Protocol
Etica Dichiarazione: I protocolli per la gestione degli animali sono stati approvati dalla Vanderbilt Institutional Animal Care e del Comitato Usa (IACUC, protocolli numero M / 10/117 (suini) e M / 10/219 (topi) e condotto secondo le norme AAALAC-internazionali. l'utilizzo di tessuti cardiaci umani sopraelevate è stato approvato dalla Vanderbilt University Medical center IRB (numero di protocollo 100887).
1. Raccolta e conservazione
- Rendere fresca 4% glutaraldeide in soluzione 0,1 M tampone fosfato (PB).
ATTENZIONE: glutaraldeide è tossico, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante.- Fare una soluzione di 0,2 m stock di PB, pH 7,4 utilizzando 21,8 g di Na 2 HPO 4 e 6,4 g di NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml dH 2 O.
- Aggiungere 400 ml di 50% glutaraldeide al 2,5 ml di soluzione PB e 2,1 ml di dH 2 O.
- Immergere un pezzo (non più grande di 2 cm 2) di tessuto nella soluzione di glutaraldeide 4%. Nota: pezzi di piccole dimensioni possono anche essere utilizzati, ma dovrebbero essere di dimensioni sufficienti (non inferiore a 5 mm 2) per essere facilmente visualizzati da occhio per agevolare successive fasi del protocollo.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, poi conservare indefinitamente a 4 ° C.
2. Decellularization del tessuto cardiaco
- Fai la soluzione al 10% di NaOH acquosa fresca con 10 g di NaOH pellet / 100 ml dH 2 O.
ATTENZIONE: Le soluzioni NaOH sono corrosivi e possono causare ustioni alcali, indossano i guanti. - Risciacquare il tessuto in DH 2 O.
- Incubare in soluzione al 10% di NaOH a temperatura ambiente per 6 - 10 giorni (fino a cambiamenti del tessuto da bruno-rossastro a biancastro o bianco).
- Risciacquare in DH 2 O fino a quando il tessuto diventa trasparente.
- Immergere il tessuto in acido tannico 1% per 4 ore a temperatura ambiente. Usare 1 ml 5% soluzione di riserva per 4 ml dH 2 O.
ATTENZIONE: L'acido tannicoè un forte irritante, indossare guanti. - Risciacquare in DH 2 O durante la notte.
3. Osmication e disidratazione del tessuto cardiaco (in Cappa aspirante per la sicurezza)
- Fare una soluzione di 0,2 m stock di tampone cacodilato di sodio con 21,4 g cacodilato di sodio, cloruro di calcio e 10,0 g 450 ml dH 2 O. Mix, quindi aggiungere acido cloridrico come necessario per aggiustare il pH a 7,4. Qs a 500 ml con dH 2 O.
ATTENZIONE: cacodilato di sodio e acido cloridrico sono tossici, indossare guanti e lavorare in una cappa aspirante. - Fai la soluzione di riserva 2% acquosa di tetrossido di osmio in cappa per la sicurezza sciogliendo 1 g di cristallo tetrossido di osmio in 50 ml di dH 2 O.
ATTENZIONE: tetrossido di osmio è un pericolo di inalazione grave; la fissazione di vapore di mucose o bulbi oculari è possibile, quindi, gestire solo nella cappa con i guanti. Si raccomanda un paraspruzzi. - Risciacquare il tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare soluzione madre 1: 1 con DH
- Ripetere il passaggio precedente per due volte, per un totale di tre risciacqui tampone.
- Immergere il tessuto in 1% tetrossido di osmio in 0.1 M tampone cacodilato di sodio (mescolare cacodilato magazzino di sodio e magazzino tetrossido di osmio 1: 1) il rotatore per 1 ora.
- Risciacquare tessuto in 0.1 M tampone cacodilato di sodio 3 volte per 5 minuti ciascuno su rotatore.
- Risciacquare tessuto con concentrazioni crescenti di etanolo (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, e infine 100%) per 15 minuti ciascuno in rotatore.
