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Neuroscience

ब्रेन स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Published: June 15, 2016 doi: 10.3791/54024
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Psychiatry, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

इस प्रोटोकॉल पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन के लिए बुनियादी प्रक्रियात्मक चरणों का वर्णन है। इस तकनीक में न्यूरॉन्स की बिजली के व्यवहार के अध्ययन की अनुमति देता है, और जब मस्तिष्क के स्लाइस में प्रदर्शन किया, न्यूरॉन्स है कि अभी भी अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट में एकीकृत कर रहे हैं से विभिन्न न्यूरोनल कार्यों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

Abstract

पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक electrophysiological तकनीक है कि न्यूरॉन का एक बड़ा हिस्सा बिजली के गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है। इस विन्यास में, micropipette कोशिका झिल्ली, जो वर्तमान रिसाव पहले से इस्तेमाल किया intracellular तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग विधि से रोकता है और इस तरह प्रदान करता है और अधिक सटीक आयनिक वर्तमान माप के साथ तंग संपर्क में है। प्रतिष्ठित, पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तैयारी के विभिन्न प्रकार, सेल संस्कृति मॉडल, अलग न्यूरॉन्स, मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स सहित में न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया जा सकता है, और बरकरार anesthetized या जाग पशुओं में। सारांश में, इस तकनीक को बेहद उत्तेजनीय कोशिकाओं के निष्क्रिय और सक्रिय biophysical गुणों को समझने के लिए योगदान दिया है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि इस पर जानकारी प्रदान करता है कैसे विशिष्ट जोड़तोड़ (जैसे, औषधीय, प्रयोगकर्ता प्रेरित प्लास्टिसिटी) विशिष्ट neuronal कार्यों या सी को बदल सकता हैवास्तविक समय में hannels। इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा झिल्ली के महत्वपूर्ण उद्घाटन आंतरिक पिपेट समाधान स्वतंत्र रूप से कोशिका द्रव्य में फैलाना, शुरू दवाओं, जैसे, एगोनिस्ट या विशिष्ट intracellular प्रोटीन के विरोधी के लिए साधन उपलब्ध कराने, और पड़ोसी कोशिकाओं में उनके कार्यों को बदलने के बिना इन लक्ष्यों को जोड़ तोड़ की अनुमति देता है। यह लेख पूरे सेल रिकॉर्डिंग पर ध्यान दिया जाएगा, एक तैयारी अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट, अर्थात् में न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग, एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में का लाभ दिया है कि मस्तिष्क के स्लाइस में न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, जब उचित औषध विज्ञान के साथ संयुक्त, इस तकनीक को विशिष्ट neuroadaptations कि इस तरह की शिक्षा, दुरुपयोग की दवाओं के लिए जोखिम है, और तनाव के रूप में अनुभव है, के किसी भी प्रकार के बाद हुआ की पहचान की अनुमति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। सारांश में, मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग पूर्व vivo तैयारी लंबे समय से स्थायी परिवर्तन में मापने के साधन उपलब्ध करातेन्यूरोनल कार्यों में उस बरकरार जाग पशुओं में विकसित किया है।

Introduction

पैच दबाना तकनीक, एक electrophysiological तकनीक है कि 1970 के दशक 1,2 में विकसित किया गया है, जीने के ऊतकों में एक या कई आयन चैनल कार्यों के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक उपकरण है। विभिन्न पैच विन्यास है कि प्राप्त किया जा सकता है के बीच, पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग न्यूरॉन का एक बड़ा हिस्सा के बिजली के व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। प्रतिष्ठित, इस तकनीक इन विट्रो में या तो मस्तिष्क स्लाइस, हौसले से अलग न्यूरॉन्स पर, या सेल संस्कृति मॉडल 3 पर किया जाता है। जब दिमाग में न्यूरॉन्स स्लाइस पर प्रदर्शन किया, इस तकनीक के कई फायदे प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से: (i) न्यूरॉन्स कुछ हद तक है कि अपेक्षाकृत संरक्षित मस्तिष्क सर्किट में दर्ज हैं, और सेल संस्कृति की तैयारी की तुलना में, एक वातावरण है कि physiologically प्रासंगिक 3 है प्रदान करते हैं। यह जल्दी कब्जा, या यहां तक ​​कि वास्तविक समय में निगरानी, ​​सेलुलर और आणविक घटनाओं है कि तीव्र Pharmacolog के किसी भी प्रकार से शुरू हो रहे अनुमति देता हैराजनैतिक जोड़तोड़ - एक अस्थायी समाधान है कि इन विवो परिस्थितियों में शास्त्रीय का उपयोग कर हासिल नहीं किया जा सकता है; (ii) की क्षमता नेत्रहीन मस्तिष्क स्लाइस में मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान करने के लिए दोनों जब वे फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त मस्तिष्क क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए और विशिष्ट न्यूरॉन्स के लिए उच्च क्षेत्रीय विशिष्टता 3 की अनुमति देता है; (iii) (intracellular रिकॉर्डिंग के लिए एक तेज micropipette के साथ झिल्ली puncturing के विपरीत) प्लाज्मा झिल्ली का एक महत्वपूर्ण भाग खोलने के द्वारा सेल के intracellular अंतरिक्ष के लिए उपयोग 4। बारी में, यह सामग्री या आंतरिक समाधान रचना विशिष्ट आयनों की एकाग्रता इसलिए आणविक लक्ष्यों को संशोधित किया जा करने के लिए या सेलुलर तंत्र अलग अलग परिस्थितियों में अध्ययन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पूरे सेल विन्यास, किसी भी विशिष्ट औषधीय एजेंट (जैसे, विरोधी) की स्थापना पर एक रिकॉर्डिंग micropipette (पैच पिपेट) समाधान सीधे कोशिका द्रव्य में फैलाना और उसके putat पर कार्य करेगा करने के लिए जोड़ सकते हैं किपड़ोसी कोशिकाओं में लक्ष्य समारोह बदलने के बिना intracellular लक्ष्यों ive। इसके अतिरिक्त, तेज micropipette रिकॉर्डिंग की तुलना में, पैच दबाना इलेक्ट्रोड की नोक पर बड़े खोलने कम प्रतिरोध, कम प्रतिस्पर्धा शोर, और सेल 4 के अंदर करने के लिए इस तरह बेहतर बिजली के पास हैं। हालांकि, उस पिपेट नोक पर बड़े खोलने सेल डायलिसिस के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और इस तरह intracellular आणविक मशीनरी है कि जैविक घटना है कि अध्ययन 5,6 के तहत कर रहे हैं की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है के नुकसान पर ध्यान दें। इस मामले में, तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग अधिक उपयुक्त हो सकता है। रिकॉर्डिंग इस प्रकार का एक ताकना कि, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जिससे intracellular अंतरिक्ष और आंतरिक पिपेट समाधान के बीच आयन एक्सचेंज का सबसे रोकने उन लोगों की तुलना में काफी छोटा है साथ micropipettes की आवश्यकता है।

अनुभव (तीव्र या पुराना) का किसी भी रूप, सहित 7-10 दुरुपयोग 11,1 की दवाओं के लिए जोखिम सीखने,2, तनाव 13,14, आदि, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में neuronal समारोह के विभिन्न पहलुओं को बदल सकते हैं। क्योंकि इन परिवर्तनों अक्सर (दिनों घंटे) विकसित करने के लिए समय की आवश्यकता है, जानवरों से मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग है कि एक विशिष्ट अनुभव से गुजरा है शोधकर्ताओं ने इन परिवर्तनों की पहचान करने की अनुमति देते हैं। असल में, कई (यदि सभी नहीं) घटक है कि न्यूरोनल कार्य (जैसे, ligand सक्रिय आयन चैनल, वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टरों), और इस तरह मस्तिष्क सर्किट गतिविधि और व्यवहार, अनुभव से बदला जा सकता है (अनुभव पर निर्भर में भाग लेने प्लास्टिसिटी) 10,15-17। न्यूरोनल स्तर पर, मस्तिष्क सर्किट गतिविधि synaptic के बीच लगातार बातचीत (जैसे, ग्लूटामेट संचरण) और आंतरिक सेलुलर excitability कारकों (जैसे, axosomato-वृक्ष के समान आयन चैनल से उभर रहे हैं: पोटेशियम, K +, सोडियम, ना + और ​​कैल्शियम, सीए 2 )। Whol का उपयोग कर विशेष परिस्थितियों मेंई-सेल पैच दबाना electrophysiological तकनीक, synaptic बनाम आंतरिक excitability में परिवर्तन से होने वाले विशेष रूप से संकेत परिवर्तन अलग किया जा सकता है।

