Abstract
תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי. למרות הפיתוח של מכשירי microfluidic כבר אומץ על ידי מהנדסים למעלה משני עשורים, היישומים הביולוגיים שלהם יישארו מוגבלים. מודל microvessel במבחנה רלוונטי יותר פיסיולוגי אומת על ידי יישומים ביולוגיים חשוב לקדם את התחום ולגשר על הפערים בין in vivo ו במבחנה. כאן, אנו מציגים נהלים מפורטים לפיתוח רשת microvessel בתרבית באמצעות מכשיר microfluidic עם יכולת זלוף לטווח ארוך. אנחנו גם מדגימים ושימושיה מדידות כמותיות של שינויים המושרה אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בזמן אמת באמצעות confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. רשת microvessel נוצרהעבודה עם זלוף הרציף הראתה צמתים מפותחות בין ECS. VE-cadherin הפצה היה קרוב יותר לזה שנצפה microvessels השלם מ monolayers EC בתרבית באופן סטטי. ATP-induced עלייה זמנית EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור נמדדו כמותית ברמות תאים בודדות, אשר תוקפות את הפונקציונליות של microvessels התרבותי. מכשיר microfluidic זה מאפשר ECS לגדול תחת זרם רלוונטי מבוקר היטב, מבחינה פיזיולוגית, מה שהופך את סביבת תרבית תאים קרוב in vivo מזה בתרבויות 2D הקונבנציונליות, סטטי. עיצוב רשת microchannel הוא תכליתי מאוד, ותהליך הייצור הוא פשוט דיר. המכשיר ניתן לשלב בקלות למערכת המיקרוסקופית confocal או קונבנציונלית המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. והכי חשוב, כי רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו תשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצדפתולוגית מרכיבי דם שינו ממדגמים חולים להשפיע ECS אדם ולספק תובנה בנושאים קליניים. כמו כן ניתן לפתח כפלטפורמת הקרנת סמים.
Introduction
תאי האנדותל (EC) המצפים את דפנות כלי דם vivo חשופים כל זמן לזרום, אבל ECS בתרבית גדלה לעתים קרובות בתנאי סטטיים תערוכת פנוטיפ פרו-דלקתי 1,2. טכנולוגית מיקרופלואידיקה מאפשרת נוזל לשלוט באופן מדויק באמצעות microscale המוגבל גיאומטרי ערוצים (תת מילימטר) 3, אשר מספק את ההזדמנות עבור תאים בתרבית, במיוחד עבור כלי דם ECS, לגדול בתנאי זרימה רצויות. תכונות אלו הופכות את תנאי תרבית תאים קרובים in vivo מ בתרביות תאי 2D הקונבנציונליות, סטטי. הם מאוד חשובים כאשר מכשירי microfluidic משמשים מודל סוגים שונים של vasculatures וללמוד תגובות EC גירויים מכאניים ו / או כימיים.
למרות היתרונות שמפגינים רשת microchannel על תרבית תאים סטטי, העיבוד ויישום של מיקרופלואידיקה ב- F ביוield להישאר מוגבל. דווח ע"י בדיקה שנערכה לאחרונה, רוב הפרסומים בתחום זה (85%) עדיין בכתבי עת הנדסה 4. הביצועים של מכשירי microfluidic לא היו מספיק משכנע עבור רוב הביולוגים לעבור טכניקות נוכחיות כגון assay Transwell ואת מנת תרבות מאקרו בקנה המידה / זכוכית שקופית למכשיר מיניאטורי זה. מיקרופלואידיקה הוא שדה רב תחומי, המחייב שיתוף פעולה בינתחומי לנוע בתחום זה קדימה. מטרת מאמר טכני זה היא לצמצם את פערי הידע בין דיסציפלינות ולבצע את הליכי הייצור מובנים על ידי ביולוגים, תוך מתן יישום ביולוגי ואימות פונקציונלית של microvessels microfluidic. הפרוטוקולים הניסיונות דמיינו כוללים ייצור של שני מכשירים microfluidic והמקודדים הביולוגיים שלהם, אשר מייצג שיתוף פעולה הדוק בין מהנדסים וביולוגים.
