Protocol
윤리학
모든 작업은 영국 홈 오피스 동물의 승인 (과학적인 절차) 법 1986 위생 및 열대 의학 동물 복지와 윤리 심의위원회의 런던 학교에서 실시 하였다. 가이드 라인에 도착하는이 보고서에 따른다.
발광 생물 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei의 생체 항로 1.
- T.의 냉동 보관 재고 (라고 stabilate)를 제거 비. brucei 변형 액체 질소에서 9 (MTA를 통해 위생 및 열대 의학의 런던 학교 교수 존 켈리에서 구입 가능) GVR35-VSL-2 및 실온에 평형 수 있습니다. 멸균 인산 완충 포도당 식염수 (PBS-G)의 pH 8.0 (1 L PBS + 15g 포도당) (10)에 2 × 10 4 트리 파노 솜 / ㎖로 stabilate을 희석.
참고 : T.를 비. brucei GVR35-VSL-2는 인간에게 비 감염성이며 SAPO 실험을 수행 할 시설 허가가 필요합니다. - INJ요법 25 G 바늘로 복강 내 경로 (IP)를 통해 trypanosomes에 희석 0.2 ml의와 20-25g 여성 CD1 마우스입니다. 이것은 "기증자 마우스"입니다. 특정 병원체 무료 (SPF) -cage 및 사료 광고 임의로에 감염된 마우스를 놓습니다.
참고 : CD1 마우스는 이계 변형 및 T. 있습니다 비. brucei GVR35 감염이 변형에 잘 특징이다. 그러나이 프로토콜은 근친 또는 유전자 변형 계통에 적용 가능하지만, 촬상 -6,9-의 민감도에 영향을 미칠 수 털 색깔 중요하다. - 혈액 샘플링에 의해 주변 기생충을 모니터링합니다. 플라스틱 제한 수단에 마우스를 놓고 21 G 바늘이나 사혈와 venepuncture에 의해 꼬리에서 혈액의 5 μl를 타고 붉은 혈액 세포를 용균 쉽게 계산 할 수 있도록 0.85 % 멸균 염화 암모늄 1/10 섞는다.
- 노이 바 우어 혈구에서 희석 된 혈액을 계산합니다.
- 두 챔버로 희석 된 혈액을로드합니다. 전체 중앙 GR 카운트하나의 챔버의 ID는 n 개의 트리 파노 솜을 얻었다. 혈액 = N × 104 트리 파노 솜 / ㎖에서 트리 파노 솜의 농도는 모든 희석 계수를 조정하고 두 챔버들의 평균을 계산한다.
주 : 후 약 5~7일 후 감염, 기생충 주연 2 × 104 트리 파노 솜 / ml의 농도로 감염을 수행하기에 충분히 상승한다.
- 두 챔버로 희석 된 혈액을로드합니다. 전체 중앙 GR 카운트하나의 챔버의 ID는 n 개의 트리 파노 솜을 얻었다. 혈액 = N × 104 트리 파노 솜 / ㎖에서 트리 파노 솜의 농도는 모든 희석 계수를 조정하고 두 챔버들의 평균을 계산한다.
- 트리파노소마 수준은 1.6 단계로 이동 필요한 생쥐의 수만큼 높은 경우. 하나의 공여 마우스 6 × 104 트리파노소마 / ml의 기생충 레벨 10 마우스 악성 충분하다.
참고 : 통계적으로 유의 한 그룹 크기를 들어, N = 6 마우스의 각 치료 그룹 8 필요하다. 감염의 다른 모델의 경우, 파워 계산은 해당 그룹의 크기를 결정하기 위해인가 될 필요가있을 것이다. - (약 5 ~ 10 분 동안 28 ~ 30 ℃에서) 열 상자에 장소 마우스는 꼬리 정맥이 팽창 할 수 있도록합니다.터미널 마취 유도 20 밀리그램 / 25 G 바늘 kg 펜토 바르 비탈 정맥을 관리합니다. 확인 마우스 부드럽게 움츠림 반사가 없는지 확인하는 발바닥을 눌러 마취.
- 비쥬 튜브에 5000 USP 단위 / ㎖의 헤파린을 5 ㎖ 분취하고 및 1 mL의 주사기에 부착 된 바늘로부터 회 흡인하여 21 G 바늘을 Heparinize.
- 헤파린 21 G 바늘과 1 ML의 주사기를 가지고 가고, 흉곽 아래 중앙에 바늘을 삽입하여 마취 통로 마우스의 심장 천자를 수행 (혈액의 비드 바늘의베이스에 풀 것) 부드럽게 플런저를 철수 그래서 같은 마음의 실을 축소 할 수 없습니다. 혈액의 0.7 ML의 최소를 수집합니다.
- 위의 단계 1.1로 PBS-G의 pH 8.0에서 2 × 10 4 트리 파노 솜 / ㎖의 접종을 생성하기 위해 감염된 혈액을 희석.