ज्यादातर मामलों में, synaptic excitability पूरे सेल वोल्टेज दबाना तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया है। यह रिकॉर्डिंग मोड आयन धाराओं [जैसे, α अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की माप (अनुमति देता है AMPA रिसेप्टर्स) और एन मिथाइल-डी aspartic एसिड रिसेप्टर्स (NMDA रिसेप्टर्स)] न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से एक सेट वोल्टेज पर झिल्ली क्षमता धारण करते हुए। इधर, प्रयोगकर्ताओं आंतरिक micropipette समाधान है कि सीज़ियम होते हैं (सीएस +), कश्मीर + चैनलों की एक व्यापक अवरोधक (कुंजी आंतरिक excitability कारकों) का उपयोग करें। पूरे सेल विन्यास की स्थापना करने पर, intracellular अंतरिक्ष में सीएस + के प्रसार कश्मीर + चैनलों रोकेंगे, और इस तरह दोनों एक अपेक्षाकृत कुशल अंतरिक्ष दबाना और पूर्व अनुमति देगाअन्य मापन पर आंतरिक excitability कारकों के प्रभाव वेंट। अंतरिक्ष दबाना मुद्दों, यानी, पूरे सेल वोल्टेज दबाना करने के लिए कठिनाई, उठता है कि जब अनियमित आकार की कोशिकाओं (जैसे, न्यूरॉन्स), और विशेष रूप से 18,19 कुंज एक विशाल और जटिल वृक्ष के समान के साथ न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग। क्योंकि दैहिक वोल्टेज क्लैंप खराब नियंत्रण न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान पेड़ में वोल्टेज, अध्ययन के तहत वृक्ष के समान विद्युत संकेतों के विभिन्न पहलुओं को एक वृक्ष के समान दूरी पर निर्भर ढंग से विकृत कर रहे हैं। (कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ, ACSF) ऐसे picrotoxin (गामा aminobutyric एसिड, गाबा एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी) या kynurenic एसिड (ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की व्यापक अवरोधक) के रूप में औषधीय उपकरण कोशिकी समाधान में भंग के साथ संयुक्त, इस तकनीक ग्लूटामेट की माप की अनुमति देता है receptor- और क्रमश: गाबा ए आर मध्यस्थता धाराओं।

इसके विपरीत, आंतरिक excitability आमतौर पर वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग मोड में मूल्यांकन किया है।के रूप में वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग करने का विरोध किया, इस रिकॉर्डिंग मोड न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से बह आयन धाराओं से प्रेरित झिल्ली क्षमता में बदलाव की माप की अनुमति देता है। आमतौर पर, आंतरिक excitability में परिवर्तन न्यूरॉन्स कार्रवाई की क्षमता है, जो दोनों ना + और ​​कश्मीर + चैनलों की आवश्यकता उत्पन्न करने के लिए क्षमता में परिवर्तन के माध्यम से मूल्यांकन किया है। इसलिए, जब वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, micropipettes एक आंतरिक समाधान है कि कश्मीर + बजाय सीएस + शामिल है के साथ भर रहे हैं। औषधीय एजेंटों कि ग्लूटामेट और गाबा ब्लॉक एक रिसेप्टर की मध्यस्थता धाराओं ACSF में भंग के साथ संयुक्त, इस प्रयोगात्मक डिजाइन synaptic excitability में संभावित परिवर्तनों से दूषित किया जा रहा बिना neuronal फायरिंग के लिए आंतरिक कारकों (जैसे, कश्मीर + चैनल) के योगदान की माप की अनुमति देता है कारकों।

यह लेख बुनियादी आवश्यक प्रक्रियात्मक चरणों का वर्णन करेंगे टीओ (i) स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइस तैयार; (Ii) पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने, और (iii) synaptic और आंतरिक excitability आकलन करने के लिए बुनियादी मानकों की निगरानी।

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Protocol

सभी प्रयोगों UT दक्षिण संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार बाहर किया गया है, और इतने के रूप में तनाव, बेचैनी, और दर्द प्रायोगिक पशुओं द्वारा अनुभव को कम से कम करने के लिए चुने गए हैं।

1. समाधान

नोट: अग्रिम में micropipette आंतरिक समाधान तैयार करें। सबसे बुनियादी प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए, समाधान के दो प्रकार के पर्याप्त होना चाहिए: सीएस + आधारित और कश्मीर + आधारित समाधान।

  1. सीएस का उपयोग + आधारित समाधान (जैसे, सी + gluconate समाधान, सामग्री देखें) वोल्टेज दबाना प्रयोगों के लिए। आरटी पर तैयार करें।
    1. 3.54 छ CsOH (~ 2.01 एमएल) के साथ 4.62 जी डी gluconic एसिड (~ 3.696 एमएल) के मिश्रण से 117 मिमी सीएस-Gluconate समाधान तैयार है।
    2. DDH 2 हे 90 मिलीलीटर जोड़ें और इसे 30 मिनट के लिए संतुलित करते हैं।
    3. 0.4 मिमी EGTA = 15.2 मिलीग्राम; 2.8 मिमी NaCl = 16.4 मिलीग्राम, ठोस सामग्री (20 मिमी HEPES = 0.476 ग्राम जोड़ें 5 मिमी tetraethylammonium (चाय) क्लोराइड = 83 मिलीग्राम)।
    4. DDH 2 हे में जोड़े ~ 97 मिलीलीटर।
    5. : 7.2 से 50% CsOH के साथ समाधान के पीएच को समायोजित - 7.3।
    6. परासारिता और सही जाँच करें अगर DDH 2 ओ के साथ की जरूरत
      नोट: एक अच्छी रेंज ~ 280 - 285 mOsm। (- 310 mOsm, हमारी प्रयोगशाला में 300 mOsm आमतौर पर 300) मानक ACSF की परासारिता नीचे 20 mOsm - इष्टतम परासारिता 15 होना चाहिए। परासारिता समाधान विशिष्ट रचनाओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    7. -20 डिग्री सेल्सियस या नीचे में 1,000 μl और स्टोर करने के लिए विभाज्य।
    8. तैयार है, विभाज्य, फ्रीज, और रिकॉर्डिंग के दिन पर आंतरिक समाधान के लिए एटीपी / जीटीपी जोड़ें।
      1. 10 मिलीग्राम जीटीपी के लिए 64.63 मिलीग्राम एटीपी जोड़ें और DDH 2 ओ के 637.11 μl में भंग
      2. -20 डिग्री सेल्सियस या नीचे में 10 μl aliquots और दुकान तैयार करें। प्रयोग के दिन पर आंतरिक समाधान के 1,000 μl के साथ प्रत्येक 100x विभाज्य मिक्स। एक बार एटीपी / जीटीपी आंतरिक समाधान के लिए जोड़ा गया है, एटीपी / जीटीपी degradati को रोकने के लिए बर्फ पर इसे बनाए रखने केपर।
  2. कश्मीर का प्रयोग करें + आधारित समाधान (जैसे, कश्मीर Gluconate समाधान, सामग्री देखें) दोनों current- और वोल्टेज दबाना प्रयोगों जहां + K conductances कार्यात्मक रहने के लिए इतना है कि neuronal फायरिंग का आकलन किया जा सकता है। आरटी पर तैयार करें।
    1. वांछित अंतिम मात्रा के अनुसार सभी सामग्री वजन। 120 मिमी कश्मीर Gluconate = 2.81 छ समाधान के 90 मिलीलीटर, तैयार करने के लिए; 20 मिमी KCl 0.149 जी =; 10 मिमी HEPES = .238 छ; 0.2 मिमी EGTA = 0.008 छ; 2 मिमी 2 MgCl = 0.021 जी।
    2. प्रयोग के लिए पर्याप्त DDH 2 हे अंतिम समाधान मात्रा का 90% तक पहुँचने के लिए। यह सुनिश्चित करना चाहिए कि पर्याप्त कमरे में पीएच और परासारिता समायोजन के लिए छोड़ दिया है।
    3. उनका कहना है और सभी सामग्री मिश्रण के बाद, सुनिश्चित करें कि समाधान पीएच मापने से पहले स्पष्ट है बनाते हैं।
    4. कश्मीर + हाइड्रॉक्साइड (KOH) का उपयोग कर 7.3 - जबकि लगातार समाधान क्रियाशीलता, 7.2 पीएच को समायोजित करें।
    5. पीएच समायोजन करने के बाद, osmometer और विज्ञापन का उपयोग285 mOsm - बस के लिए 280 परासारिता।
      नोट: इष्टतम परासारिता 15 होना चाहिए - मानक ACSF की परासारिता नीचे 20 mOsm (आमतौर पर 300 - 310 mOsm, हमारी प्रयोगशाला में 300 mOsm)। परासारिता समाधान विशिष्ट रचनाओं के आधार पर भिन्न हो सकते हैं।
    6. -20 डिग्री सेल्सियस या नीचे में 1,000 μl और स्टोर करने के लिए विभाज्य।
    7. तैयार है, विभाज्य, फ्रीज, और रिकॉर्डिंग के दिन पर आंतरिक समाधान के लिए एटीपी / जीटीपी जोड़ने (कदम 1.1.8 देखें)।
  3. मानक ACSF (सामग्री देखें) के 1 एल तैयार करें।
    नोट: हम हमारी प्रयोगशाला में इस विधि का उपयोग जब मस्तिष्क स्लाइस में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स (MSNs) रिकॉर्डिंग, तथापि, व्यंजनों प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकती है, और इसलिए, हम प्रयोगकर्ता की सिफारिश एक नुस्खा है कि नियमित तौर पर जब ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र रिकॉर्डिंग इस्तेमाल का उपयोग ।
  4. विच्छेदन ACSF तैयार (टुकड़ा करने की क्रिया समाधान, ~ 125 मिलीलीटर नोट:। सटीक मात्रा टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष के आकार पर निर्भर करती है, क्योंकि यह पूरी तरह से मस्तिष्क डूब चाहिए होगा) में उपयोग के लिए2.8 - 2.2 कदम।
    1. 5 मिमी तैयार kynurenic एसिड पर्याप्त मात्रा में मानक ACSF में (ग्लूटामेट रिसेप्टर प्रेरित excitotoxic प्रक्रियाओं को ब्लॉक करने के लिए) टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान मस्तिष्क डूब। kynurenic एसिड भंग मदद करने के लिए एक sonicator का प्रयोग करें।
      नोट: sonication की लंबाई मात्रा और समाधान में ठोस की मात्रा पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकती है। (- हमारी परिस्थितियों में 2 मिनट के आसपास 1) समाधान प्रक्रिया के अंत तक स्पष्ट होना चाहिए।
    2. शांत हो जाओ बर्फ की एक बाल्टी में 95% ओ 2, 5% सीओ 2 गैस के साथ बुदबुदाती है जबकि जब तक तापमान 0 तक पहुँच जाता है - 2 डिग्री सेल्सियस।
  5. रिकॉर्डिंग के लिए ACSF तैयार करें।
    1. मानक ACSF के 1 एल लो (या जो भी 1.3 चरण में तैयार समाधान से छोड़ दिया है), जो करने के लिए उचित औषधीय एजेंटों की योजना बनाई प्रयोगों के आधार पर जोड़ा जा सकता है।
      1. उदाहरण के लिए, 100 माइक्रोन के picrotoxin जब उत्तेजक बाद synaptic धाराओं या क्षमता (EPSCs या EPSPs), ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी रिकॉर्डिंग kynure जोड़ने (एनआईसी एसिड, 2 मिमी, या साथ CNQX 10 माइक्रोन के डी-APV 50 माइक्रोन) के जब निरोधात्मक बाद synaptic धाराओं या क्षमता (IPSCs या IPSPs), और दोनों picrotoxin और ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी रिकॉर्डिंग जब synaptic घटनाओं से किसी भी प्रभाव के अभाव में neuronal फायरिंग का आकलन करने का एक संयोजन।

