Protocol
אֶתִיקָה
כל העבודה בוצעה תחת אישור של בעלי חיים משרד הפנים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act 1986 בלונדון סקול אוף צער בעלי חיים רפואה היגיינה & Tropical המועצה לביקורת אתיקה. ARRIVE מנחה מלוות בדוח זה.
1. בקטע Vivo של Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei
- הסר מניה cryopreserved (המכונה stabilate) של T. ב. brucei זן GVR35-VSL-2 (זמין פרופ 'ג'ון קלי ב"לונדון סקול אוף להיגיינה ורפואה טרופית & דרך MTA) 9 מ חנקן נוזלי ולאפשר לאזן לטמפרטורת החדר. לדלל stabilate עד 2 x 10 4 trypanosomes / מ"ל סליין גלוקוז שנאגרו פוספט סטרילית (PBS-G) pH 8.0 (1 L PBS + 15 גלוקוז גרם) 10.
הערה: ט ב. brucei GVR35-VSL-2 הוא לא זיהומיות לבני אדם ודורשים סאפו מורשה מתקנים לבצע ניסויים. - inject עכבר CD1 נקבה 20-25 גרם עם 0.2 מ"ל מדולל trypanosomes דרך המסלול הזרקה (IP) עם מחט 25 G. זהו "עכבר התורם". מניחים את העכבר נגוע לתוך חינם פתוגן ספציפי (SPF) כרצונך -cage ולהאכיל.
הערה: עכברים CD1 הם זן outbred וט ב. זיהומי GVR35 brucei הם מאופיינים היטב זן זה. עם זאת, פרוטוקול זה הוא גם החלים על זנים טהורים או גנטי שונים, אך חשוב לציין כי צבע פרווה עשוי להשפיע על רגישות ההדמיה 6,9. - צג parasitemia היקפי ידי לקיחת דמים. מניחים את העכבר לתוך עוצר פלסטיק ולקחת 5 μl של דם מזנב ידי venepuncture עם 21 G מחט או venesection ומערבבים 1/10 עם אמוניום כלוריד סטרילי 0.85% ל lyse תאי דם אדומים ולאפשר ספירת קל.
- ספירת הדם המדולל נויבאואר hemocytometer.
- טען את הדם המדולל לשני התאים. ספירת הגר המרכזי כולהid של תא אחד לתת trypanosomes n. ריכוז trypanosomes בדם = n x 10 מ"ל 4 trypanosomes /, להתאים לכל גורם לדילול ולחשב את הממוצע של שני החדרים.
הערה: לאחר כ 5-7 ימים לאחר ההדבקה, parasitemia היקפי צריך לעלות מספיק לבצע זיהום בריכוז של 2 x 10 4 trypanosomes / מ"ל.
- טען את הדם המדולל לשני התאים. ספירת הגר המרכזי כולהid של תא אחד לתת trypanosomes n. ריכוז trypanosomes בדם = n x 10 מ"ל 4 trypanosomes /, להתאים לכל גורם לדילול ולחשב את הממוצע של שני החדרים.
- כאשר רמות trypanosome גבוהות מספיק עבור מספר העכברים הנדרשים, עבור לשלב 1.6. רמת parasitemia של 6 x 10 מיליליטר 4 trypanosomes / עכבר תורם אחת מספיקה עבור זיהום של 10 עכברים.
הערה: גדלים קבוצה משמעותית סטטיסטית, n = 6 לכל קבוצת טיפול של עכברים נדרשים 8. עבור דגמים אחרים של זיהום, חישובי כוח היו צריכים להיות מיושמים כדי לקבוע גדלים לקבוצה מתאימים. - מקום עכברים לתוך קופסא חום (ב 28-30 מעלות צלזיוס למשך כ 5-10 דקות) כדי לאפשר את ורידי הזנב להתרחב.כדי לגרום הרדמה מסוף, לנהל 20 מ"ג / iv pentobarbital ק"ג עם מחט 25 G. אשר העכבר הוא מורדם בעדינות על ידי לחיצה לכפות הרגלים כדי להבטיח שאין רפלקס נסיגה.