אנחנו דיווחנו לאחרונה כמהיישומים ביולוגיים באמצעות רשת microvessel במבחנה עם המכשיר microfluidic 5. על מנת לעצב את הממדים כראוי של רשת microchannel ולהחיל את לחץ הגזירה הרצוי, מודל מספרים נבנה עם תוכנה הידרודינמיקה חישובית להעריך את פרופיל הזרימה מקרוב. תאי אנדותל טבור וריד אדם מן המעלה הראשון (HUVECs) כי היו זורעים לתוך microchannels הגיע למפגש, כלומר כיסו את המשטחים הפנימיים כולו של microchannel, בתוך 3-4 ימים עם זלוף הרציף. היווצרות המחסום הנאותה הודגמה על ידי מכתים VE-cadherin בהשוואה לאלו שנוצרו בתנאי תרבית תאי סטטי ב microvessels ללא פגע. על ידי יישום פרוטוקולי הניסוי שפותח microvessels שלמים perfused בנפרד 6-8, אנחנו כמותית למדוד את השינויים EC [Ca 2 +] i ו תחמוצת החנקן (NO) בתגובה אדנוזין אדנוזין (ATP) עם ניאוןdicators ו confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי. העליות נגרמות אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור דווחו כאותות תאיים הכרחיים עקב השפעות מתווך דלקת בחדירות microvessel 6-15. למרות שמחקרים קודמים הראו כמה תמונות של DAF-2 DA מכשירי microfluidic טעונים 16,17, ניתוח ברזולוציה ונתונים המתאים טרם השיג 18. למיטב ידיעתנו, מחקר זה מדגים את מדידות כמותיות הראשונות של שינוי הדינמי הנגרמת אגוניסט ב האנדותל [Ca 2 +] i ו NO microfluidic ניצול ייצור מערכת מבוססת.
יש טכניקות microfabrication את הגמישות לפברק למטה microchannels כדי מיקרונים אחדים ולאפשר פיתוח של תבניות מורכבות לחקות את הגיאומטריות של microvasculature in vivo. כאן הצגנו רשת microchannel טיפוסית עם שלוש רמות של הסתעפות. זֶהרשת הוא מפוברק על ידי השילוב של photolithography אשר מתבצע חדר נקי microfabrication ו ליתוגרפיה רכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור מכשיר microfluidic
- ייצור פוטו-ליתוגרפיה רגיל של עובש מאסטר 50 SU-8
- נקה את פרוסות סיליקון לפני ציפוי ספין. לשטוף פרוסות סיליקון 2 אינץ חשופה עם אצטון במשך 15 דקות ואחריו אלכוהול איזופרופיל (IPA) במשך 15 דקות. מייבש את הפרוסות על ידי הצבתו על פלטה חמה ב 150 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. לאחר התייבשות, לקרר את רקיק בטמפרטורת החדר.
- ספין מעיל פרוסות סיליקון עם photoresist SU-8. הוסף 2 מ"ל photoresist SU-8 על גבי פרוסות סיליקון. כבש את פרוסות 500 סל"ד בהאצה 100 סל"ד / sec במשך 10 שניות, ואחריו 1,000 סל"ד בהאצה 300 סל"ד / sec למשך 30 שניות. (ראה משלימה וידאו 1)
- טרום לאפות את הרקיק על פלטה חשמלית על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן ואופים רכים על 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- השתמש חשיפת UV להפוך את התבנית נועדה מן מסכת סרט אל photoresist צופה-הספין. הדפס את התבנית על סרט דק ושקוף כמסיכת סרט. מניח את מסכת סרט על גביספין מצופה photoresist ולחשוף כדי UV עם מינון של 300 mJ / 2 ס"מ. (ראה משלימה וידאו 2)
הערה: בפרוטוקול זה, דפוס רשת microchannel (159 מיקרומטר ערוצי אמא רחבים הסתעפות לארבעת 100 מיקרומטר ערוצי בת רחבים) נועד עם תוכנות CAD. הדפוס על הסרט מציג כשדה ברור ואת שאר הסרט הוא מכוסה על ידי בדיו שחור. בגלל SU-8 הוא photoresist שלילי, החלק של photoresist, כי הוא חשוף UV יהיה crosslinked ולהיות בלתי מסיס הממס במהלך פיתוח העובש (שלב 1.1.6). לאחר הפיתוח, חלק בלתי מסיס זה יהיה לשכפל את דפוס הרשת תוכנן לשמש עובש אמן. - פוסט לאפות את הרקיק החשוף על פלטה חשמלית ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לפתח עובש האמן. השתמש SU-8 מפתח כמו ממס להסיר את photoresist crosslinked-un. לטבול את פרוסות סיליקון ב מפתח SU-8 דקות 3 ולשטוף עם IPA1 דקות.
- חזור על מחזור פיתוח זה 2-3 פעמים עד אין היווצרות פס לבן (שאריות של photoresist הלא נרפא) לאחר שטיפת IPA. בעדינות לייבש את הפרוסות סיליקון עם גז חנקן לבחון את התכונות הקטנות של הדפוס תחת מיקרוסקופ. חזור על מחזורי פיתוח נוספים במידת צורך.
- קשה לאפות את רקיק על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- ליתוגרפיה Soft
- ידני לערבב את שני חלקים (בסיס סוכן ריפוי) של polydimethylsiloxane (PDMS) אלסטומר בכל WT. יחס של 10: 1.