2. टुकड़ा तैयारी

  1. निर्माण या एक टुकड़ा वसूली कक्ष प्राप्त करते हैं।
    ध्यान दें: एक वसूली कक्ष के लिए सिद्धांत सरल है और प्रयोगशाला (चित्रा 1) में बनाया जा सकता है। संक्षेप में, चैम्बर एक संदूक जिसमें एक टोकरी एक स्तर है कि ACSF की सतह की तुलना में कम है पर मस्तिष्क स्लाइस धारण करने के लिए डाला जाता है। विभिन्न वैज्ञानिक कंपनियों को भी टुकड़ा वसूली कक्षों बेचते हैं।
    1. एक 30 सीसी सिरिंज काटने से; - (6 मिमी उच्च 4) (बी, उच्च विचार चित्रा 1 ए, साइड देखें) एक उदाहरण के रूप में, चार अंगूठियां प्राप्त करते हैं। फिर, गोंद फैला जाल (जैसे, एक नायलॉन अस्पताल से काटाई) के छल्ले के एक तरफ करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 1 बी) पकड़ और अंगूठियां एक साथ गोंद के लिए।
      नोट: एक गोंद बंदूक का इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. एक बार चार अंगूठियां चिपका रहे हैं, ठीक मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 1 सी और डी) से ऑक्सीजन बुलबुले हटाने के छल्ले (चित्रा 1 ए और बी) में से दो को एक घुमावदार समद्विबाहु चतुर्भुज के आकार का प्लास्टिक दीवार गोंद। जैसा कि चित्र -1 डी में दिखाया गया है, प्लास्टिक दीवारों के रूप में एक ही पक्ष पर एक ऑक्सीजन diffusing प्रणाली (यहाँ, एक गैस फैलाव ट्यूब) डालें।
  2. 2 डिग्री सेल्सियस - टुकड़ा करने की क्रिया करने से पहले, आक्सीजन (95% 2 हे / 5% सीओ 2) और टुकड़ा करने की क्रिया समाधान नीचे शांत करने के लिए 0 (1.4 कदम देखें)।
  3. आरटी पर मानक ACSF के साथ कस्टम वसूली चैम्बर भरें। सुनिश्चित करें कि ACSF अच्छी तरह से ऑक्सीजन युक्त है - वसूली कक्ष में स्लाइस रखने से पहले (20 से 30 मिनट, समय चैम्बर मात्रा के अनुसार भिन्न हो सकते हैं)। सुनिश्चित करें कि गैस के बुलबुले प्रत्यक्ष चुनाव में नहीं आते हैंस्लाइस के साथ चालबाजी या उन्हें बाधित।
  4. रेखा बर्फ के साथ vibratome आइस ट्रे और ठंडे पानी इतना है कि टुकड़ा करने की क्रिया चैंबर के एक आधे के लिए एक तिहाई डूबे हुए है साथ भरें। ध्यान से एक ऑक्सीजन वितरण प्रणाली (जैसे, गैस diffusing पत्थर) और टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में एक तापमान जांच इसलिए न तो आइटम ब्लेड आंदोलन या टुकड़ा हेरफेर के साथ हस्तक्षेप जगह है।
  5. विच्छेदन क्षेत्र और उपकरण मस्तिष्क निकालने और वांछित मस्तिष्क क्षेत्र विदारक के लिए आवश्यक तैयार करें।
    नोट: सटीक प्रदर्शन विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र पर निर्भर करेगा विच्छेदन अध्ययन के रूप में विभिन्न मस्तिष्क संरचना अलग विमानों (जैसे, राज्याभिषेक, बाण, या क्षैतिज स्लाइस।) में टुकड़ा करने की क्रिया की आवश्यकता होगी।
    1. एक Underpad पर निम्नलिखित उपकरण की जगह: शिरच्छेद कैंची, छुरी, लघु सीधे तेज टिप कैंची, पोत केन्युलेशन संदंश (जैसे rongeurs के रूप में या एक विस्तृत टिप के साथ किसी भी शल्य चिकित्सा उपकरण, जो चूहे खोपड़ी के लिए अधिक उपयुक्त है), घुमावदार hemostatic संदंश, TWeezers, रंग, रंग, फिल्टर पेपर, पेट्री डिश, एकल बढ़त रेजर ब्लेड, और cyanoacrylate गोंद scooping।
  6. तापमान 0 तक पहुँच जाता है - 2 डिग्री सेल्सियस, टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष (बफर ट्रे) टुकड़ा करने की क्रिया समाधान हस्तांतरण।
  7. isoflurane का उपयोग कर एक सुखाना कक्ष में माउस anesthetize। सटीक राशि का इस्तेमाल किया चैम्बर के आकार के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, लेकिन एक छोटे से पिंजरे shoebox के लिए कुछ बूंदों का उपयोग करें (~ 3 - 4)। (; यहाँ वर्णित शर्तों के लिए चारों ओर 15 सेकंड उत्तेजनाओं स्पर्श का जवाब नहीं) पिंजरे प्रदान की गई स्थिर तक में माउस छोड़ दें। सुनिश्चित पशु गहरा anesthetized है, तो सिर काटना करने से पहले दिल की धड़कन बंद हो जाता है (सेल व्यवहार्यता को बढ़ाता है) पूंछ और पैर चुटकी परीक्षण प्रदर्शन करना।
    नोट: उचित औचित्य के साथ, कुछ प्रयोगशालाओं प्राधिकरण आदेश संभव excitotoxic प्रक्रियाओं के रूप में के रूप में ज्यादा कम करने और सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए लाइव शिरच्छेद प्रदर्शन करने के लिए प्राप्त करते हैं।
  8. विच्छेदन प्रदर्शन।
    नोट: मस्तिष्क होना चाहिएतेजी से निकाले (<45 सेकंड)।
    1. छुरी का प्रयोग व्याख्यान चबूतरे से खोपड़ी दुम के शीर्ष पर सतही त्वचा में कटौती।
    2. सिर के प्रत्येक पक्ष पर खोपड़ी छील।
    3. लघु सीधे तेज टिप कैंची का प्रयोग, सेरिबैलम दूर करने के लिए lambdoid सिवनी साथ interparietal थाली में कटौती। पश्चकपाल हड्डी निकालें।
    4. एक ही कैंची का प्रयोग, बाण के सिवनी में कटौती।
    5. प्रत्येक पार्श्विका हड्डियों नीचे पोत केन्युलेशन संदंश (या rongeurs अगर एक चूहे की खोपड़ी तोड़ने) स्लाइड और मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खींच।
    6. घुमावदार hemostatic संदंश का प्रयोग, उन्हें तोड़ने के लिए ललाट हड्डियों चुटकी, तो चिमटी या पोत केन्युलेशन संदंश का उपयोग टूटी हुई हड्डियों को हटा दें। कट और के रूप में धीरे संभव के रूप में ड्यूरा मेटर को हटाने के रूप में यह विच्छेदन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
    7. मस्तिष्क के नीचे रंग स्लाइड और धीरे खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क खींच टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष (बफर ट्रे) पहले ठंडा ACSF के साथ भर में जगह के लिए। मस्तिष्क चलो2 मिनट - 1 के लिए शांत हो जाओ।
    8. , बर्फ और बर्फ के पानी कुछ अधिक से अधिक सतह से संपर्क की अनुमति देने के साथ एक पेट्री डिश भरने के द्वारा विच्छेदन मंच तैयार करें अपनी ढक्कन के साथ कवर और शीर्ष पर एक फिल्टर पेपर जगह है। ठंड ACSF के साथ फिल्टर पेपर गीले।
    9. एक बार मस्तिष्क ठंडा हो जाता है, बर्फ से भरे पेट्री डिश पर मस्तिष्क जगह है, और जल्दी से टुकड़ा करने की क्रिया के वांछित विमान प्राप्त करने के लिए उचित विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं।
    10. बाण के नाभिक accumbens (एनएसी) युक्त स्लाइस प्राप्त करने के लिए, एक एकल बढ़त धार में कटौती और अगर वे अब भी मौजूद हैं, घ्राण ट्यूबरकल और सेरिबैलम दूर करने के लिए इस्तेमाल करते हैं। फिर, 2 की एक बाण कट प्रदर्शन - दाएँ गोलार्द्ध सपाट सतह कि नमूना प्लेट रखने पर चिपके हो जाएगा प्राप्त करने के लिए के पार्श्व सीमा से 3 मिमी (कदम 2.8.11 देखें)।
      नोट: केवल 2 काटना - गोलार्द्ध के पार्श्व सीमा से 3 मिमी दोनों गोलार्द्धों से एनएसी युक्त स्लाइस के संग्रह के लिए अनुमति देगा। उचित विच्छेदन निर्भर करेगामस्तिष्क क्षेत्र है कि जांच की है पर। इधर, विच्छेदन किया जाता है, ताकि एनएसी न्यूरॉन्स बाण मस्तिष्क स्लाइस में दर्ज किया जा सकता है।
    11. तेजी से गोंद थाली पर मस्तिष्क के फ्लैट में कटौती की सतह टुकड़ा करने की क्रिया के वांछित विमान के अनुसार (नमूना पकड़े प्लेट के लिए आवेदन किया cyanoacrylate गोंद का उपयोग)। प्राप्त करने के लिए बाण मस्तिष्क स्लाइस कदम 2.8.10 देखें।
    12. तुरंत जगह और नमूना टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में थाली पकड़े सुरक्षित इसलिए मस्तिष्क (, सुरक्षा के लिए ब्लेड धारक केवल जब नमूना प्लेट सुरक्षित है स्थापित) rostro-दुमदारी कटा हुआ है।
    13. उचित टुकड़ा करने की क्रिया मानकों (: - 4, कंपन 9-10, और टुकड़ा मोटाई 250 माइक्रोन गति 3 vibratome सामग्री में उल्लेख के लिए प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया पैरामीटर) के साथ vibratome सेट करें।
    14. टुकड़ा करने की क्रिया पर, (आरटी पर) वसूली चैम्बर के लिए मस्तिष्क के स्लाइस के हस्तांतरण के लिए एक प्लास्टिक की छंटनी हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें (2.3 कदम देखें)। वसूली समय न्यूरोनल प्रकार है कि अध्ययन के तहत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं(आमतौर पर 30 - 90 मिनट)।