4. Sezione trasversale Preparazione della superficie per SEM
- Trasferire il tessuto in 100% di etanolo ad un piatto piano Petri contenente anche il 100% di etanolo.
- Tenere due lamette molto taglienti tale che gli appartamenti di lati sono in contatto tra loro e taglienti croce per formare due lati di un triangolo equilatero sopra il campione. Per eseguire ciò, utilizzare la mano sinistra per posizionare una lama sul lato destro del campione etaglio verso sinistra. Al tempo stesso, utilizzare la mano destra per posizionare la seconda lama all'estrema sinistra del campione e fetta verso destra. Così, le lame vengono fatti scorrere uno contro l'altro da direzioni opposte per fare un solo taglio liscio.
- Infilare lati lama piatta contro l'altro per effettuare un taglio molto pulito del campione con una distorsione minima o forza strappo, preferibilmente esponendo il maggior superficie possibile senza danneggiare il campione.
- Ripetere l'operazione per ogni campione per esporre le più pulite possibili superfici di sezione per l'esame nel SEM.
5. punti critici di essiccazione (CPD) di tessuto cardiaco
- Utilizzare una spatola o pinzette per trasferire tessuto portacampioni dell'essiccatore punto critico (CPD), assicurando che il tessuto rimanga in 100% di etanolo in ogni momento. Assicurarsi che il supporto è immerso in etanolo e che il trasferimento è realizzato con tessuto esposto all'aria per non più di pochi secondi.
- Operare CPD per noiil manuale di ER per completare 3 spurgo-e-fill cicli di sostituire l'etanolo con anidride carbonica liquida.
- Operare CPD per il manuale utente per raggiungere il punto di essiccazione critica dei campioni e restituirli alla pressione atmosferica con ventilazione controllata di CO 2.
6. Montaggio dei campioni Cuore tessuto per SEM
- Preparare un campione stub SEM per ciascun campione, aderendo una linguetta adesiva carbonio alla superficie superiore dello stub alluminio.
- Con l'ausilio di uno stereomicroscopio, aderire accuratamente il campione nella scheda adesiva con la superficie sezione di interesse rivolto verso l'alto (lontano dalla scheda, visibile), e il più vicino possibile parallelo al piano della superficie del campione stub. Non sonda o toccare la superficie di interesse.
- Break a bastoncino di legno per ottenere una spazzola conica, ideale per l'applicazione della vernice. Applicare argento o vernice carbonio alla base e ai lati del campione, per migliorare l'aderenza allo stub.
- Estendere una linea molto sottile di argento o carbonio vernice fino ad un bordo della superficie di interesse, per fornire un percorso di carica dalla superficie di interesse per terra.
- Applicare 2 o 3 piccoli tocchi di argento o vernice carbonio intorno al perimetro della scheda di carbonio, per fornire un percorso conduttivo dalla superficie scheda carbonio allo stub in metallo e quindi a massa.
- Lasciare vernice conduttiva asciugare per due ore.
- Operare polverizzazione dispositivo a induzione per il manuale dell'utente ad applicare un rivestimento relativamente pesante (target range del 30 - 40 nm) di lega di oro-palladio o oro. Camera della pompa campione di circa 0,1 mbar; impostare timer per 40 sec. la valvola insieme aperto a 8:00 posizione (moderato flusso di gas Argon). Premere Start per avviare rivestimento sputtering a 30 mA. Viola scarica luminescente dovrebbe essere visibile nella camera campione.
7. SEM L'esame dei campioni di tessuto di cuore
- Eseguire microscopia elettronica a scansione relativamente bassa tensione di accelerazione per minimizzare l'imaging pROBLEMI connessi ad una cattiva dissipazione carica nel campione (in carica). Suggerita condizione di imaging iniziali sono: 5 kV tensione di accelerazione, distanza di lavoro di 10 mm.
- Con l'assistenza di un operatore esperto, impiego aumentato distanza di lavoro di estendere la profondità di campo in condizioni di imaging che richiedono attenzione di fibre in più piani focali, o fibre si estendono per lunghezza considerevole nella dimensione z.
- Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), in l'accesso all'interfaccia utente della scheda di navigazione in alto a destra.