주 :이 시점에서 남아있는 혈액을 8 % 글리세롤, 20 % 열 - 불 활성화 된 태아 (CA)와 혼합하여 stabilate 생산 동결 보존 할 수있다LF 혈청 (하이 - FCS)와 72 % 감염된 혈액. 천천히 액체 질소로 전송하기 전에, C / 분 ° -1 냉각 속도를 달성하기 위해 컨테이너를 동결 느린 동결을 사용하여 -80 ℃에서 동결.
실험 쥐의 2. 감염
- 부드럽게 따뜻한 정맥을 팽창하기 위해 가열 상자에 CD1에게 여성 마우스 (~ 21-25g)을 놓습니다. 플라스틱 구속으로 가온 마우스를 넣고, 마우스 당 4,000 트리파노소마 동등한 꼬리 정맥 내로 25 G 바늘 정맥 0.2ml의 접종 물을 희석하여 주입. 출혈을 막기 위해 후 주사 부위에 압력을 넣습니다.
복강 내 감염은 감염의 유효한 경로이며, 이전의 연구 (10)에 사용되어왔다, 그러나 우리는 정맥 경로보다이 덜 재현 발견 :합니다. - SPF-배출 케이지 3 그룹에 감염된 마우스와 케이지를 무작위로. 대조군으로서, 야생형 비 생물 발광 기생충, T.와 CD1 암컷 마우스를 주입 비. brucei GVR35 (N =삼).
- 혈액 영화 현미경을 통해 감염을 모니터링
- 스팟 5 μL의 유리 슬라이드 상 venepuncture 또는 사혈에서 혈액 (부드럽게 박막을 생성하기 위해 상기 슬라이드를 통해 혈액의 방울을 밀어 제 유리 슬라이드를 이용) 혈액 도말 표본을 수행한다. 공기 건조에 슬라이드를 허용합니다.
- DH 2 O로 세척하기 전에 10 분 동안 김사 100 % 메탄올 및 얼룩과 혈액 도말 표본을 수정하고 공기 건조를 할 수 있습니다. 100X 목적에서보기 (FOV)의 10 분야에서 트리 파노 솜의 수를 계산합니다.
주 : 혈액 촬영이 일찍 일일 감염 후 같은 전체 동물의 비 침습적 영상과 함께 실시된다. 동물들을 처리 할 때 샘플을 실온에서 저장하고 나중에 계산 될 수 있으므로, 트리파노소마 정량이 방법은 혈구 계수보다 선호된다.
3. 생물 발광 이미징 감염을 추적하는
참고 : 감염을 모니터링하려면 전체 ANIM알 비파괴 이미징을 이용할 수있다.
- 30 ㎎ / ㎖에서 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS)에서 D-루시페린, 반딧불 루시 페라 기판의 재고 솔루션을 준비합니다. 필터 소독 및 -20 ° C에서 분량 씩 냉동.
참고 : D-루시페린 민감한 빛 때문에 호일에 분량 씩 포장하여 빛으로부터 보호. 이 활동 11에 영향을 미칠 수있는 반복 루시페린 - 해동 냉동하지 마십시오. - 실온 D-루시페린의 나누어지는을 따뜻하게. (nonbioluminescent 야생 형 기생충 균주에 감염 제어 마우스 포함) 케이지에서 각 마우스를 제거하고 복강 25 G 바늘과 150 밀리그램 / (DPBS에 희석) 가온 D-루시페린의 kg을 주입. / 분 2.5 L에서 2 % 이소 플루오 란 / O 2 믹스 마취를 유도하기 위해 약 5 분 동안 이소 플루오 란 챔버에 마우스를 놓습니다.
참고 : 그들이 마취 할 때 마우스가 움직이지된다. 여기에 사용되는, 이미 저를 들어, 마우스 3 번에 처리 될 수있다. 마우스는 anesthet 경우이상 30 분 동안화된 안과 인공 눈물 연고 마르지 마우스의 눈을 방지하기 위해 적용될 수있다. - 여기에 설명 된 이미 저를 들어, 소프트웨어를 열고 제조업체의 지침에 따라 소프트웨어를 사용하여 시스템을 초기화합니다. 카메라 가열 플레이트가 온도에 도달 한 후에는 이미지를 획득.
참고 :이 장비는 보통 하룻밤 배경 교정을 수행하는 시스템을 가능하게 꺼져되지 않습니다. 그것은 다시 시작해야하는 경우, 먼저 교정 검사를 실행해야합니다. - (3.5 참조) 이미 저에 마취 마우스를 놓습니다. 어떤 밝은 생물 발광 신호를 통해 출혈을 최소화하기 위해 마우스 사이에 큰 검은 분리기를 사용합니다. 노출 시간의 세트를 이용하여, 화상을 마우스; 뷰 E 매체 비닝 1 F / 정지 개방 필터 및 필드 1, 3, 10, 30, 60 및 180 초 (12.5 X 12.5 cm 2).