3. रिकॉर्डिंग Micropipettes और रिग तैयारी

  1. वांछित micropipette गुण प्राप्त करने के लिए खींचने उपयोगकर्ता मैनुअल की विशेष दिशा निर्देश का संदर्भ लें।
    नोट: MSNs के लिए, हम 3.2-4.0 MΩ की एक पिपेट प्रतिरोध रेंज का उपयोग करें।
  2. ACSF आक्सीजन और 2 मिलीग्राम / मिनट के लिए प्रवाह को समायोजित। वैक्यूम ACSF एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप या वैक्यूम लाइनों की सुविधा में स्थापित इस्तेमाल करते हैं।
  3. छिड़काव हीटर नियंत्रक को चालू करें और क्रम में वांछित तापमान प्राप्त करने के लिए तापमान सेटिंग्स समायोजित (जैसे, 31.8 - 32.2 के डिग्री सेल्सियस)।
    नोट: तापमान स्थिरता दोनों एक निरंतर ACSF स्तर और चैम्बर में निरंतर प्रवाह वेग होने पर निर्भर करता है। न्यूरॉन्स के कई biophysical गुणों के बाद से (जैसे, इनपुट प्रतिरोध, आर मैं भी झिल्ली प्रतिरोध, आर एम) कहा जाता है तापमान के प्रति संवेदनशील हैं, एक स्थिर तापमान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. compu चालू करेंआतंकवाद नियंत्रित एम्पलीफायर, कैमरा, micromanipulator, और माइक्रोस्कोप पृष्ठभूमि प्रकाश। अगर एक प्रयोग है कि ऊतक की बिजली की उत्तेजना की आवश्यकता प्रदर्शन, उत्तेजना नियंत्रक और अलगाव इकाई पर बारी।
    नोट: दूसरे से कुछ एम्पलीफायरों उपयोग करने से पहले एक "गर्म-अप" की सिफारिश बनाती है, तो यह सटीक संचालन प्रक्रिया के लिए मैनुअल से परामर्श करने की सिफारिश की है।
  5. कैमरे पर कब्जा, संकेत अधिग्रहण और एम्पलीफायर सॉफ्टवेयर शुरू करो।
  6. स्लाइस प्लेसमेंट और दृश्य:
    1. एक प्लास्टिक की छंटनी की नोक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, धीरे वसूली कक्ष से एक मस्तिष्क टुकड़ा में आकर्षित।
    2. रिकॉर्डिंग कक्ष में हस्तांतरण पिपेट प्लेस और धीरे coverslip कक्ष के नीचे की परत पर पिपेट से बाहर टुकड़ा निचोड़।
      नोट: जब तक कोई अतिप्रवाह हो रहा है, यह स्नान में spilling वसूली कक्ष से कुछ ACSF राशि के लिए हानिकारक है।
    3. टुकड़ा एस की स्थिति को बदलने के लिए संदंश का प्रयोग करेंओ वांछित क्षेत्र रिकार्डिंग कक्ष के केंद्र में वास्तव में रखा जाएगा। माइक्रोस्कोप कम बिजली (4X) उद्देश्य लेंस और स्थिति में सहायता के लिए आईपीस का प्रयोग करें।
    4. बाद इच्छित स्थान हासिल किया गया है, चैम्बर में एक टुकड़ा पकड़ से नीचे (यह भी एक "वीणा" के रूप में जाना जाता है) के साथ मस्तिष्क टुकड़ा स्थिति सुरक्षित।
    5. उच्च शक्ति (40X) उद्देश्य लेंस के लिए स्विच और यह धीरे कम जब तक संपर्क कक्ष में ACSF के साथ बनाई है।
    6. ध्यान में ऊतक लाने के लिए ठीक समायोजन पहिया का उपयोग करें। ACSF के साथ संपर्क में, जरूरत से ज्यादा उद्देश्य लेंस को कम टुकड़ा कुचलने या भी कवर पर्ची कक्ष के नीचे है, जो ACSF कंडेनसर पर गिर करने के लिए पैदा कर सकता है अस्तर तोड़ सकते हैं के रूप में माइक्रोस्कोप पर मोटे समायोजन पहिया का उपयोग नहीं करते हैं और यह नुकसान।
    7. ध्यान देने के ऊतक के स्तर पर है, जब आकार के लिए लक्षित क्षेत्र में कोशिकाओं का पालन। मृत कोशिकाओं को आसानी से अपने बढ़कर प्लाज्मा झिल्ली और नाभिक (द्वारा पहचाने जाने योग्य हैं <strong> चित्रा 1E)। स्वस्थ कोशिकाओं गोल, अंडाकार, या अंडाकार समरूप संरचनाओं (चित्रा 1E) के रूप में प्रकट करना चाहिए।
    8. लक्ष्य सेल के लिए देखो। आदेश में मदद करने के लिए रिकॉर्डिंग micropipette मार्गदर्शन में कंप्यूटर स्क्रीन पर यह निशान। ऐसे QCapture के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं, तो बाईं माउस क्लिक धारण करके लक्ष्य सेल के चारों ओर एक वर्ग आकर्षित।
    9. उद्देश्य लेंस उठाएँ तो वहाँ शंकु उद्देश्य लेंस ACSF साथ संपर्क में रहने के लिए जगह और रिकॉर्डिंग micropipette को स्थानांतरित करने का गठन करके में पर्याप्त स्थान नहीं होगा।
  7. Micropipette प्लेसमेंट और पोजिशनिंग
    1. 1 मिलीलीटर सिरिंज, एक nonmetallic microsyringe सुई, और एक समर्पित फिल्टर का उपयोग करना, योजना बनाई प्रयोग (+ K आधारित या सीएस + आधारित आंतरिक समाधान के अनुसार पहले से तैयार आंतरिक समाधान के साथ एक micropipette भरने के लिए, चरण देखें 1.1।, 1.2 , और रचना के लिए सामग्री)। इसलिए आंतरिक पर्याप्त समाधान का उपयोग करेंसमाधान micropipette धारक के भीतर क्लोराइड लेपित चांदी के तार इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में आता है।
      नोट: चांदी के तार इलेक्ट्रोड घरेलू ब्लीच में यह भिगोने से क्लोरीनयुक्त जा सकता है। Nucleoside triphosphates (एटीपी और जीटीपी) का उपयोग करने से पहले आंतरिक समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है। बर्फ पर समाधान एटीपी / जीटीपी गिरावट को रोकने के लिए युक्त सिरिंज रखें।
    2. यकीन के रूप में वे बाहर आ सकते हैं, जबकि micropipette ऊतकों में है और टुकड़ा अस्पष्ट micropipette में कोई हवाई बुलबुले हैं सुनिश्चित करें।
    3. इलेक्ट्रोड धारक में micropipette रखें ताकि समाधान चांदी क्लोराइड लेपित तार इलेक्ट्रोड के साथ संपर्क में आता है।
    4. पिपेट टोपी कसो तो यह है कि कोन वॉशर micropipette के चारों ओर एक मुहर बनेगी।
    5. ACSF में micropipette डुबो पिपेट में प्रवेश करने से मलबे को रोकने के लिए पहले सकारात्मक दबाव लागू करें।
    6. बंद की स्थिति में headstage (चैम्बर सामना करना पड़ रहा है), और micromanipulator का उपयोग, जी रखेंयह नीचे uide चैम्बर की ओर तो यह डूबे उद्देश्य के केंद्र के तहत मोटे तौर पर है।
    7. (उच्च गति के लिए मध्यम पर सेट) micromanipulator के साथ micropipette चलती, micropipette लगाने और XY अक्ष पर सेल के स्थान की ओर मार्गदर्शन करने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन का उपयोग करें।
    8. एक वोल्टेज कदम को लागू करने से उपाय micropipette प्रतिरोध (जैसे, 4 एम वी 100 मिसे के लिए) है, जो इस तरह के 'स्नान' मोड के रूप में विशेष सॉफ्टवेयर के माध्यम से स्वयं या स्वतः पूरा किया जा सकता है, तो Clampex सॉफ्टवेयर में "झिल्ली टेस्ट" का उपयोग (यह भी चरण 4 देखें) । आदेश में यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले या किसी अन्य विदेशी वस्तुओं micropipette को ब्लॉक करने के लिए, हवा से भरा सिरिंज (जैसे, 30 सीसी सिरिंज) पॉलीथीन ट्यूबिंग के साथ micropipette धारक से जुड़ा का उपयोग कर सकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
    9. micropipette साफ़ करने के बाद, एक वोल्टेज शून्य करने के लिए पिपेट वर्तमान को कम करने के लिए ऑफसेट, जो स्वयं या इस तरह के रूप & # विशेष सॉफ्टवेयर के माध्यम से पूरा किया जा सकता है प्रदर्शन39; पिपेट कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर कमांडर पर ऑफसेट '।
      नोट: इस समारोह में स्नान और micropipette समाधान (यानी, तरल जंक्शन क्षमता 20) के बीच एकाग्रता मतभेद की वजह से किसी भी वोल्टेज के लिए क्षतिपूर्ति करेगा।