- דה-גז תערובת PDMS עם ייבוש מחובר עם ואקום בית במשך 15 דקות. עופרת הפתרון PDMS על עובש אמן photoresist. העובי של PDMS צריך להיות מעל 3 מ"מ לספק החזקה יציבה של צינורות כניסה / יציאה. דה-גז את PDMS שוב במשך 15 דקות, ולהסיר את בועות האוויר שנותר עם גז חנקן במידת הצורך. לרפא את PDMS casted בתנור על 65 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- נקה את פני השטח שלcoverslip הזכוכית עם סקוטש ו שואב פלזמה (טיפול פלזמה 30 שניות). ספין-מעיל-נרפא un PDMS (0.5 מ"ל) על coverslip זכוכית על ידי ramping ל -4,000 סל"ד ב -500 סל"ד / sec האצת קצב במשך 30 שניות. לרפא את coverslip PDMS מצופה-ספין בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
- חותכים ולשחרר את PDMS נרפא מהתבנית מאסטר. ואז ליצור מפרצון ולשקע עם אגרופן חור בקוטר 1 מ"מ בקצה הדיסטלי של ערוצי אמא.
- איגרות חוב מכשיר coverslip זכוכית ספין המצופה PDMS. לחמצן את המשטחים של PDMS ואת coverslip עם שואב פלזמה דקות 1. לאחר טיפול פלזמת החמצן, למקם טיפה של מים ללא יונים (מי DI) על פני השטח המליטים, ומקום שני החלקים יחד. אופה את המכשיר בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג זוגיות קבועה.
משלימה וידאו 1 (קליק ימני להוריד).
משלימה וידאו 2 (קליק ימני להוריד).
2. מתזמן תא האנדותל ותרבות
- עיקור התקני ציפוי פיברונקטין
- לשמור על רכוש ההידרופובי של השטח PDMS ברחבי כניסה / יציאה מפני התחמצנות. מכסים את פני השטח PDMS סביב הכניסה והיציאה עם פסים קטנים של נייר דבק כדי למנוע התחמצנות. הליך זה יכול למנוע מים די מלהתפשט בכל רחבי המשטח העליון של המכשיר במהלך שלב המילוי (2.1.3).
- פנקו את המכשיר PDMS עם פלזמה חמצן FOr 5 דקות כדי לשנות את פני השטח כדי להיות הידרופילי, ובכך להקל על זרימת הנוזל דרך microchannel ולמנוע בועת השמנה בהליך מילוי (2.1.3).
- השתמש באחת מזרק עם מחט המחוברת או טפטפתי כדי למלא את המכשיר עם מים די המכניסה. משך המילוי עד שיש טיפה של מי DI (30-50 μl) שנצברו במוצא. בדוק את המכשיר תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם יש בועות לכודים בתוך microchannel. הסר את אגל מים המוגזם נוכח הכניסה והיציאה עם ממחטת נייר.
- לעקר את המכשיר בצלחת פטרי עם UV למשך תקופה מינימלית של 3 שעות במנדף בטיחות ביולוגית למינרית. כדי למנוע אידוי, לכסות את הכניסה / יציאה עם פיסה דקה של PDMS, לשים ממחטת נייר רטובה בתוך הצלחת, ולעטוף את המנה עם Parafilm.
- מעיל המכשיר עם פיברונקטין. יש לשטוף את המכשיר הראשון עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), ואז לצפות אותו 100 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין לילה במקרר (4 ° C). מניחים טיפה של פתרון על מפרצון, ולאחר מכן ליצור לחץ שלילי במוצא עם ואקום הבית, מזרק עם מחט או טפטפת.
- מלא את המכשיר עם תרבית תאי תקשורת. יש לשטוף את המכשיר עם PBS ידני עבור 3 פעמים לפני טעינת אמצעי תרבית תאים. לחמם את המכשיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
- זלוף ECS מתזמן לטווח ארוך
הערה: השוואה עם תרבות סטטי 2D EC קונבנציונלית, מודל הרשת במבחנת microvessel עם זלוף הרציף עשה סביבת תרבית תאים קרוב לתנאי vivo. רשת microvessel במבחנה הפגינה פרוטוקול זה יכול להישמר עד שבועות. זלוף מבוקר היטב יהיה לחדש מזינים ברציפות, להסיר פסולת, ולמנוע יתר מפגש של monolayer EC. לכן, ניתן להאריך את תוקף תכנית אקדמית בטווח ארוך, מחק את הסביבה התאית המודינמי תחת physiologica השונהl ו במצבים פתולוגיים.- מערבבים HUVECs העיקרי בתקשורת תרבות HUVEC (MCDB 131) עם 8 dextran% (wt mol 70,000). Dextran משמש כדי להגדיל את הצמיגות של תקשורת ההעמסה להשיג תוצאת זריעת תאים טובה יותר. צפיפות התאים המומלץ הוא כ 2-4 x 10 6 תאים / מ"ל.