- Accedere alla scheda Coordinate dal menu stage. Per aumentare la distanza di lavoro, immettere un valore più grande in millimetri per coordinata Z poi clicca sul vai alla scheda di passare alla fase di esempio per la distanza di lavoro inserito.
- Con l'assistenza di un operatore esperto, impiegare campione inclinazione e rotazione per posizionare la superficie di interesse ortogonale al fascio di elettroni. Ulteriori inclinazione di 10 a 30 degrSEO da questa posizione può migliorare l'osservazione e la documentazione della struttura a matrice.
- Per il microscopio usato qui (vedi Tabella dei Materiali), nell'interfaccia utente, cliccare e tenere premuto il tasto destro del mouse, quindi far scorrere a sinistra oa destra per mettere a fuoco il campione vicino alla periferia del piano superficie preparata di interesse, notando la distanza di lavoro focalizzato .
- Navigare con il Manuale joystick interfaccia utente per spostare vicino al bordo opposto della superficie e ripetere messa a fuoco. Se la distanza di lavoro non è approssimativamente uguale alla prima posizione, il campione di inclinazione per raggiungere un accordo approssimativo in entrambe le posizioni utilizzando la scheda Coordinate del menu stage (vedi 7.2) e immettere un valore di inclinazione del T di coordinate.
- Ruota esemplare novanta gradi (inserire il valore in R campo coordinate) e ripetere il processo fino a quando tutte le posizioni sono focalizzate approssimativamente alla stessa distanza di lavoro.
Nota: la pressione variabile SEM può essere impiegato per migliorare la dissipazione di caricase disponibile. Alto vuoto è la modalità di funzionamento standard per la microscopia elettronica a scansione.
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Representative Results
La tecnica evidenziata è stata applicata ai tessuti cardiaci da un inutilizzato trapianto di cuore umano donatore (figura 1), i tessuti espiantati da pazienti sottoposti a trapianto, cuori da wild-type e topi distrofici (figura 3), e in campioni di cuore post-infartuati da un porco modello di danno cardiaco (Figura 2). Come mostrato in figura 1, la matrice cardiaco umano è un tessuto intricata di proteine reticolate che mostrano uno schema a nido d'ape se visto in sezione trasversale. Ogni struttura 'honeycomb' è di circa 40 micron di larghezza, normalmente eludere una singola miociti, quando si considera la vista piana di figura 1. Quando è collegato da dischi intercalati, diversi cardiomiociti può essere immaginato come un asta che corre longitudinalmente attraverso il 'tunnel' quando la metafora è esteso a tridimensionalità. Figura 1 mette in evidenza anchel'importanza della procedura di taglio, con maggiore precisione producendo dati topografici più rivelatori (Figura 1, in alto a sinistra) rispetto sezioni che sono "pezzi" durante il processo di taglio (Figura 1, in alto a destra).
La rimozione di cellule residenti cardiache, vasi sanguigni, e cellule circolatori prima della lavorazione SEM svela ulteriori dettagli ultra-strutturali che sarebbero meno apprezzabile da SEM di interi isolati di tessuto cardiaco. Ciascun individuo collagenous "puntone", per esempio (Figura 1, pannelli inferiori) è apparentemente allineato ad intervalli regolari e perpendicolare myofibril sarcomeri. Questa disposizione è adatto per aiutare a mantenere la struttura del cuore da deformazioni contatore ad azione esercitata durante i cicli di contrazione e rilassamento, simile al 'ordito e la trama' di tessuti che aiuta a mantenere il corpo in tessuto e la forma contro stretching.