4. झिल्ली टेस्ट

नोट: यह कदम एम्पलीफायर सामग्री में उल्लेख करने के लिए लागू होता है।

  1. एक कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर कमांडर का उपयोग करते समय हमेशा झिल्ली परीक्षण करने के लिए वोल्टेज दबाना मोड पर सेट।
    नोट: जब मुहर का गठन किया है जब झिल्ली परीक्षण "स्नान" मोड में सेट किया गया है, झिल्ली परीक्षण micropipette प्रतिरोध और सील प्रतिरोध की माप की अनुमति देता है।
  2. एक बार झिल्ली उठी है (कदम 5.8 देखें), झिल्ली परीक्षण करने के लिए "सेल" मोड इतना है कि श्रृंखला प्रतिरोध (आर एस) (भी बुलाया उपयोग प्रतिरोध, आर ए), आर मैं और झिल्ली समाई (सी पी) कर सकते हैं स्विचप्राप्त हो।

5. अंतिम दृष्टिकोण, सील गठन, और पूरे सेल विन्यास प्राप्त

  1. ठीक ध्यान पहिया का उपयोग करना, नीचे ध्यान केंद्रित करते हुए धीरे-धीरे micropipette को कम करने शुरू करते हैं। हमेशा पहले नीचे ध्यान केंद्रित करने और उसके बाद ध्यान के विमान को नीचे micropipette कम है। इससे यह सुनिश्चित होगा कि micropipette टिप अचानक टुकड़ा में प्रवेश नहीं करेगा।
  2. micropipette टुकड़ा की सतह के साथ संपर्क में आता है, मध्यम कम मोड के लिए micromanipulator की गति को धीमा।
  3. धीरे हवा से भरे पिपेट धारक से जुड़ा दृष्टिकोण पथ से किसी भी मलबे को साफ करने के लिए सिरिंज के साथ प्रकाश सकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
  4. सेल दृष्टिकोण या तो XYZ नियंत्रण knobs के साथ बारी से, या तिरछे आ रहा (micromanipulator मॉडल यह अनुमति देता है), जहां दोनों को xz कुल्हाड़ियों जेड अक्ष घुंडी के रोटेशन के साथ बदल रहे हैं। बाद विधि ऊतक के ऊर्ध्वाधर संपीड़न पाएगा।
    नोट: यहाँ, लक्ष्य हैटुकड़ा करने के लिए कम से कम क्षति पहुंचाई द्वारा सेल दृष्टिकोण करने के लिए। जब micropipette सेल एक डिंपल प्रतीत होता है (चित्रा 2) (सेल micropipette की नोक के माध्यम से लागू सकारात्मक दबाव की वजह से सतह का एक दौर discoloring) के काफी करीब है।
  5. डिंपल प्रकट होता है (चित्रा 2-1), ट्यूब है कि आदेश में मुहर (चित्रा 2-2) बनाने के लिए पिपेट धारक सक्शन ट्यूब से जुड़ा हुआ है के माध्यम से एक कमजोर और संक्षिप्त सक्शन लागू होते हैं। झिल्ली परीक्षण की निगरानी रखें।
    नोट: एक आंशिक मुहर का गठन किया जाता है तो (<1 GΩ), (कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर कमांडर पर) संभावित पकड़े घटाने मुहर गठन की सुविधा और ( "gigaohm मुहर" या "gigaseal" gigaohms प्रतिरोध तक पहुँच सकते हैं द्वारा नकारात्मक धाराओं इंजेक्शन लगाने के> 1 - 5 GΩ)। सील की उच्च प्रतिरोध (> 1 GΩ) दोनों दर्ज संकेत करने के लिए सीमा शोर प्रदूषण और के यांत्रिक स्थिरता के लिए योगदान देगापैच।
  6. एक gigaseal गठन किया गया है, वहीं सेल की होल्डिंग क्षमता लाने के क्रम में एक बार झिल्ली उठी है अचानक परिवर्तन को रोकने के लिए संभावित (वी बाकी) आराम कर शारीरिक करने के लिए संभव के रूप में बंद कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर कमांडर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, आम तौर पर MSNs वोल्टेज clamped -70 या -80 एम वी (: -70 -90 एम वी वी शारीरिक बाकी) पर हैं।
  7. बाद gigaseal गठन किया है, स्वयं या स्वतः तेज और धीमी समाई के लिए क्षतिपूर्ति। जैसे 'सी.पी. फास्ट' के लिए Multiclamp कमांडर, प्रेस 'ऑटो' और 'धीरे वाणिज्यिक पत्र "के रूप में एक कंप्यूटर नियंत्रित एम्पलीफायर कमांडर का उपयोग करते हैं।
  8. सील स्थिर और 1 GΩ (या कम से कम 10 इंजेक्शन लगाने - वांछित झिल्ली क्षमता पर सेल धारण करने के लिए 20 देहात) से ऊपर बनी हुई है, उसी ट्यूब के माध्यम से एक संक्षिप्त और मजबूत चूषण 5.5 में के रूप में प्लाज्मा झिल्ली टूटना करने के लिए चित्रा 2 लागू ( -3)।
    नोट: यह कई परीक्षणों ले सकता है। एक अच्छा झिल्ली टूटना w हासिल की हैमुर्गी सक्शन दृढ़ता से बस इतना है कि उठी झिल्ली झिल्ली आदेश या सेल के एक बड़े हिस्से में आकर्षित नहीं करने के लिए micropipette (जो रिकॉर्डिंग के दौरान आर एस में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं), लेकिन कमजोर पर्याप्त रोकना नहीं है किया जाता है।
  9. एक सफल पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने के बाद, नियमित रूप से महत्वपूर्ण बहाव के लिए micropipette स्थान का आकलन करने के लिए और सही रूप में यह पैच का नुकसान हो सकता है की निगरानी। बहाव आयाम कई कारकों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, जैसे, रिग स्थापना की गुणवत्ता और headstage पर खींच बलों। आदर्श रूप में, बहाव लगभग न के बराबर होना चाहिए।
  10. झिल्ली की परीक्षा में "सेल" मोड में जाने से, इस तरह के आर मैं, आर एस और सी पी के रूप में सेल के विभिन्न मापदंडों को देखने। रिकॉर्डिंग के दौरान इन मापदंडों की निगरानी।
    नोट: इन सभी मापदंडों मदद कर सकते हैं कोशिकाओं और सेल प्रकार की प्रारंभिक स्वास्थ्य की स्थिति का आकलन ( "झिल्ली परीक्षण" अनुभाग, चरण 4 देखें)।
  11. एक बार वेंकदम ऊपर ई पूरा कर रहे हैं, वोल्टेज दबाना मोड में रहने धाराओं (जैसे, EPSCs, IPSCs) को मापने के लिए, या वर्तमान दबाना मोड में स्विच करने के लिए अगर नियोजन झिल्ली वोल्टेज (जैसे, कार्रवाई संभावित फायरिंग) में परिवर्तन को मापने के लिए। बाद के लिए, या तो सकारात्मक या नकारात्मक वर्तमान वांछित झिल्ली वोल्टेज पर सेल धारण करने के लिए इंजेक्षन (इस कदम प्रदर्शन करने के लिए, गाइड एम्पलीफायर को देखें)।