- זרעים תאים לתוך המכשיר. מניח טיפת 10-20 μl של תאים על פני הכניסה. הצג זרימה עדינה או על ידי הטיית המכשיר, או פעולת נימים בעזרת פיפטה פסטר זכוכית במוצא. המפתח עבור טעינת תא מוצלחת הוא לשלוט מהירות הזרימה פחות מ -1 מ"מ / sec בתוך הערוצים הקטנים.
- בדוק את זריעת התאים. לאחר הזריעה הראשונית, דגירה המכשירה למשך 15-20 דקות (אווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס) לפני בדיקת מצב הזריעה תחת מיקרוסקופ. במידת צורך, לבצע טעינת תא נוספת להשיג צפיפות תאים רצויה.
- לשטוף בעדינות את המכשיר עם תרבית תאים בינוניים (37° C) להסיר את dextran. תרבות המכשיר בהעדר הזרימה עבור השעה 6 הראשונה באינקובטור (5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס).
- הגדרת חיבור הצינורות עבור זלוף לטווח הארוך. קלט את המכשיר לתוך צלחת פטרי כדי למנוע תנועה. צור חורים קטנים על המכסה של צלחת פטרי הוספות צינורות כניסה ויציאה. חבר את צינורות היניקה כדי מזרק עם מחט עבור זלוף תקשורת תרבית תאים. חבר את הצינורות מוצאים לאספן פסולת.
ההערה: הנח את המכשיר לבין האספן הפסול בתוך תרבית תאי חממה, תוך שימת משאבת זלוף מחוץ לחממה ולחבר אותו עם המכשיר על ידי צינורות יניקה הארוכים. שיעור זלוף נקבע על פי תכנון הניסוי. במכשיר מופיע, השתמש שיעור זלוף של 0.35 μl / min ומגוון מאמץ גזירה בין סנטימטר / 1-2 דיין 2. תחת תנאי זלוף זה, HUVECs מגיע למפגש כ 3-4 ימים.
3. אניmmunofluorescent מכתים
- תקן את ECS במכשיר על ידי טפטוף של paraformaldehyde 2% למשך 30 דקות ב 4 ° C, ואחריו 1x PBS שטיפה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות, ו -1% BSA חסימת למשך 30 דקות. השתמש שיעור זלוף כי הוא זהה לזה המשמש עבור תרבית תאים.
- Permeabilize ECS הקבועה עבור מכתים נוגדן עם 0.1% Triton X-100. Perfuse את המכשיר עם טריטון 5-7 דקות כדי תווית VE-cadherin, ו -3 דקות כדי יקטין F תווית.
- טען את הנוגדנים לתוך המכשיר. Perfuse את המכשיר עם 1x PBS במשך 15 דקות כדי לשטוף את הפתרונות הקודמים. ידני לטעון את הנוגדן העיקרי נגד VE-cadherin (תיש אנטי) לתוך המכשיר בריכוז של 2 מיקרוגרם / מ"ל (הנפח הכולל הוא 20-50 μl). השאר את המכשיר במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. Perfuse נוגדן המשני (חמור-עז נגד) על ידי משאבת מזרק בריכוז של 7 מיקרוגרם / מ"ל 45-60 דקות.
- לייבל EC F- אקטין עם phalloidin. Perfuse את המכשיר עם FO 1x PBSr 15 דקות לפני טעינת phalloidin ידני (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 7-10 דקות.
- גרעינים לייבל EC (ראה רשימת חומרים).
- יש לשטוף את המכשיר עם 1x PBS, ולתחזק אותו ב 4 ° C עד הדמיה.
4. דימות פלואורסצנטי של האנדותל [Ca 2 +] i
- Perfuse את המכשיר עם אלבומין (10 מ"ג / מ"ל) פתרון של -Ringer במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש באותו שיעור זלוף לזה המשמש תרבית תאים. הריכוזים של כל מרכיבי הפתרון של אלבומין-רינגר מתוארים חומרי הרשימה.
- הגדרת מערכת confocal עבור EC [Ca 2 +] i הדמיה עם AM fluo-4. השתמש במערכת מיקרוסקופית confocal הדמית Ca 2 +. השתמש לייזר ארגון (488 ננומטר) עבור עירור ולהגדיר את הלהקה פליטה כמו 510-530 ננומטר. אסוף את התמונות עם מטרה 25x (טבילה במים, NA: 0.95) בשעה 512 x 512 בפורמט הסריקה. השתמש z-צעד של 2 מיקרומטר ו מרווח סריקה עבור כל ערימה של iהמגים של 20 שניות.
- Perfuse את המכשיר עם AM fluo-4 (5 מיקרומטר) במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את AM לומן fluo-4 עם הפתרון של אלבומין-רינגר.