- Heparinize מחט 21 G על ידי aliquoting 5 מ"ל הפרין ב 5000 מ"ל / יחידות USP לתוך צינור Bijou ומוצץ פעמיים פנימה והחוצה של מחט מצורף מזרק 1 מ"ל.
- קח את מזרק 21 G מחט 1 מיליליטר heparinized, ולבצע לנקב לב על העכבר מעבר הרדים ידי החדרת מחט מרכזית מתחת לצלעות (אגל הדם יהיה ברכה בבסיס המחט) ומשוך בעדינות בחזרה על הבוכנה כדי לא להתמוטט לשכת בלב. לאסוף מינימום של 0.7 מ"ל של דם.
- לדלל דם נגוע לייצר הבידוד של 2 x 10 4 trypanosomes / מ"ל ב PBS-G pH 8.0 כצעד 1.1 לעיל.
הערה: בשלב זה, הדם הנותרים ניתן cryopreserved לייצר stabilate ידי ערבוב עם גליצרול 8%, 20% ca עוברי חום מומתסרום LF (היי-FCS) ו -72% דם נגוע. לאט להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס באמצעות להקפיא איטי מקפיא מיכל להשיג קצב הקירור של -1 ° C / min, לפני העברת חנקן נוזלי.
2. זיהום של עכברי ניסוי
- מניחים CD1 עכברות (~ 21-25 גרם) לתוך תיבת חימום חם בעדינות להתרחב ורידים. מניחים את העכברים חימם לתוך איפוק פלסטיק להזריק 0.2 מ"ל הבידוד בדילול לווריד עם מחט 25 G לווריד הזנב, שווה ערך ל -4,000 trypanosomes לכל עכבר. מניח לחץ באזור הזריקה לאחר מכן לעצור את הדימום.
הערה: זיהום Intraperitoneal הוא ניתוב חוקי של זיהום ויש בו נעשה שימוש במחקרים קודמים 10, אבל אנחנו מצאנו את זה פחות לשחזור מאשר המסלול תוך ורידי. - בחר באקראי עכברים בכלוב נגועים בקבוצות של 3 בכלובים-פרקו SPF. כביקורת, להזריק עכברות CD1 עם טפיל שאינו bioluminescent סוג בר, ט ב. brucei GVR35 (n =3).
- לפקח על הזיהום באמצעות מיקרוסקופיה סרטי דם
- דם ספוט 5 μl מן venepuncture או venesection לשקופית כוס ולבצע כתם דם (באמצעות שקופיות כוס שניות בעדינות את טיפת הדם על פני השקופית כדי להפיק סרט דק). אפשר שקופיות לייבוש באוויר.
- תקן את כתם דם עם 100% מתנול ואת הכתם עם Giemsa במשך 10 דקות לפני השטיפה עם DH 2 O ולאפשר לייבוש באוויר. תחת מטרה 100x לספור את מספר trypanosomes ב 10 שדות הראייה (FOV).
הערה: צילומי דם מתבצעים לצד הדמיה לא פולשנית כולה חיה מוקדם ככל שלאחר זיהום יום אחד. כאשר עיבוד מספר בעלי חיים, בשיטה זו של quantitation trypanosome עדיפה על פני ספירת hemocytometer כפי הדגימות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר ומנה מאוחר יותר.
3. פליטת אור הדמיה כדי לעקוב אחר זיהום
הערה: כדי לפקח על הזיהום, כולו עניםניתן להשתמש הדמיה אל פולשני.
- הכן פתרון המניות של D-luciferin, המצע בלוציפראז גחלילית, ב בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) 30 מ"ג / מ"ל. סנן לעקר ולהקפיא aliquots ב -20 ° C.