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Representative Results

तापमान, एक कारक है कि आसानी से प्रयोगकर्ता द्वारा नियंत्रित किया जाता है, आयन चैनलों और रिसेप्टर्स की biophysical गुणों को प्रभावित करती है, और इस तरह बाद synaptic धाराओं (पीएससी) (EPSC और IPSCs) और spikes बटोर न्यूरॉन्स की क्षमता की तरंग। चित्रा 3 और चित्रा 4 neuronal फायरिंग पर तापमान के प्रभाव और पैदा EPSCs (eEPSCs) क्रमश की ढलान दिखा। फायरिंग पैटर्न (चित्रा 3) (यानी, 1 सेंट कील को विलंबता, संख्या, आवृत्ति, और संभावित कार्रवाई तरंग कील) एक समय पर और समन्वित उद्घाटन और विशिष्ट वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल के समापन के आकार का है (ना +, सीए 2 +, और कश्मीर +), एक प्रक्रिया तापमान के प्रति संवेदनशील। चित्रा 3 से पता चलता है कि कैसे मतलब कील नंबर तापमान के साथ बढ़ जाती है। ध्यान दें कि हालांकि कील freque यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों (MSNs रिकॉर्डिंग) मेंncy subphysiological तापमान (28 डिग्री सेल्सियस) पर बदला जा प्रतीत नहीं होता है, यह काफी जब तापमान physiologically प्रासंगिक स्तर (32 डिग्री सेल्सियस) तक पहुँच जाता है बढ़ जाती है। चित्रा -4 ए का एक उदाहरण दिखाता है कि कैसे eEPSCs की ढलान, एक पैरामीटर है कि आमतौर पर करने के लिए इस्तेमाल अन्तर्ग्रथनी शक्ति का आकलन, तापमान के साथ बढ़ जाती है।

आर एस कुछ हद तक एक कुशल झिल्ली खोलने के माध्यम से प्रयोगकर्ता, यानी, द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है जब पूरे सेल विन्यास को सील राज्य से संक्रमण, आर आमतौर पर धीरे-धीरे रिकॉर्डिंग के दौरान बढ़ जाती है। यह विभिन्न बेकाबू घटनाओं, जैसे, झिल्ली फिर से बंद करने या मलबे रिकॉर्डिंग के दौरान विंदुक टिप clogging का नतीजा हो सकता है। झिल्ली एक मामूली सक्शन को लागू करने से है, हालांकि यह पैच समझौता हो सकता है फिर से खोलने के लिए कोई प्रयास, कभी कभी मदद कर सकते हैं बनाए रखने के लिए एक स्थिर आर एस। सभी मामलों में, क्योंकि आर एस परिवर्तन अल कर सकते हैंअध्ययन के तहत बिजली के संकेत की तरंग आतंकवाद, इसे ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए, और विशेष रूप से जब पीएससी (वोल्टेज दबाना मोड) दर्ज की गई। चित्रा 4 से पता चलता है कि जब आर एस बढ़ जाती है (चित्रा 4 बी), ग्लूटामेट रिसेप्टर की मध्यस्थता धाराओं के आयाम (eEPSCs ) कम हो जाती है (चित्रा 4C, डी)। आमतौर पर, प्रयोगकर्ताओं डेटा त्यागने जब ​​आर एस में परिवर्तन 15% (जैसे, इस प्रयोगशाला) से अधिक है, लेकिन कुछ प्रयोगशालाओं में एक 20% परिवर्तन से ऐसा करते हैं। इस कसौटी लेख के विधि अनुभाग में संकेत किया जाना चाहिए।

एक परिभाषित न्यूरॉन के लिए, आर मैं तापमान, सेल स्वास्थ्य, और पैच की गुणवत्ता सहित कई कारकों से प्रभावित हो सकते हैं। विशेष रूप से, जब आर मैं कम हो जाती है, पीएससी आयाम या न्यूरॉन्स की क्षमता spikes उत्पन्न करने के लिए भी कम हो जाती है। उदाहरण के लिए, चित्रा 4E पता चलता है कि जब आर मैं काफी भिन्न नहीं है, धspikes के ई संख्या अपेक्षाकृत स्थिर (न्यूरॉन 1) रहते हैं; और जब आर मैं बढ़ जाती है, spikes बढ़ जाती है की संख्या के रूप में अच्छी तरह से (न्यूरॉन 2)। इसलिए और आर एस के लिए इसी प्रकार, आर मैं ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए के रूप में 10% परिवर्तन पूर्वाग्रह डेटा के लिए पर्याप्त हैं।

जैसा कि ऊपर वर्णित है, यह रिकॉर्डिंग के दौरान नियंत्रण या तापमान, आर एस पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और आर मैं। उदाहरण के लिए, परिवर्तन की वजह से इन कारकों में से प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव संकेत है कि अध्ययन (पीएससी या गोलीबारी) के तहत में परिवर्तन हो सकता है (या नियंत्रण की कमी) के बजाय, जैसे, पूर्व बनाम के बाद प्रभाव मनाया दवा स्नान आवेदन।