- לרכוש תמונות של microvessels fluo-4 טעון. אסוף את תמונות בסיס למשך 10 דקות. Perfuse את המכשיר עם ה- ATP (10 מיקרומטר) ורשמו את השינויים של עוצמת הקרינה (FI) במשך 20 דקות.
5. דימות פלואורסצנטי של ייצור תחמוצת החנקן
- Perfuse את המכשיר עם הפתרון של אלבומין-רינגר במשך 15 דקות. השתמש שיעור זלוף כי הוא זהה לזה המשמש עבור תרבית תאים.
- הגדר את מערכת דימות פלואורסצנטי למדוד את ייצור תחמוצת חנקן נגרם ATP. שימוש במיקרוסקופ מצויד במצלמת CCD דיגיטלי 12 סיביות ותריס מבוקרת מחשב למדידת תחמוצת החנקן. השתמש מנורת קסנון 75 W כמקור האור.
הערה: בחר את גל עירור ופליטה עבור DA DAF-2 על ידי מסנן הפרעות (480/40 ננומטר) מראה dichroic(505 ננומטר) עם מחסום להקה עוברת (535/50 ננומטר). השתמש עדשת 20X אובייקטיבית (NA: 0.75) לאסוף את התמונות. כדי למזער photobleaching, מקם מסנן צפיפות ניטרלי (0.5 N) מול מסנן הפרעות ולהגביל את זמן החשיפה 0.12 שניות. - טען את התאים עם DA DAF-2 (5 מיקרומטר). Perfuse את המכשיר עם DA DAF-2 במשך כ 35-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. רשום את הבסיס של עוצמת הקרינה DAF-2 (FI DAF) לאחר הטעינה הראשונית.
הערה: DAF-2 DA שוהה ברציפות perfusate לאורך הניסוי 7. - איסוף תמונות DAF-2. רשום את הבסיס של FI DAF למשך 5 דקות. Perfuse את המכשיר עם ה- ATP (10 מיקרומטר) ולאסוף את התמונות למשך 30 דקות עם 1 במרווחים דקים. לאסוף את כל התמונות מאותה קבוצה של תאים באותו מישור המוקד.
6. ניתוח נתונים
- בחר ידני באזור של אינטרסים (ROIs) מהתמונות שנאספו ברמת תאים בודדת. כל אחדROI מכסה את השטח של תא אחד יחיד אשר יכול להיות שמציין את קווי מתאר הקרינה.
- פחת קרינת רקע ולחשב את FI הממוצע של כל ROIs.
- למדוד שינויים מושרים ATP ב EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור. לכמת שינויים המושרה ATP ב EC [Ca 2 +] i על ידי חישוב השינויים Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, שם FI 0 הוא FI הבסיס הממוצע במהלך זלוף אלבומין-רינגר לפני הוספת ATP) מינוס נמדד רקע. לכמת NO קצב הייצור על ידי ביצוע ההמרה ההפרש הראשון של FI DAF לאורך זמן.
הערה: הקורס הזמן של FI DAF מייצג ייצור NO המצטבר עם הזמן. לפיכך, לא קצב ייצור מחושב על בסיס הפרופיל של FI DAF תחת שני הבזליים ו- ATP מגורה תנאים. פרטים של ניתוח נתוני פרוצדורות תוארו פרסום קודם 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה מציג כמה מהתוצאות שהושגו עם רשת microvessel בתרבית שפותחה עם פרוטוקול זה. דפוס microchannel הוא רשת הסתעפות שלוש רמות (איור 1 א). בתכנון זה, סניפי ערוץ אמא רחבים 159 מיקרומטר לשתי 126 מיקרומטר ערוצים רחבים, וענפים שוב לארבעה 100 מיקרומטר ערוצי בת רחבים. סימולצית נומרית 3D בוצעה על מנת להעריך את הפצות לחץ גזירה תחת קצב הזרימה של 0.35 μl / min (איור 1 ב '), אשר מציין שלוש רמות שונות של מאמץ גזירה בתוך רשת microchannel זה. הזרימה למינרית בתוך microchannels צפויה להיות hydrodynamically יציב ללא הנוכחות של זרימה מופרעת או משנית. לאחר עובש המאסטר SU-8 היה מפוברק עם תהליך photolithography סטנדרטי (תרשים 1C), מכשיר PDMS היה מפוברק באמצעות ליתוגרפיה רך לשכפל את ne microchannelעיצוב twork לתוך הפיגום חדיר שקוף ואוויר (1D איור - E). לאחר זריעת EC (האיור 1F - G) ו 3-4 ימים של זלוף הרציף, ECS הגיעה מפגש ובהצלחה כיסתה את המשטחים הפנימיים של microchannels.