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Figura 1:. Rappresentante elettronici a scansione Micrografie della disposizione tridimensionale della matrice extracellulare in decellularized ventricolare sinistra di tessuto ottenuti da un inutilizzato cuore del donatore umano I primi due pannelli mostrano la matrice in sezione trasversale a basso ingrandimento (bar = 500 micron), fornendo una veduta aerea di architettura di tessuto cardiaco umano normale. A maggiore ingrandimento, si può meglio osservare la tipica struttura a nido d'ape di fibre di sostegno che forniscono supporto meccanico per miofibre distanziati regolarmente (barre medie pannelli sinistro e destro = 100 micron e 50 micron rispettivamente). A un esame più attento, ogni 'nido d'ape' è composto da fibre che vengono organizzate in parallelo tra loro, mentre perpendicolare al cardiomiociti residenti (bar pannello in basso a sinistra ea destra = 10 micron e 5 micron, rispettivamente).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Oltre a fornire informazioni strutturali, SEM dei tessuti decellularized può permettere significativo, valutazione qualitativa dei cambiamenti della matrice extracellulare in risposta a lesioni o forme non pregiudizievoli di cardiomiopatia. Ad esempio, questa tecnica è stata recentemente utilizzata per esaminare le matrici extracellulari di post-infartuati tessuti cardiaci suini 43. Nel corso di questo esperimento grandi animali, progettato specificamente per valutare l'efficacia della isoforma GGF2 di NRG-1β come un potenziale terapeutico per insufficienza cardiaca, suina post-infartuato che ha ricevuto la somministrazione NRG-1β endovenosa esibito colpisce alterazioni nella matrice cardiaca , rispetto al tessuto cardiaco non trattati di animali post-infartuati. Questi risultati sono stati successivamente pubblicati 43 e TEchnique è rimasto uno strumento prezioso per la costruzione su questa iniziale scoperta fortuita. La figura 2 include esempio micrografie, prodotti durante il corso di questo studio, che evidenziano differenze di matrice drastiche tra matrici non trattati e NRG-1β-trattati.
Figura 2:. Rappresentante elettronici a scansione micrografie ventricolare sinistra matrice extracellulare a non trattati e NRG-1 β maiali -treated, dopo NaOH macerazione La matrice nella sezione mette in evidenza la disposizione spaziale regolare delle fibre in non trattato post-infarto miocardico (post-MI) suini (in alto a sinistra), rispetto agli animali post-MI NRG-1β-trattati (in alto a destra). Se vista in longitudine, la matrice suina non trattata presenta un aspetto opaco spesso simile (in basso a sinistra), mentre la matrice di NRG-1b trattati suinivisualizza regolare disposizione spaziale delle fibre (in basso a destra). Bianco bar = 40 micron (tutti i quattro pannelli). Risultati più dettagliati e le cifre sono compresi nel manoscritto associato 43. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Esplorazione di cambiamenti di matrice che si verificano nei cuori distrofici ha anche dato spunti qualitativi nella progressione e lo sviluppo di un modello animale di Duchenne cardiomiopatia distrofia muscolare (DMD). Nei topi mdx, un modello di topo comunemente usato di DMD, ci sono differenze significative e di età-dipendente tra wild-type e mdx cuore se visti da SEM dopo fissazione e il trattamento NaOH. Come mostrato in Figura 3, i componenti della matrice erano relativamente normale da 6 settimane di età cuori mdx privi funzionale distrofina rispetto ai topi normali. più interesting, organizzazione a matrice extracellulare è stato chiaramente interrotto o forse degradato nei topi distrofina-deficienti più anziani rispetto ai topi mdx più giovani, illustrando la natura progressiva della DMD nel cuore. Tali differenze profonde non ci si aspettava, perché i topi mdx sono scarsamente rappresentativi della cardiomiopatia DMD umana a causa del fatto che essi presentano un fenotipo molto più mite cardiomiopatia e più lento tasso di mortalità degli esseri umani affetti da DMD 48. Ciò suggerisce che anche piccoli cambiamenti nella funzione cardiaca possono essere catturati utilizzando la tecnica di visualizzazione presentata in questo manoscritto. Questa metodologia dovrebbe essere facilmente adattabile alle matrici extracellulari di altri organi, per i quali non esistono neanche attualmente disponibili terapie fibrosi-targeting.