आकृति 1
चित्रा 1. कस्टम-वसूली कक्ष (ई) और 400X पर एक मस्तिष्क टुकड़ा की एक तस्वीर स्वस्थ और मृत न्यूरॉन्स (ई) दिखा रहा है। एडी)एक कस्टम वसूली चैम्बर बनाने के लिए प्रक्रिया 2.1 चरण में वर्णित है। ई) 400X स्वस्थ (लाल तीर के उदाहरण दिखा पर एक मस्तिष्क टुकड़ा में एनएसी औसत दर्जे का खोल MSNs) बनाम मृत न्यूरॉन्स (नीले तीर) का चित्र। नोट हालांकि कुछ कोशिकाओं को स्वस्थ रूप में संकेत कर रहे हैं, उनके गोलाकार पहलू संकेत मिलता है कि वे के रूप में स्वस्थ वांछित (तारों के साथ लाल तीर) के रूप में नहीं हो सकता है। अंतिम स्वास्थ्य की स्थिति वी बाकी और अनुसंधान के आधार पर मूल्यांकन किया है मैं पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने के बाद। कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. आरेख बेसिक प्रक्रियात्मक चरणों चित्रण एक gigaseal प्राप्त करें और पूरे सेल विन्यास की स्थापना। जब micropipette काफी करीब वें हैई सेल, प्लाज्मा झिल्ली (चरण 1, दृष्टिकोण) में डिंपल बनाने के लिए micropipette और प्लाज्मा झिल्ली के बीच एक तंग संपर्क बनाने के लिए एक संक्षिप्त और कोमल चूषण लागू होते हैं। अगर ठीक से प्रदर्शन किया, संपर्क को मजबूत करेगा और प्रतिरोध को बढ़ाने और 1 GΩ (gigaseal) या अधिक (चरण 2, सील गठन) तक पहुंच जाएगा। एक बार मुहर स्थिर और 1 GΩ से ऊपर है, प्लाज्मा झिल्ली (3 कदम, पूरे सेल विन्यास) टूटना करने के लिए एक संक्षिप्त और मजबूत चूषण लागू होते हैं। पूरे सेल विन्यास हासिल कोशिका द्रव्य और micropipette आंतरिक बीच निरंतरता की अनुमति देगा। जानकारी के लिए, प्रोटोकॉल कदम 5.1-5.8 देखते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. neuronal फायरिंग (आंतरिक excitability) वर्तमान-क्लैम में मूल्यांकन किया है पी मोड। इधर, वर्तमान कदम के एक पूर्व निर्धारित और वृद्धिशील श्रृंखला आदेश झिल्ली वोल्टेज में परिवर्तन प्रकाश में लाना करने के लिए दिया जाता है, और इस तरह कार्रवाई की क्षमता को ट्रिगर। ए) मतलब कील नंबर एनएसी से 280 फिलीस्तीनी अथॉरिटी में तापमान। बी) नमूना निशान के साथ बढ़ जाती है तीन अलग-अलग तापमान जमाव पर औसत दर्जे का खोल MSNs (; 28 डिग्री सेल्सियस, एन = 5; 24 डिग्री सेल्सियस, एन = 9 और 32 डिग्री सेल्सियस, एन = 6)। रिकॉर्डिंग कक्ष में तापमान सीधे कील आवृत्ति को प्रभावित करता है। हालाँकि, ध्यान दें कि हालांकि कील आवृत्ति subphysiological तापमान पर बदला जा प्रतीत नहीं होता है, यह काफी बढ़ जाती है जब तापमान 32 डिग्री सेल्सियस, एक physiologically प्रासंगिक तापमान तक पहुँचता है। न्यूरॉन्स -80 एम वी पर आयोजित की जाती हैं। दो-तरफा एनोवा: बातचीत, पी <0.0001; तापमान प्रभाव, पी = 0.0041; पोस्ट अस्थायी परीक्षण: 24 डिग्री सेल्सियस और 28 डिग्री सेल्सियस दोनों, 32 डिग्री सेल्सियस से काफी अलग हैं ** पी <0.01। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। अंशांकन: 200 मिसे, 50 एम वी।jove.com/files/ftp_upload/54024/54024fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक भी एनएसी खोल एमएसएन से eEPSC आयाम के बिजली के संकेत अध्ययन के तहत। ए) उदाहरण के तरंग पर तापमान, आर एस, और मैं आर का प्रभाव। 24 से 28 डिग्री सेल्सियस और 32 डिग्री सेल्सियस के तापमान में वृद्धि eEPSCs की ढलान बढ़ जाती है। ध्यान दें कि eEPSCs ढलान में तापमान प्रेरित परिवर्तन तेजी से होते हैं। इधर, eEPSCs ढलान वोल्टेज दबाना मोड में मूल्यांकन किया है। कैलिब्रेशन: 5 मिसे, 100 पीए बी) एक एकल एनएसी खोल एमएसएन से eEPSCs ढलान का उदाहरण है।। आर एस बढ़ जाती है (बी), eEPSCs की ढलान कम हो जाती है जब आर के एक समारोह के रूप eEPSC ढलान की (सी)। डी) सहसंबंध विश्लेषणएस। पियर्सन के आर = -0.५,७१७, पी <0.0001। न्यूरॉन्स वोल्टेज clamped -80 एम वी। ई में) न्यूरॉन spikes उत्पन्न करने की क्षमता पर आर मैं का असर दिखा दो न्यूरॉन्स से निशान के उदाहरण हैं। न्यूरॉन्स वर्तमान clamped, और -80 एम वी पर आयोजित कर रहे हैं। कैलिब्रेशन:। 200 मिसे, 50 एम वी यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स पर पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों प्रदर्शन के लिए बुनियादी प्रक्रिया का वर्णन है। हालांकि, जटिलता, क्षमता और इस तकनीक की संवेदनशीलता को पूरी तरह से इस आलेख में वर्णित नहीं किया जा सकता। यहाँ, हम सबसे बुनियादी कदम चित्रित करना और महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि सफल और कठोर पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए रेखांकित करने की कोशिश की है। आगे सैद्धांतिक सीखने के लिए, कई किताबें और लेख मस्तिष्क स्लाइस 3,21-24 में और तरीकों कि आदेश सेल व्यवहार्यता को बढ़ाने के लिए 25-27 इस्तेमाल समाधान परिष्कृत कर सकते हैं पर दोनों पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग पर प्रकाशित किया गया है। आदेश में नियमित तौर पर उचित रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए, गहन अभ्यास के माध्यम से तकनीकी कौशल में सुधार के लिए आवश्यक है। बहरहाल, कदम के उचित आवेदन में उल्लेख किया है, के साथ कोशिकाओं समझौता किया जा सकता घंटे पोस्टमार्टम, synaptic कार्यों और आंतरिक excitabi में परिवर्तन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध करानेlity।

सामान्य तौर पर, ध्यान, दोनों ACSF और आंतरिक micropipette समाधान, मस्तिष्क विच्छेदन से हर कदम तैयारी टुकड़ा करने की क्रिया, सफल पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने, और कठोर और निष्पक्ष डेटा प्राप्त करने के महत्व के अलावा गहन अभ्यास की आवश्यकता है। जाहिर है, यह स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। संक्षेप में, मस्तिष्क (आदर्श <45 सेकंड), एक कम तापमान के रखरखाव के तेजी से विच्छेदन (0 - 2 डिग्री सेल्सियस) टुकड़ा करने की क्रिया है, जबकि, और उचित समाधान टुकड़ा करने की क्रिया सभी सेल स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह टुकड़ा करने की क्रिया समाधान प्रयोगशालाओं और सेल प्रकार और / या मस्तिष्क क्षेत्र है कि जांच की जाएगी के अनुसार के बीच भिन्न हो सकती है कि उल्लेख करने के लिए उल्लेखनीय है। जब एनएसी या पृष्ठीय स्ट्रिएटम टुकड़ा करने की क्रिया, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों टुकड़ा करने की क्रिया के समाधान के लिए kynurenic एसिड का उपयोग इस तरह के सुक्रोज आधारित समाधान 34, उच्च के रूप में 2 मिलीग्राम + excitotoxic प्रक्रियाओं 28-33, हालांकि, अन्य तरीकों में भी इस्तेमाल किया जा सकता है, कम से कम करने के लिए 2 समाधान 35, आदि। ये केवल कुछ उदाहरण हैं और (जैसे उम्र के कारण) excitotoxic प्रक्रियाओं के लिए दिमाग या मस्तिष्क क्षेत्र की संवेदनशीलता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। समाधान और सेल व्यवहार्यता पर अधिक जानकारी के लिए, कृपया 25-27 देखते हैं। अंत में, anions, फैटायनों, और अन्य दवाओं की एकाग्रता (जैसे, एस्कॉर्बेट, ग्लूटामेट रिसेप्टर विरोधी) है कि टुकड़ा करने की क्रिया समाधान रचना चुना गया है ताकि यह मस्तिष्कमेरु द्रव mimics और संभव excitotoxic प्रक्रियाओं है कि टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान होने के रूप में ज्यादा कम करता है। इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक समाधान है कि नियमित तौर पर जब एनएसी या मस्तिष्क स्लाइस में पृष्ठीय स्ट्रिएटम में MSNs से रिकॉर्डिंग 'लेखक पिछले अध्ययनों 28-31 में इस्तेमाल किया गया वर्णन करता है। इसके अलावा, दोनों ACSF और आंतरिक micropipette समाधान के लिए परासारिता का उचित समायोजन सफल मुहर गठन और पूरे सेल conf के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण हैंiguration। इंट्रा-पिपेट समाधान के लिए बाह्य समाधान से एक एकाग्रता ढाल बनाने के लिए, ACSF परासारिता आंतरिक micropipette समाधान के लिए अधिक से अधिक होना चाहिए। आदर्श रूप में, अंतर 10 से 30 mOsm को लेकर कर सकते हैं।

एक सफल पूरे सेल विन्यास हासिल कुशल रिकॉर्डिंग के संचालन के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। सबसे पहले, पिपेट समाई एक बार पिपेट स्नान में रखा गया है समायोजित किया जा सकता है। हालांकि स्वत: सेटिंग्स आमतौर पर ठीक से सेट कर रहे हैं, यह सावधानी के साथ सेल समाई के तेज और धीमी गति समायोजन का उपयोग करने के लिए के रूप में इन सेल नुकसान पहुंचा सकता है जब उचित प्रदर्शन उचित नहीं है। दूसरा, संक्षिप्त झिल्ली सक्शन टूटना करने के लिए झिल्ली झिल्ली का एक महत्वपूर्ण खोलने के लिए ले जाएगा, और इस तरह intracellular और इंट्रा-micropipette परिवेश के बीच एक अच्छा संचार की अनुमति आवश्यक है। इससे यह सुनिश्चित होगा कि आर एस रिकॉर्डिंग के दौरान अपेक्षाकृत स्थिर रहेगा। सीएस आधारित micropipette समाधान का उपयोग करते हैं,झिल्ली विश्राम क्षमता तुरंत पूरे सेल विन्यास की स्थापना पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए (कदम 5.8 देखें)। दरअसल, सेल के अंदर सीएस + के प्रसार झिल्ली विश्राम क्षमता की हानि का कारण बनता है। उचित विश्राम क्षमता का निर्धारण करने के लिए, तरल जंक्शन क्षमता 20 मूल्यांकन किया जाना चाहिए। हालांकि, प्रयोगकर्ता विश्राम क्षमता है कि (5.8 कदम के बाद) झिल्ली तोड़ने के बाद मनाया जाता है रिपोर्ट और तरल जंक्शन क्षमता के लिए समायोजित करने के लिए नहीं चुन सकते हैं। सभी मामलों में, यह लेख के विधि अनुभाग में उल्लेख किया जाना चाहिए। पूरे सेल विन्यास की स्थापना पर, सी पी भी प्राप्त किया जा सकता है और सेल स्वास्थ्य और / या सेल प्रकार का आकलन करने के लिए एक अप्रत्यक्ष पैरामीटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तीसरा, जब रिकॉर्डिंग शुरू किया, अन्य मानकों कड़ाई से निगरानी की जानी चाहिए। महत्वपूर्ण कारक है कि जब neuronal excitability आकलन नियंत्रित किया जाना चाहिए तापमान, आर एस, और अनुसंधान मैं कर रहे हैं।