F- אקטין וגרעינים EC תויגו fluorescently בתוך הרשת ואייר עם תמונות confocal. תחת מאמץ הגזירה של 1.0 דיין / 2 סנטימטר, כ -30% של HUVECs מוארך לאורך כיוון הזרימה עם סיבי מתח מרכז גדלו, ואילו נשמרו הדפוס המרוצף שלה 70% והשאר עם היקפי F- תקטין 5 נשלטת. שינוי צורת תא הנגרמת הגזירה נראה פחות בולט מזה שנצפה בדרך כלל בתרביות תאי סטטי 2D. למעשה בתנאי in vivo, יש את ECS צורות תאים שונות בסוגים שונים של כלי, אבל לא לשנות צורת תא בקלות בתגובת צ'ה הזרימה nges. נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אם ההבדל הזה היה את התוצאות של גיאומטרית הערוץ וסביבת זלוף כי הם קרובים יותר לתנאי in vivo.
גם מדדנו בהצלחה שינויים מושרים ATP ב EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור (איורים 4 ו -5). עלייה זמנית הנגרמת ATP ב EC [Ca 2 +] i ו NO הייצור. Fluo-4 FI השיא הממוצע היה 187 ± 22% של קו הבסיס, שאירע בשעה 35 ± 10 שניות לאחר תחילת זלוף ATP. שיעור NO ייצור הוגדל מרמה בסיס של 0.15 ± 0.05 AU לדקה 1.18 ± 0.37 AU לדקה בתוך חמש הדקות הראשונות של חשיפת ATP. כל התוצאות דווחו כטעות תקן ± אומר (SE). הם להשוות את התוצאות הנגזרות venules שלמים perfused בנפרד 6,9,14,19.
p-together.within-page = "1"> 
איור 1: ייצור המכשיר microfluidic ו- EC הטעינה (א) תצוגה סכמטית של רשת microchannel.. זווית רוחב הסתעפות של microchannels מסומנים בכל רמות הסתעפות. (ב) סימולציה נומרית של חלוקת מאמץ הגזירה. קצב הזרימה הוא 0.35 μl / min. גובה microchannel לאחר פיתוח הוא 80 מיקרומטר. שתי דמויות אלה שונו מן הפרסום קודם עם פרטים נוספים 5. (ג) התפתחות עובש האמן. עובש מאסטר של רשת microchannel הוא מפוברק עם photoresist SU-8 על פרוסות סיליקון. (ד) תהליך ליתוגרפיה רך. תערובת PDMS היא casted על תבנית האב נרפאה בתנור. (E) Bonding PDMS ערוץ למצע. המצע משמש המכשיר הזה הוא SPI coverslipn מצופה בשכבה דקה של PDMS. הכניסה ו לשקע נוצרות עם אגרופן גומות. (F ו- G) טעינת EC. כ -10 μl של פתרון תא מושם על הכניסה. זרם עדין אז הוא המושרה על ידי הצבת פיפטה פסטר במוצא באמצעות זרימת נימי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונות Confocal של EC F- יקטין ברשת microchannel תרבותית (א) תצוגה סכמטית של עיצוב הרשת.. האזורים שנבחרו שמוצגים B - D מסומנים בתרשים. (B - D) תמונות Confocal של EC F- אקטין (אדום) גרעינים (כחול) של רשת microvessel במבחנה B 1. C 1 ו- D 1 הם הדימויים המוקרנים מן המחצית העליונה של ערימות התמונה microchannel, ו- B 2, C 2, ו- D 2 הם תחזיות תמונה מחציו התחתון של ערימות התמונה. א השקפת החתך הצביע כמו 1-1 ', 2-2', ו 3-3 'ב' 1 - D 1, סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תמונות אלה מעובדים מנתונים בפרסום הקודם 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: השוואות של הפצת VE-cadherin ברשת microvessel תרבותית עם monolayer EC התרבותי סטטי ורדיד mesenteric העכברוש ללא פגע (.
