indirekte ved kultur ved å evaluere det kondisjonerte media, eller perfusatet, for oppløselige produkter (for eksempel LDH som en indikator på celledød, spesifikke utskilte proteiner eller metabolitter som en .indikatorereller av passende fenotypisk funksjon) eller ved anvendelse av ikke-invasiv avbildning av fluorescently eller luminescently merkede celler for å vurdere veksten og surrogat arkitektur overtid. Etter vekst, kan ECM bli spaltet ved hjelp av en ECM-protease og celler kan bli isolert og anvendt for ytterligere analyse eller videre eksperimenter, slik som strømningscytometrisk kvantifisering 33. Lysater av cellene fjernet fra ECM kan også bli evaluert genomisk, på mRNA-transkriptet nivå, eller for proteinekspresjon. Alternativt kan endepunktene måles direkte fra faste og bearbeidede surrogat "vev" etter at forsøket er avsluttet. Disse inkluderer en rekke forskjellige morfologiske parametere (for eksempel nukleær / cellemorfologi og graden av celle aggregering) for H & E-fargede histologiske seksjoner og andre molekylære analyser utført på histologiske snitt ved hjelp av immunhistokjemi (f.eks ekspresjon av Ki-67 som en indikator på celle proliferasjon), eller isitu hybridisering (f.eks., RNA-ekspresjon av spesifikke genprodukter). Det er også mulig å utføre flere molekylære analyser, for eksempel sanntids kvantitativ PCR eller neste generasjon sekvensering, på følgende formalinfiksert, parafininnstøpte surrogater; imidlertid, på grunn av molekylær tverrbinding indusert ved fiksering og behandling, blir hurtigfrosset surrogater foretrukket for slike analyser. Slike molekylære og morfologiske evalueringer kan gi verdifull informasjon om cellevekst, død eller respons på medikamentell behandling gjennom vekst samt følgende kultur.
Den største fordelen med å bruke CellProfiler program for semi-automatisert kvantifisering av tettheten av kjerneholdige celler i histologiske deler av surrogater er tidsbesparelser som den gir. Selv om den totale mengden av tid som kreves per surrogat er variabel og avhenger i stor grad av størrelsen på de surrogater og antall bilder ervervet, er det Estiparret som ankommer ved en celletetthet fra surrogat bildene krever 4-5 timer med praktisk gang per surrogat ved manuell telling i forhold til en halv time pr surrogat ved bruk av CellProfiler program. Flertallet av hands-on-tid ved hjelp CellProfiler analyse er knyttet til måling av surrogat området i ImageJ. Den CellProfiler Programmet krever tid til å automatisk behandle bildene, men krever ikke hands-on tid fra annet enn å importere bildene forsker.
Det er begrensninger av metoder og 3D surrogat kulturer som er beskrevet her. Som vist i figur 12, ved bruk av perfusjon bioreaktor system gitt en større grad av vekst enn faste kulturer, karakterisert ved at akkumuleringen av celler og graden av spredning er betydelig langsommere. Selv om perfusjon bioreaktor systemet som brukes her gitt en vekst fordel, kan perfusjon systemer også har sine egne begrensninger. For eksempel, er PDMSofte brukt i fremstillingen av bioreaktorer på grunn av sin enkelhet i bruk, inerte egenskaper, og reproduserbarhet. Imidlertid er dette materiale som er kjent for å absorbere hydrofobe molekyler fra cellekulturmedier, og kan ta opp lipofile legemidler 34-36. Mens andre materialer kan brukes i stedet for PDMS hvis disse begrensningene er av interesse, andre materialer er tilgjengelige også kommer med sine egne ulemper som må vurderes. Fordi CellProfiler analysen er avhengig av parametrene inngang for diameter og sirkularitet av kjernene, kan optimalisering av disse innganger for hver surrogat / celletype være nødvendig. Det er også verdt å merke seg at celletetthetsmålingen presenteres her er ikke en direkte måling av cellenes levedyktighet. Det er tidligere blitt bemerket at en direkte måling av cellelevedyktighet er krevende i 3D-kultursystemer 37. Imidlertid er atom degradering en del av både apoptose og nekrose, de to fremherskende former av celledød. I apoptose, nucleus fragmentene, enprosess som kalles karyorrhexis etter kromatin kondens eller pyknosis 38,39. Dette skiller seg fra nekrose, hvor den døende cellen sveller forårsaker cellemembranen for å briste og frigjøre innholdet i cytoplasma. Histologisk er nekrose karakterisert ved karyolysis (dvs. oppløsning av en kjerne), etterfulgt av pyknosis og karyorrhexis 40. Kjerner som har gjennomgått disse endringene kan sees på H & E-fargede histologiske snitt, men vil ikke bli anerkjent som intakte kjerner ved CellProfiler programmet. Disse atom endringene forekomme forholdsvis sent i prosessen av celledød men. Derfor kvantifisere antallet kjerneholdige celler per område kan omfatte celler som er i de tidligere stadier av celledød, men vil likevel gi nyttig informasjon om cellelevedyktighet på tidspunktet for surrogat fiksering. Andre metoder som kan brukes til å indikere levedyktighet eller vekst omfatte analyser av perfusates (f.eks Alamar blå eller LDH-assays) or vurdering av spredning i surrogat "vev" (for eksempel via Ki-67 merking av immunhistokjemi).