जैसाऊपर उल्लेख किया, आर मैं और सी पी सेल स्वास्थ्य और / या सेल प्रकार का संकेत हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली, एक इन्सुलेटर के रूप में अभिनय, प्रभारी, जो एक साथ झिल्ली समाई का गठन (intracellular और बाह्य समाधान के विभिन्न रचना से उत्पन्न) अलग करती है। समाई बड़ा झिल्ली सतह (न्यूरोनल विशेष), अधिक है। यह तो आश्चर्य की बात नहीं है कि विशिष्ट neuronal प्रकार प्रदर्शनी सी पी और आर रहा है कि एक ही सीमा के भीतर कर रहे हैं (गणितीय सी पी से संबंधित)। आर एस सीधे विंदुक टिप के आकार से संबंधित है, और इसलिए आमतौर पर गुणवत्ता या झिल्ली खोलने के आकार का सूचक है। संक्षेप में, पूरे सेल विन्यास की स्थापना करने पर, कोशिका द्रव्य micropipette में समाधान के साथ विद्युत सतत और बाहरी मध्यम से पूरी तरह से अलग हो जाता है। आर एस (या आर ए) कुरेन के लिए प्रतिरोध से निकलती हैटी कोशिका द्रव्य को पिपेट से प्रवाह करने के लिए। कुछ रिकॉर्डिंग की स्थिति (जैसे, वर्तमान दबाना मोड या वोल्टेज gated आयन धाराओं के वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग) के लिए, आर एस ठीक से मुआवजा दिया जाना चाहिए (रेफरी को देखें। 3,21-24 या उचित आर एस मुआवजे के लिए एम्पलीफायर गाइड) ।

चित्रा 4 में वर्णित है, आर एस विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह नाटकीय रूप से बिजली के संकेत तरंग, जैसे, EPSC आयाम को प्रभावित कर सकते हैं। बहरहाल, आर एस ध्यान से किसी भी मनाया प्रभाव से बंद लाइन व्याख्याओं के लिए निगरानी की जानी चाहिए। मामले में झिल्ली ठीक से उठी नहीं किया गया है, micropipette टिप clogging या झिल्ली की फिर से बंद हो सकता है, जो मामले में आर एस बढ़ जाती है और पूर्वाग्रह अध्ययन के तहत बिजली के संकेत की तरंग (चित्रा 4 बी-डी)। सारांश में, कई समस्याओं का सामना करना पड़ा जबकि रिकॉर्डिंग की जा सकती है, और उन लोगों को आम तौर पर तीन श्रेणियों के अंतर्गत आते हैं: i) ऊतक से संबंधित, जैसे, गरीब विच्छेदन, ACSF परासारिता, और हाइपोक्सिया की अव्यवस्था के कारण सेल मृत्यु दर में वृद्धि हुई; ii) उपकरण से संबंधित है, जैसे, शोर और ग्राउंडिंग समस्याओं, तापमान नियंत्रण, टुकड़ा और micropipette स्थिति, आदि। और iii) डेटा की व्याख्या, जैसे, मनाया परिवर्तन अवांछित प्रयोगात्मक प्रयोगात्मक का परिणाम विद्युत तरंग-फेरबदल मापदंडों में परिवर्तन (r मैं, आर एस, तापमान, चित्रा 3 और 4 देखें) को बजाय डेटा biasing कलाकृतियों का नतीजा हो सकता है जोड़ - तोड़।

हालांकि मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग अनुभव पर निर्भर प्लास्टिसिटी का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, इस दृष्टिकोण डेटा की व्याख्या की सीमा। विशेष रूप से, पूरे सेल रिकॉर्डिंग तकनीक के तीन महत्वपूर्ण सीमाएं हैं कि: (i) विशिष्ट प्रोटीन (जैसे, आयन चैनल) प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है समारोह और अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन; (Ii) इस वजहतकनीक पूरे झिल्ली के माध्यम से वर्तमान प्रवाह (या बड़ा हिस्सा) का आकलन है, यह आयनिक धाराओं या परिवर्तन है कि मनाया जाता है की सटीक उप सेलुलर स्थानीयकरण प्रदान नहीं करता है; और (iii) पूरे सेल विन्यास के invasiveness आवश्यक intracellular आणविक मशीनरी का विघटन करने के लिए सेल सामग्री का डायलिसिस की ओर जाता है, और इस तरह कुछ घटना को विकसित करने या व्यक्त करने के लिए। एक तरह से डायलिसिस से बचने के लिए तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग या छिद्रित पैच तकनीक 3,21,23 का उपयोग करने के लिए है। ऐसे Nystatin के रूप में बाद, ताकना बनाने एंटीबायोटिक अणुओं के बारे में पिपेट समाधान के लिए जोड़ा जा सकता है। इन छिद्रों के गठन कोशिका के भीतर दूसरा दूत तंत्र बाधा पहुँचा के बिना धाराओं की रिकॉर्डिंग की अनुमति देगा। बहरहाल, नैनो में हाल ही में प्रगति और nanoelectrodes 36 के विकास के न्यूरोनल रिकॉर्डिंग में सुधार के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं। इस तरह के तकनीकी उन्नति तंत्रिका विज्ञान में अभी भी शहरी के तहत कर रहे हैंटी और अब उप सेलुलर डिब्बों कि अब तक शास्त्रीय साथ सुलभ नहीं थे भीतर, कम से कम invasiveness, यानी साथ पैच दबाना और intracellular रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की संभावना हमारी पहुंच में लगा रहे हैं intracellular परिवेश बरकरार रखते हुए, और जांच कर आयन चैनल के कार्यों पैच दबाना इलेक्ट्रोड 37।

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Disclosures

लेखकों में से कोई भी प्रतिस्पर्धी हितों या परस्पर विरोधी हितों की है।

Acknowledgments

इस शोध केन्द्र शासित प्रदेशों के पश्चिमी स्टार्टअप फंड (एस) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolated pulse stimulus generator A.M.P.I Master-8
Isolation unit (ISO-Flex) A.M.P.I ISO-Flex
Computer controlled Amplifier  Molecular Devices Multiclamp 700B
Digital Acquisition system Molecular Devices Digidata 1500
Microscope Olympus BX-51
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200
Chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-344B
Vibratome Slicer Leica  VT1000 S
Micropipette Puller Narishige PC-10
Imaging Camera Q Imaging QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10 Narishige PC-10
Glass capillaries WPI TW150F-3
Slice hold-down (harp) Warner Instruments 64-0255
Slice Chamber Warner Instruments RC-26
Nonmetallic syringe needle World Precision Instruments MF28G67-5
Syringe filters Nalgene 176-0045
Glue Gun Home Depot various
Gas dispersion tube Ace Glass Inc. various
Decapitation scissors Home Depot 100649198
Scalpel Handle #3 World Precision Instruments 500236
Small straight sharp tips scissors World Precision Instruments 14218
Vessel canulation forceps  World Precision Instruments 500453
Curved hemostatic forceps World Precision Instruments 501288
Economy Tweezers #3 World Precision Instruments 501976-6
Spatula Fisher Scientific 14357Q
Scooping spatula Fisher Scientific 14-357Q
Petri dish Fisher Scientific 08-747B
Filter paper Lab Depot CFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%  Sigma Aldrich/various G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%  Sigma Aldrich/various 232041
NaCl, 2.8 mM Sigma Aldrich/various S7653
HEPES, 20 mM Sigma Aldrich/various H3375
EGTA, 0.4 mM Sigma Aldrich/various E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM Sigma Aldrich/various T2265
Na2GTP, 0.3 mM Sigma Aldrich/various G8877
MgATP, 2 mM Sigma Aldrich/various A9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM Sigma Aldrich/various G4500
KCl, 20 mM Sigma Aldrich/various P3911
HEPES, 10 mM Sigma Aldrich/various H3375
EGTA, 0.2 mM Sigma Aldrich/various E4378
MgCl2 Sigma Aldrich/various M8266
Na2GTP, 0.3 mM Sigma Aldrich/various G8877
MgATP, 2 mM Sigma Aldrich/various A9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM Sigma Aldrich/various P3911
NaCl, 119 mM Sigma Aldrich/various S7653
NaH2PO4•H2O, 1 mM Sigma Aldrich/various S9638
NaHCO3, 26.2 mM Sigma Aldrich/various S8875
Glucose, 11 mM Sigma Aldrich/various G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM Sigma Aldrich/various 230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mM Sigma Aldrich/various C3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOH various
Kynurenic acid Sigma Aldrich/various K3375

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 112 मस्तिष्क टुकड़ा, पूरे सेल पैच दबाना वर्तमान दबाना वोल्टेज दबाना synaptic प्रसारण आंतरिक excitability।
ब्रेन स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग
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Segev, A., Garcia-Oscos, F.,… More

Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024, doi:10.3791/54024 (2016).

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