הערה: D-Luciferin הוא אור רגיש, ולכן להגן עליו מפני האור על ידי לפפה aliquots בנייר כסף. אין להקפיא להפשיר luciferin שוב ושוב כפי שהוא יכול להשפיע על הפעילות 11. - לחמם aliquot של D-luciferin לטמפרטורת החדר. הסר כל עכבר מהכלוב (כולל שליטה עכברים נגועים בזן טפיל סוג בר nonbioluminescent) ולהזריק 150 מ"ג / ק"ג של D-luciferin חיממה (מדולל DPBS) intraperitoneally עם מחט 25 G. מניחים את העכברים לתוך תא isofluorane כ 5 דקות כדי להשרות הרדמה עם 2% isofluorane / O 2 תערובת של 2.5 ליטר / דקה.
הערה: העכברים להיות נייחים כשהם נמצאים תחת הרדמה. עבור תרמי משמש כאן, 3 עכברים ניתן לעבד בכל פעם. אם עכברים הם anesthetized עבור יותר מ -30 דקות, משחה דמעה מלאכותית עיניים יכול להיות מיושם כדי למנוע את העיניים של העכברים מהתייבשות. - עבור תרמי המתואר כאן, לפתוח את התוכנה לאתחל את המכשיר באמצעות תוכנה לפי הוראות היצרן. לרכוש תמונות הפעם הגיעה לטמפרטורת מצלמת צלחת מחוממת.
הערה: מכשיר זה אינו בדרך כלל כבוי, המאפשר את המכונה כדי לבצע כיולי רקע לילה. במקרה זה צריך להפעיל מחדש, זה חייב להפעיל בדיקת כיול ראשון. - מניחים את העכברים מורדם לתוך תרמי (ראה 3.5). השתמש מפרידי שחור גדולים בין העכברים כדי למזער לדמם דרך של כל אות bioluminescent בהירה. עכברי תמונה באמצעות סט של פעמי חשיפה; 1, 3, 10, 30, 60 ו -180 שניות, עם binning בינוני, 1 f / stop מסנן פתוח, ותחום E נוף (12.5 x 12.5 ס"מ 2).
ההערה: עכברי השליטה נגועים טפילי GVR35 nonbioluminescent סוג הבר לספק backgrערך פליטת אור ound. מניסוי קינטיקה luciferin (איור 6) עם מודל זה, מצאנו כי פסגות אות פליטת האור ב -10 דקות לפרסם ממשל וההדמיה לוקחת כ 5 דקות עבור 3 עכברים. קח זמנים זה בחשבון בעת הרדמה והדמיה העכברים. - כדי להבטיח הדמיה יסודית של העכברים, לסובב שתיתן להם תמונת גחון, הגבה ו לרוחב. לשמור על עקביות סדר אוריינטציה הדמיה בין בעלי חיים רציפים.
- לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מן ההרדמה בהשגחה לפני שחזר כלוב SPF.
- המשך הדמיה עכברים כל 7 ימים עד יום 21 לאחר הפגיעה. לא צריך להיות עלייה מתמדת אות פליטת אור על החיה כולה.
- בשעה D21, תמונה ודם הסרט העכברים כמתואר לעיל, והמנה עכברים עם 40 מ"ג / ק"ג diminazene aceturate intraperitoneally. תרופה זו תנקה את parasitemia ההיקפי אבל לא לחצות את הדם-braiמחסום n, ולכן מאפשרת ויזואליזציה טובה יותר של זיהום במערכת העצבים המרכזית.
הערה: aceturate Diminazene הוא תרופה ומבוססת המשמשת לטיפול trypanosomiasis חי בשלב מוקדם. - המשך הדמיה וניטור ב D28 ו D35.
4. אישור CNS זיהום
- בשעת D35, עכברי תמונה כמפורט לעיל (שלבי 3.1-3.4).
- לאחר הדמיה, לאפשר עכברים להתאושש מעכברי הרדמה, ולגרום לדימום מחודש כמפורט צעד 1.6-1.8, איסוף דם לצורך ניתוח נוסף.