איור 4: עקב השפעות ATP ב EC [Ca 2 + p>] i. הניסויים נערכו בין 4 מכשירים 7 עד 12 ROIs (יחיד ECS) לכל מכשיר נבחרו לניתוח נתונים. (א) את מהלך הזמן של ATP (10 מיקרומטר) -induced שינויים EC [Ca 2 +] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) מניסוי נציג אחד. (ב) התמונות של ניסוי הנציג (נתונים מוצגים ב א). זהו נתון שפורסם בעבר 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: ATP-induced ייצור NO הניסויים נערכו 3 מכשירים 11 עד 12 ROIs (יחיד ECS) לכל מכשיר נבחרו לניתוח נתונים.. (א DAF ± SE, עזב ציר Y) ב ECS בתנאים בסיסיים ואחרי חשיפת ATP. את לא קצב הפקה (df / dt, קו מקווקו), נגזר מרת ההפרש הראשונה של DAF FI שנצבר (ציר Y מימין). (ב) נציג תמונות מניסוי אחד. FI DAF גדל עוד יותר לאחר ניתרופרוסיד NO התורם, נתרן (SNP), נוסף perfusate, מה שמעיד על כמות מספקת של תאיים DAF-2 להגיב עם NO. זהו נתון שפורסם בעבר 5. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לפיתוח רשת microvessel התרבותי, האפיון של צמתי EC ו cytoskeleton הפצת F- תקטין, ואת מדידות כמותיות של EC [Ca 2 +] i ו NO ייצור באמצעות מכשיר microfluidic. מכשיר microfluidic perfused מספק מודל במבחנה המאפשר סימולציה קרובה של גיאומטריות כלי דם vivo פנימה תנאי זרימת גזירה. מאז רשת microvessel התרבותית יכולה להיוצר על ידי ECS אדם מן המעלה הראשונה, גישה זו יכולה לשמש ככלי שימושי כדי לחקור כיצד פתולוגית מרכיבי דם שינו ממדגמים חולים להשפיע ECS אדם על ידי זלוף ישיר של דגימות דם חולה microvessels התרבותי ולספק תובנות קליניים בעיות. ECS האדם פתחה microvessels יכולה לשמש גם להקרנת סמים להימנע הפערים הפוטנציאליים בתגובות סמים בין ברקמות אדם וחיות.
ve_content "> המצע של מכשירים microfluidic לראות בפרוטוקול זה הוא תלוש כיסוי זכוכית (150-180 מיקרומטר) ספין מצופה בשכבה דקה של PDMS. שכבה דקה זו של PDMS חיונית ברזולוציה גבוהה בזמן אמת בשידור חי רקמות הדמיה, כי מטרות הצמצם המספריות הגדולות בדרך כלל יש מרחק עבודה קצר. הזרימה למינרית בתוך (טווח submillimeter) microchannel יש מספר ריינולדס נמוך מאוד, ואת הפרש הלחץ קשור באופן ליניארי לזרימה, ובכך חלוקת מאמץ הגזירה היא אך ורק תלוי על גיאומטרית הערוץ. לכן, זה יכול להיות נשלט היטב על ידי משאבת זלוף דיוק גבוה 20. במחקר הנוכחי שלנו, מאמץ הגזירה להחיל לרשת microvessel התרבותית HUVEC היה בין 1 עד 10 דיין / 2 סנטימטר, שנמצא בתוך מגוון של מאמץ הגזירה נמדד במערכת הורידים 21,22. המערכות מאקרו-נוזליים כגון תא זרימה במקביל חסר דפוסי זרימת מורכבים. בתאי זרימה בקנה מידה גדול יותר (מ"מ-ס"מ טווח), ECS רק גדלה בדרך כלל בתוך המשטח התחתון (בשכבת 2D), חסרת הדמיון הגיאומטרי microvessels in vivo. כאשר הרוחב של תא הזרימה נגמר 2 מ"מ, זרימת הומוגנית היא כלוא בתוך אזור זה הוא בדרך כלל כמה מילימטרים משם המשקע / הכניסה, וכמה מאה מיקרונים מהקיר בצד 23. כאשר הרוחב של החדר הוא עלה ל בטווח של סנטימטרים, את הזרימה תהיה להתמיין מייעלת שונה ואת מהירויות הזרימה תשתנינה על פני כל השטח 24. בנוסף, תא זרימה בקנה מידה גדול יותר צורכת לפחות 100 פעמים יותר perfusate כדי להשיג את אותה מאמץ הגזירה כפי כי microchannels. חלוקת מאמץ הגזירה בתוך רשת microchannel ניתן לדמות באמצעות כלי מידול מספריים, ואת משוואות Navier-סטוקס דחיס הנייחים ניתן לפתור על ידי רוב תוכנות אלמנטים סופיות.המכשיר microfluidic יכול להתבצע עם Singlתהליך microfabrication מסכת דואר. ההצלחה של פיתוח microvessel התרבותי, לעומת זאת, דורשת תשומת מיוחדת הפרטים. לאחר טעינת הפתרון לתוך microchannels, כל מכשיר צריך להיבדק ללכידת בועה מתחת למיקרוסקופ לפני זריעת EC. אם בועה מתרחשת, זה עדיין אפשרי לכפות את זה בשלב זה על ידי החלת לחץ הידראולי על המפרצון עם לשקע סגור, כמו PDMS הוא חומר אוויר חדיר. כדי לשמור על שיעור זלוף רצוי, צמוד ללא דליפה הוא הכרחי עבור כל אחד מחיבורי מחט / צינורות. אגרופן הגומות המתאים וגודל צינורות הם קריטיים כדי להשיג צמוד. כדי להבטיח אספקה מדויקת של קצב הזרימה, את המזרק על משאבת זלוף המכשיר צריך להיות ממוקם באותה הרמה. כדי לשנות את perfusate, הצינורות שיוכנסו צריכים להיות מנותקים בעדינות מהמכשיר כדי למנוע מתיחות. כדי להגדיל מאמץ הגזירה, עליות צעד (כגון 10 מדרגות העלייה 18 שעות) הם recommenטוליפ אין כדי למנוע שינויי זרימה פתאומיים שנגרם פילינג EC.