Kritiske trinn i protokollen for surrogat oppsettet inkluderer ECM polymerisasjon, hvor temperatur, pH, og tid alle må overvåkes for å sikre fullstendig polymerisasjon før bading surrogat i medium. I tillegg holder celle + ECM blandingen på is før plettering i en 8-brønners kammerobjektglass eller en injeksjon i en bioreaktor system er avgjørende for å hindre for tidlig polymerisering. Også for å hindre polymerisasjon under surrogat oppsett, natriumbikarbonat brukes til å øke pH-verdien til 7 bør tilsettes til blandingen siste. Endelig må gis tilstrekkelig inkubasjonstid ved 37 ° C for å sikre fullstendig ECM polymerisasjon; 45 minutter har vist seg å være tilstrekkelig. En annen viktig faktor i surrogat forberedelse er å unngå bobledannelse. I både solide og perfuserte systemer, er det best å unngå dannelse av-boblees i cellen + ECM blanding som å ikke skape en blokk til strømmen av næringsstoffer under kultur. Det er også viktig for å unngå bobler under medium innføring i perfusjonssystemet hvor en boble kunne fungere som en luft emboli, blokkerer mediumstrømmen.
Riktig fiksering er viktig for genetisk analyse; Derfor er oppmerksomheten til konsekvent og standardisert fiksering (inkludert type fiksering og hvor mye tid i fiksativ) og behandling er nødvendig for å oppnå replikative resultater. Varigheten og type fiksering er mindre av et problem for H & E farging beskrevet her, men disse parametrene kan påvirke andre typer molekylær analyse av surrogater. Dette er fordi formalin fiksering, spesielt, bevirker tverrbinding av molekyler, inkludert proteiner, DNA og RNA i en noe tidsavhengig og molekyl-spesifikk måte 41,42. Dette er spesielt viktig i immunhistokjemisk analyse, da antistoff anerkjennelse kan hinkjent som ved kryssbinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM) | Corning CellGro | 10-014-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| Tissue Culture plates, 100 mm | CellTreat Scientific Products | 229620 | Sterile |
| Tissue Culture plates, 35 mm | CellTreat Scientific Products | 229638 | For PDMS foam formation |
| 9" Glass pipette | Fisher | 13-678-20D | Sterile |
| 10 ml pipette | CellTreat Scientific Products | 229210B | Sterile |
| 1,000 µl piptette tips | FisherBrand | 02-717-166 | Sterile Filtered |
| 200 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-141 | Sterile Filtered |
| 10 µl pipette tips | FisherBrand | 02-717-158 | Sterile Filtered |
| 15 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229410 | Sterile |
| 50 ml conical tubes | CellTreat Scientific Products | 229422 | Sterile |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | FisherBrand | 05-408-129 | Sterile |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | Sterile |
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor. |
| PDMS Foam | Made in-house for use in our in-house bioreactor. | ||
| High Concentration Bovine Collagen Type I | Advanced Biomatrix | 5133-A | FibriCol ~10 mg/ml |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane) | Corning | 354230 | Basement membrane material |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S8761 | |
| Molecular Biology Grade Water | Fisher | BP2819-1 | |
| DMEM 10x | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| Nunc Lab-Tek Chamber Slide System | Thermo Scientific | 177402 | 8-well |
| Bioreactor | Made in-house. | ||
| Spring-Back 304 Stainless Steel—Coated with PTFE polymer | McMaster-Carr | 1749T19 | Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house bioreactor system. 0.016" Diameter |
| BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14 | Masterflex | EW-96440-14 | For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in. |
| 2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID | Cole-Parmer | EW-74906-36 | For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump). |
| Six Channel precision micro peristaltic pump | Cole-Parmer | EW-74906-04 | For use with our in-house bioreactor system |
| Tuberculin Syringes | BD Medical | 309625 | 26 gauge 3/8 in. needle; Sterile |