- בעקבות לנקב לב, perfuse עכברים עם 20 מ"ל PBS (אופציונלי: להוסיף 3 מ"ג / מ"ל של luciferin לפתרון זלוף) דרך הלב כדי לנקות דם מן האיברים לחדש תווית luciferin שאולי פינה מאזור המוח על מרווח זמן משלב 4.1.
- הוצא בעדינות את המוח, באמצעות מספריים מעוקלים, חיתוך מהבסיס סביב היקף הגולגולת, מרים את החלק העליון של הגולגולת, כדי לאפשר למוחשירים החוצה בזהירות עם מלקחיים מעוקלים.
- מניחים את המוח נכרת על קטע של פלסטיק שחור פיפטה 50 μl של 15 מ"ג / מ"ל luciferin מעל האיבר לפני הדמיה, כדי להבטיח luciferin נאותה נוספה המוח נכרת. תמונה תוך שימוש בהגדרות כנ"ל. זה יהיה להדגים לוקליזציה של הזיהום ההמיספרות של המוח.
הערה: כימות Downstream של parasitemia על המוח הניכר יכולה להתבצע על ידי qPCR כפי שתוארו לעיל 8. יישומים במורד הזרם חלופיים אחרים עשויים לכלול היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה לזהות טפילים ברקמת המוח לאחר קיבעון.
5. כימות של הדמיה פליטת אור
הערה: פליטת אור ניתן לכמת באמצעות האזור של עניין (ROI) עם תוכנת ההדמיה ותיקן עבור פליטת אור רקע.
- באמצעות כלי ROI, ליצור ROI מלבני עבור quantitation כל חיהnd למקמו מעל תמונת העכבר לכסות קצה האף כדי בבסיס הזנב של העכבר. השתמש באותו בתיבת הגודל עבור כל בעל חיים וכל נקודת זמן. כאשר מסתכלים על ההחזר על ההשקעה עבור המוח, להשתמש ROI חוזר באותה דרך, מיקומה על אזור הראש העכבר בתמונה.
- אם תרצה, להתאים תמונות להופיע באותו ספקטרום עבור ייצוג חזותי של זיהום.
הערה: התוכנה בה משתמשת כאן מייצרת מפת צבע עבור כל תמונה המותאמת באופן אוטומטי עבור ספירת פוטון מינימום ומקסימום. כדי לאפשר השוואה ויזואלית בין סדרה של תמונות, את סולם הצבעים חייב להיות מוגדר אותם הערכים עבור כל התמונות.- שימוש בתמונה עם פליטת האור הגבוהה ביותר ואת הכרטיסייה 'תמונה להתאים' על לוח הכלי, בחר סולם לוגריתמים ו למינימום סקאלת צבעים מתאים ומקסימום (נקבע באופן אמפירי). החל סולם זה על כל התמונות לאורך הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב התקדמות המחלה בעקבות זיהום של עכברים עם ט ב. brucei, מודל trypanosomiasis אדם אפריקני. איור 1 מציג את ציר הזמן של פרוטוקול הניסוי, הוכיח את לוח הזמנים עבור טיפול שלבים והדמיה. איור 2 הדגים שדה טיפוסי של נוף כתם דם Giemsa מוכתם קבוע משמש לכמת parasitemia ההיקפי, עם trypanosomes ותאי דם אדומים הנוכחי. פיתוח של הזיהום בחיות יכול להיות מלווה מדידת פליטת האור כמו באיור 3, אשר מציג את החיות הנגועות במהלך ניסוי עם באותן החיות צלמו בכל נקודת זמן. דרך הקורס של זיהום עליית פליטת אור ניתן לראות את כל החיות על 21 הימים הראשונים כמו האות הופכת יותר מופרחת ואינטנסיבית, עם אזורים גבוהים של BLI (מיוצג אדוםמסולם מפת חום) באזור הטחול. בשעת עכברי D21 מטופלים עם diminazene aceturate כמפורט באיור 1, שלאחר הדמיה, וירידת פליטת האור ניתן להבחין D28 כמו הזיהום ההיקפי מנוקה, עם הרמות נמוכות של אות להיות נוכחות באזור הראש של העכברים. בשעת D35 האות עדיין נשארה באזור הראש הפכה אינטנסיבי יותר המציין זיהום מוח אפשרי. המוח הוא נכרת לאשר אות קיימת בתוך רקמת המוח ולאחר מכן ניתנת ונרשמת על ידי qPCR.