מחקרים קודמים שבוצעו על microvessels שלמים perfused בנפרד ציין כי עקב השפעות אגוניסט ב EC [Ca 2 +] i, ואת synthase תחמוצת החנקן לאחר האנדותל (eNOS) הפעלה וייצור NO הם איתות הכרחי חדירות כלי הדם גדל בתנאים דלקתית 6,7 , 9-13,25. בפרוטוקול זה, אנו בוחרים ATP כמו אגוניסט הנציג, מאז שהוא משתחרר בדרך כלל על ידי כדוריות דם אדומות, טסיות מצטברים, ורקמות פצועות או בתנאים דלקתיים in vivo. אינדיקאטור סידן הקרינה, Fluo-4 לפנות בוקר, שימש למדידת השינויים האנדותל [Ca 2 +] i לאחר חשיפה ATP. הנציבות האירופיות [Ca 2 +] i תגובות microvessels התרבותית דומות לאלה שנמצאו microvessels השלם 7,9. מדידת ייצור EC NO כבר מאתגרת מבחינה טכנית עבור ביולוגים.עד כה, לא היה שום חיווי ניאון המאפשר זיהוי של שינויים דינמיים בשום ריכוז באופן דומה האינדיקטורים סידן. DAF-2 DA כבר בשימוש נרחב כדי להעריך NO ייצור. עם זאת, השימוש הנכון, פרשנות נתונים, וניתוח נתונים צריכים למשוך תשומת לב גולשים. מאז השינוי הכימי של DAF-2 DAF-2T בנוכחות NO הוא בלתי הפיך (המרה דרך אחת) 26, הפרופיל עוצמת הקרינה DAF זוהה אינו מייצג את השינויים ללא ריכוז. במקום זאת, הוא מציין את הייצור DAF-2T שנצבר עם הזמן. על בסיס זה שנצבר קרינת DAF-2 (FI DAF) עקום, קצב הפקת NO (df / dt) ניתן לגזור על ידי מרת ההפרש הראשונה של FI DAF 7,11. כלומר, שיפוע עקום FI מציין את קצב ההפקה NO ואת שלב המפנה מציין שאין עוד עלה NO הייצור. לאחר ההמרה, הנתונים המופקים יקרו בפרוטוקול זהesented הן הבסיס NO קצב הייצור ואת השינויים בייצור NO בתגובה ATP עם רזולוציה של זמן ומרחב ברמות EC הפרט בתוך הרשת microvessel.
נכון לעכשיו PDMS כבר בשימוש נרחב ליישומים מיקרו, כפי שהוא אלסטומר רך אופטית שקוף, לא רעיל, וגז חדיר 27-30. עם זאת, מאז PDMS אינו מים חדירים, לא יכולנו למדוד ישירות את החדירות של monolayer EC. כדי להתגבר על מגבלה זו, יישומים מסוימים שונה המבנים קיר ערוץ כגון שילוב קרום חדיר לתוך התעלה 31, או יצירת "פתחי החלונות" חדיר עם עמודי מיקרו או-חורים מיקרו 32,33, בעוד שאחרים כבר התמקדו שינוי של חומרים המכשיר כגון באמצעות מכשירים הידרוג'ל או הידרוג'ל / מכשירים היברידיים PDMS 17,34-36. החסרונות של מכשירים כאלה הם הטבע הפגיע שלהם להתייבשות מ חלש יחסית שלהםנכסי echanical לעמוד מתח או לחץ. פיתוח עתידי של חומר חדיר עם חוזק מכאני יהיה לשפר את המכשיר ואת הפוטנציאל שלה עבור יישומים ביולוגיים רחבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים שום אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות ודם המכון מעניק HL56237, המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מכון DK97391-03, הקרן הלאומית למדע (NSF-1,227,359 והרווח למניה-1,003,907).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
- Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
- Michel, C. C., Curry, F. E.
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G.
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
- Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797 (2015).
- He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
- Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
- Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
- He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
- Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
- Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
- He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
- He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
- Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
- Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
- Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
- D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
- Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
- Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
- Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
- Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
- Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
- McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
- Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
- Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
- Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
- Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
- Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
- Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
- Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).
![פיתוח ואפיון של<em> במבחנה</em> כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup> 2 +</sup>]<sub> i</sub> וייצור Nitric Oxide](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/54014.jpg)