Figura 3: Rappresentante elettronici a scansione micrografie Ven Sinistraventricolare matrice extracellulare in Wild-tipo contro topi mdx. La matrice di sinistra ventricolare cardiaca nei topi wild-type (pannello superiore) è simile a quello osservato in altre specie. La matrice in topi mdx a 6 settimane di età sembra relativamente normale, anche se un po ' "soffice" in apparenza (pannello centrale). Viceversa, la matrice cardiaca di topi mdx anziani sembra fortemente degenerato (pannello inferiore), indicando che il processo distrofico può essere qualitativamente catturato utilizzando SEM in, tessuti fissati NaOH-macerato. Bianco bar = 10 micron (tutti e tre i pannelli). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Preparazione della superficie trasversale sezione è la fase più critica durante il protocollo. Per preservare struttura fine, i campioni devono rimanere disidratati in etanolo al 100% in ogni momento fino introdotto al processo di essiccazione punto critico. Pertanto, il taglio dei provini per ottenere superfici per l'esame EM deve essere fatto, mentre i campioni sono immerso in etanolo in un piatto piano. E 'anche fondamentale che la superficie esposta non viene toccato o sondato durante la successiva manipolazione. Nessun importanti modifiche sono previsti per l'applicazione di questa tecnica per altri tipi di tessuto per simili osservazioni matrice, anche se la porzione SEM del protocollo potrebbe richiedere base guasti microscopia elettronica indipendentemente dall'origine campione. Immagini raccolte dai campioni fibrosi sono inclini ad artefatti introdotti dalla dissipazione scarsa carica ( "carica"). problemi di ricarica di solito può essere ridotto al minimo, riducendo tensione di accelerazione, aumentando la velocità di scansione (chiamato anche tempo di sosta) E riducendo dimensione dello spot del fascio di elettroni. Integrazione di varie scansioni raccolti abbastanza rapidamente per evitare artefatti carica produce un'immagine di segnale paragonabile alla qualità acustica senza gli artefatti carica presente in un lento un'immagine singola scansione, maggiore qualità.
Questa tecnica è intrinsecamente qualitativa e, quindi, integra se considerato insieme a misurazioni quantitative (ad esempio, tricromica di Masson o picoserius colorazione rossa, la misurazione del contenuto di idrossiprolina, spettrometria di massa e RNA-Seq) per accertare come le differenze strutturali visualizzati potrebbero essere correlate a diversi stati di sviluppo o di malattia. Tuttavia, nonostante questa limitazione, il metodo è significativa oltre fibrosi cardiaca specificamente, perché la matrice extracellulare è un componente essenziale di quasi ogni organo del corpo. Nel cuore, la matrice cardiaco fornisce supporto meccanico critico per il pompaggio continuo caratterizzato da complessi stretching, torsioni, e DEFormazione, che conferisce l'ingresso ottimale e l'efflusso di ossigenato e deossigenato sangue 49 per le> 2,5 miliardi di battiti che si verificano nel corso della durata della vita umana media. Data la bassissima capacità di rigenerazione del tessuto cardiaco, una matrice dinamica che può essere rimodellata in base alle esigenze di contesto ha un senso logico. Con solo un leggero sforzo di immaginazione, si potrebbe dedurre che esistono bersagli terapeutici per la manipolazione di rimodellamento della matrice per migliorare il processo di guarigione, pur limitando la fibrosi negativo. L'applicazione della tecnica dimostrata come minimo mette in mostra la raffinatezza e la bellezza della matrice cardiaca e così facendo sottolinea ulteriormente la sua importanza funzionale.
Mentre il valore di misure quantitative è un principio fondamentale per la valutazione di praticamente tutti gli studi sperimentali, la tecnica evidenziata nell'immagine può essere utilizzato per rivelare variazioni ultrastrutturali qualitativi che non solo completano misure standard delle matricima potrebbe suggerire percorsi alternativi di indagine per comprendere le alterazioni biochimiche fondamentali che sottolineano i cambiamenti qualitativi. future applicazioni attesi di questa tecnica sono il suo uso in modelli di malattia cardiaca e tessuti umani come uno strumento complementare per valutare i cambiamenti della matrice, così come l'utilizzo ampliato per studiare altri organi per i quali i cambiamenti di matrice sono una componente del processo di malattia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
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