באופן מסורתי, כתמי דם משמשים כדי לכמת התקדמות זיהום שפעות טיפול. עם זאת, אלה רק למדוד parasitemia ההיקפי, ולא ניתן להשתמש כדי להעריך רמות טפילות במוח. איור 4 משלב לכמת הן parasitemia ההיקפי פליטת האור להפגין קינטיקה מחלה. בשעת D7 אות BLI גבוהה קיימת של 10 8 באיור 3 . זה מדגים את הרגישות רבה יותר של גישת פליטת האור על ספירת סרט דם מסורתית.
כדי לוודא כי פליטת האור באזור הראש ללוקליזציה באמת רקמת המוח, בסוף הניסוי במוחם הם נכרתו ו bioluminesדעך נמדד vivo לשעבר (איור 5). הבדל בניטל זיהום בין המוח נתפס לעתים קרובות אות אינו מופיע בתרגום לאזורים ספציפיים אנטומיים כמו לחלוקת אותות BLI האינטנסיביים יכול להשתנות בין בעלי חיים הנגועים. לדוגמא, אות BLI חזקה שוהה פקעת הרחת עכבר 2 ו -3 במוח הקטן עכבר 3, בעוד שבמוח מעכבר 1 מציג את החלוקה כללית של אות BLI בכל רחבי המוח. כמו המוח יכול להיות צלם מייד לאחר דילול העכברים, ניתוח נוסף יכול להתבצע על רקמת המוח כמו הרקמה אינה פגומה בתהליך הדמית vivo לשעבר.
איור 1:. ציר הזמן של הניסוי כולל הדמיה, דגימה טיפול בשל האופי הלא פולשנית של הדמיה פליטת אור, ניטור של זיהום יכול להתרחש מומחדש לעתים קרובות יותר מאשר מפורט בתרשים. הדגימה והדמיה כל 7 ימים יאפשר זיהוי של זיהום מתקדם. הטיפול ב- D21 עם aceturate diminazene מסיר parasitemia היקפי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של זיהום הראש והמוח. Aceturate Diminazene היא תרופה בשלב מוקדם הוא לא מסוגל לעבור את מחסום הדם-מוח בכמות מספקת כדי לנקות את הזיהום בשלב מאוחר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. Giemsa ויטראז Trypanosomes על סרט דם קבוע, trypanosomes מוכתם Giemsa (סגול עם גרעינים ורודים, נסגר חץ) ניתן לזיהוי בקלות נגד כדוריות דם האדומות (מוכתם כחול, פתוח חץ) ניתן לספור במהירות כדי להשיג את המספר של trypanosomes / 10שדות מבט תחת מטרת 100X. סרגל הסולם מציין 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: פליטת אור הדמיה של עכברים נגועים שלוש חי נציג של קבוצה 6 עכברים נגועים עם VSL-2 (M = עכבר) ושלט נגוע סוג בר (נגוע הקו הטפיל nonbioluminescent הסוג בר).. Luciferin היה מנוהל גם על העכבר המלא לפני ההדמיה, אשר מספק את המדידה ברקע. סולם מפת החום מוצג עם אדום המציין רמות גבוהות של פליטת אור, שהשווה מספרים גבוהים של טפילים, וכחול המציין רמות נמוכות של פליטת אור (D = יום). העכבר המלא אין פליטת אור כצפוי ללא טפילים להביע בלוציפראז. f תמונה rom בורל-Saward et al. 8 על ידי רשות של הוצאת אוניברסיטת אוקספורד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. השוואה של פליטת אור ודם הסרטים Parasitemia פליטת אור סך של כל חיה כולו ונרשם כמפורט בסעיף 5 ו parasitemia ההיקפי ונרשם על ידי ספירת טפילי כתמי דם. ברי שגיאה לציין סטיית תקן מן הממוצע. תמונה מתוך בורל-Saward et al. 8 על ידי רשות של הוצאת אוניברסיטת אוקספורד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5 "src =" / files / ftp_upload / 54,032 / 54032fig5.jpg "/>