| Dissecting Tissue Forceps | FisherBrand | 13-812-36 | 5.5 inch |
| Mini Tube Rotator | Boekel Scientific | 260750 | Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753) |
| 50 ml tube carousel | Boekel Scientific | 260753 | Used with mini tube rotator |
| Bambino Hybridization Oven | Boekel Scientific | 230301 | Equipment option for surrogate rotation |
| HistoGel Specimen Processing Gel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Specimen Processing Gel described in Step 5.2 |
| Cryomold | Andwin Scientific | 4566 | 15 mm x 15 mm x 5 mm |
| Tissue Marking Dye | Cancer Diagnostics, inc. | 03000P | Can be used to mark surrogates, allowing multiple samples to be included in one tissue cassette |
| Hinged tissue cassettes | FisherBrand | 22-272-416 | |
| Formalin | Fisher | 23-245-685 | |
| GoldSeal Plain Glass Slides | Thermo Scientific | 3048-002 | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL | |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Decon Laboratories, Inc. | 2805M | |
| Hematoxylin | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Clarifier | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7401 | |
| Bluing Solution | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | |
| Eosin Y | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | |
| Cytoseal XYL mounting media | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 83124 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5G |
References
- Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer. Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis. J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Bergamaschi, A., et al. Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome. J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).
- Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, S66-S72 (2013).
- Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies. JBC. 204 (3), 291-301 (2014).
- Sadlonova, A., et al. Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture. Breast Cancer Res. 4, (2004).
- Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity. Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).
- Marshall, L. E., et al. Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. Polymeric foams with functional nanocomposite cells. RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).
- Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters. eLife. 3, (2014).
- Lochter, A., Bissell, M. J. Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer. Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).
- Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).
- Varsegi, G. M., Shidham, V. Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells. J Vis Exp. (29), e1316 (2009).
- Sadlonova, A., et al. Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease. Am J Pathol. 170 (3), (2007).
- Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol. Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).
- Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering. J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).
- Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies. J Vis Exp. (11), (2008).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Kwon, Y. -J., et al. Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines. Clin Exp Metastasis. (28), (2011).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J Vis Exp. (99), e52293 (2015).
- Pal, A., Kleer, C. G. Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells. J Vis Exp. (86), e51311 (2014).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry. J Vis Exp. (83), e51088 (2014).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J Vis Exp. (51), e2720 (2011).
- Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), e52526 (2015).
- Sadlonova, A., et al. Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts. Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).
- Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels. Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).
- Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
- Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).
- Caruso, R. A., et al. Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review). Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).
- Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).
- Ogino, S., et al. Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease. Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).
- Otali, D., et al. Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition. Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).