איור 5:. Ex Vivo הדמיה של המוח ניכר מוחות perfused של העכברים צלמו באיור 3 הוסרו צלמו כמתואר 4.5. פליטת האור נמדדת בסולם מפת החום כמו באיור 3. המוח השליט מאת עכבר נגוע טפילי nonbioluminescent סוג הבר טופל גם עם luciferin ואין פליטת אור ניתן לצפות. סרגל הסולם מציין 1 סנטימטר. נתון זה יש הבדל בין בורל-Saward et al. 8 על ידי רשות של הוצאת אוניברסיטת אוקספורד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: קינטיקה של Luciferin פליטת אור עכברים VSL-2-נגוע.שלושה VSL-2-נגועים עכברים CD1 הוזרקו 150 מ"ג / ק"ג ip של luciferin והניח מיד בתוך תרמי. העכברים היו צלמו במשך 60 דק 'ו פליטת האור שלהם חושבה על מנת לקבוע את חלון ההדמיה האופטימלי לאחר luciferin ממשל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתפתחות המינית של ט bioluminescent ב. זן brucei GVR35 מאפשר הדמיה של זיהום trypanosome מן המוקדמות בשלב מאוחר. מודלי זיהום קודמים לא הצליחו לזהות בשלב מאוחר, כאשר טפילים הם במוח, בזמן אמת במיקרוסקופ סרט דם, ודרשו קולינג והסרת המוח של עכברים הנגועים לקבוע טפיל נטל 12. פליטת אור מפחית השתנות בין עכבר כמו עכבר אחת ניתן לעקוב לאורך כל כולו של זיהום הערכה איכותית מהירה של זיהום ניתן לראות בכל שלב. השיטה רגישה מאוד של הדמיה פליטת אור מאפשר זיהום ברמה נמוכה כדי להיות מזוהה מוקדם יותר מיקרוסקופיה דם-הסרט, עם כמה כמו 100 trypanosomes לזיהוי באמצעות הדמיה לעומת 5 x 10 3 trypanosomes / מ"ל לזיהוי באמצעות מיקרוסקופיה 9. בנוסף, בהתאם לאותם בעלי חיים לאורך הניסוי לחסלזה צורך קבוצות בעלי חיים נפרדים עבור כל נקודת זמן, צמצום שימוש חי מאוד.
פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן ניתן להתאים כדי להתאים את הצורך המדעי כמו האופי הלא-פולשני כלומר הדמיה נוספת ותכופה יותר יכולה להתבצע (באישור אתיקת החיה המתאימה), אבל להערכת D21 זיהום המוח הוא הזמן המוקדם נְקוּדָה. בשלב זה, תרופות בשלב מוקדם הם כבר לא יעילים בפינוי טפילים בשלב מאוחר. זוהי גם חובה כי העכברים הם צלמו באותם התנאים בכל נקודת זמן. לדוגמא, באותן שעות החשיפה אותה ההשקפה (גחון או גב) יש להשתמש כדי להבטיח מדידה מדויקת של הקורס של זיהום.
אם במהלך ההדמיה אין אות קיימת (כאשר ידועה כי המודל זה יש דלקת), ישנם מספר הצעדים שניתן בעקבותיו על מנת לקבוע את מקור הבעיה. ראשית, זמן החשיפה ניתן להגדילעד למקסימום של 5 דקות שאמורות להיות מסוגל לזהות אותות פליטת אור נמוכים מאוד. אם אות עדיין לא מזהה וסרטי דם הם חיוביים עבור טפיל, הצעד הבא יהיה לאשר את הטפיל עדיין bioluminescent. זה יכול להתבצע באמצעות assay פעילות בלוציפראז מסחרי במבחנה פליטת אור יהיה מזוהה באמצעות luminometer. אם בשלב זה הטפיל הוא כבר לא bioluminescent, היציבות של המבנה ב הטפיל היה צורך לטפל.
הצבע של העכברים עושה את הבדל הרגיש הדמיה כמו פליטת אור הנפלט מוחלש על ידי פרווה כהה 6,9 עור. בחירה של זן עכבר, כגון עכברים לבנים או עכברים בעירום, ולכן יכולה לשפר את תוצאות. אם צבע עכבר הוא מוגבל, למשל על ידי שימוש קו מהונדס, אז גילוח או את השיער מתוך עכברי אזור של אינטרס יכול לשפר באופן משמעותי את רגישות 6.
דהלמרות הרגישות המשופרת לאותת כי מודל bioluminescent מייצר, פליטת האור אינו תואמת את parasitemia ההיקפי לצפות ישירות בסרטי דם (ימים 7-21 שמוצגים באיור 4). ספרות תעדה כי הזיהום בשלב המוקדם של trypanosomiasis מדביק את מערכת hemolymphatic 1, והוא אינו מוגבל אך ורק למערכת הדם וזה, יחד עם הזיהום של איברים היקפיים, עשוי להסביר מדוע כאשר parasitemia ההיקפי ניתן לזהות בקושי בסרטי הדם, פליטת אור גלוי כפי שניכר במיוחד מהנתונים ליום 7 באיור 3 ו -4. עם זאת, אין זה אומר כי הדמיה פליטת אור יכול לשמש רק בתור מדידה איכותית של זיהום, וניתוח נוסף נדרש כדי לקבוע נטל טפיל מוחלט.
הדמית פליטת אור יש את היכולת בשימוש עם פתוגנים זיהומיות אחרים שקשה מוnitor, עם במודלים של מכרסמים של מחלה שגאס מלריה טוקסופלסמוזיס כבר הוקם 13-16. יחס אות לרעש הגבוה של פליטת אור בשילוב עם יכולתו לעקוב אחר זיהומים בזמן אמת יכולה לספק ערכת תרופה יותר רגישה, לא פולשנית, כמו גם להשיג הבנה טובה יותר של קינטיקה זיהום במערכת העצבים המרכזית, מה שהופך אותו לכלי רב ערך מחקר למחלות זיהומיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים ג'ון קלי מרטין טיילור (London School of Medicine טיפוח טרופי) למתן ט ב. GVR35-VSL-2 brucei וד"ר אנדריאה Zelmer (LSHTM) עצה הדמיה in vivo. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית ביל ומלינדה גייטס גלובל בריאות (OPPGH5337 מספר מענק).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma, UK | P4417 | tablets pH 7.4 |
| Glucose | Sigma, UK | G8270 | 99.5% (molecular) grade |
| Ammonium chloride | Sigma, UK | A9434 | 99.5% (molecular) grade |
| Heparin (lithium salt) | Sigma, UK | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, UK | D4031 | Sterile filtered |
| Mr. Frosty | Nalgene, UK | ||
| Giemsa | Sigma, UK | G5637 | |
| D-Luciferin | Perkin Elmer, UK | ||
| Sigma, UK | 115144-35-9 | ||
| Diminazene aceturate | Sigma, UK | D7770 | Analytical grade |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, UK | other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, UK | proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own | |
| 1 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10142104 | |
| 20 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10743785 | |
| 25 G Needles | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G Needles | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Twin-frosted microscope slide | VWR, UK | 631-0117 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou tube | StarLab, UK | E1412-0710 | |
| Mouse restrainer | Sigma, UK | Z756903 | our restrainer was made in-house, this is a similar model |
References
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).
- Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).
- Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).
- Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).
- Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571 (2013).
- Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
- Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).
- Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).
- Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