참고 : 야생형 nonbioluminescent GVR35 기생충에 감염 제어 마우스가, 배경을 제공운드, 생물 발광 값입니다. 이 모델과 함께 루시페린의 반응 속도 실험 (그림 6)에서, 우리는 10 분에서 생물 발광 신호 피크 관리를 게시하고 영상은 약 3 마우스 5 분 걸리는 것으로 나타났습니다. 마취와 쥐를 이미징 할 때 고려 사항으로이 척도를 가져 가라. - 쥐의 철저한 영상을 보장하기 위해, 복부, 지느러미와 측면보기를 얻기 위해 회전합니다. 순차적 동물 사이의 이미징을위한 방향의 순서로 일관성을 유지한다.
- 촬영 후, 마우스는 SPF-케이지에 반환하기 전에 관찰하에 마취에서 회복 할 수 있습니다.
- 21 일 후 감염 될 때까지 매 7 일마다 마우스 이미징 계속합니다. 전체 동물을 통해 생물 발광 신호의 꾸준한 증가가 있어야합니다.
- D21, 이미지와 혈액 필름 / kg diminazene aceturate 복강 40 mg을 가진 쥐를 상기하고, 선량으로 쥐에서. 이 약은 주변 기생충을 취소되지만 혈액 꼰 로프 코를 교차하지 않습니다N 장벽, 따라서 CNS 감염 나은 시각화를 가능하게한다.
참고 Diminazene aceturate의 초기 단계 동물 트리파노소마 증을 치료하기 위해 사용하는 잘 확립 된 약물이다. - D28과 D35에서 이미징 및 모니터링을 계속합니다.
4. CNS 감염을 확인
- D35에서, 위에서 설명한 바와 같이 이미지 마우스 (3.1-3.4 단계).
- 촬영 후, 추가 분석을 위해 혈액을 수집, 단계 1.6-1.8에 설명 된대로 마우스는 마취에게서 피를 뽑다 마우스를 복구 할 수 있습니다.
- 심장 천자 후, 20 ml의 PBS와 마우스를 관류 (옵션 : 3 밀리그램 / 관류 액에 루시페린 ml의 추가) 기관에서 혈액을 취소하고 시간 간격 뇌 영역에서 삭제했을 수 있습니다 루시페린 레이블을 재 도입하는 마음을 통해 단계 4.1.
- 부드럽게 뇌 있도록, 만곡 가위를 이용하여 두개골의 원주 둘레베이스로부터 절단하고, 두개골 상부를 올려 뇌를 제거부드럽게 곡선 집게 함께 해제된다.
- 적절한 루시페린이 절제 뇌에 추가 된 보장하기 위해, 검은 색 플라스틱 피펫 이전 이미지로 기관을 통해 15 ㎎ / ㎖ 루시페린의 50 μL의 한 부분에 절제된 뇌를 놓습니다. 위와 같이 설정을 사용하여 이미지. 이것은 뇌 반구에 감염의 지역화를 시연 할 예정이다.
주 : 앞서 8 바와 같이 절제 뇌 기생충의 하류 정량화 qPCR에 의해 수행 될 수있다. 다른 대안 다운 스트림 응용 프로그램은 고정 다음 뇌 조직에 기생충을 식별하기 위해 조직 학적 또는 면역 조직 화학을 포함 할 수 있습니다.
생물 발광 이미징 5. 정량
주 : 생물 발광 이미징 소프트웨어이자 (ROI)의 영역을 사용하여 정량화 배경 생물 발광 대해 보정 될 수있다.
- 투자 수익 (ROI) 도구를 사용하면, 전체 동물의 정량 A의 직사각형 ROI를 생성차 마우스의 꼬리의베이스에 코 끝을 충당하기 위해 마우스를 이미지 위에 올려 놓으. 각 동물마다 포인트에 동일한 크기의 창을 사용. 뇌에 대한 ROI를 볼 때, 이미지에 마우스 두부를 위에 위치시키는, 동일한 방법으로 원형 ROI를 사용한다.
- 원하는 경우, 감염의 시각적 표현에 대해 동일한 스펙트럼에 나타나는 이미지를 조정합니다.
참고 : 여기에 사용되는 소프트웨어가 자동으로 최소 및 최대 광자 계수 조정 각 이미지의 색상 맵을 생성한다. 일련의 이미지 사이의 시각적 비교를 사용하려면, 컬러 스케일은 모든 이미지에 대해 동일한 값으로 설정해야합니다.- 가장 높은 생물 발광 및 도구 팔레트에서 '이미지 조정'탭을 갖는 이미지를 사용하여, 로그 스케일과 적절한 컬러 규모의 최소 및 최대 (경험적으로 결정되는)을 선택합니다. 실험을 통해 모든 이미지에이 비율을 적용합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 T.와 마우스의 감염 다음 질병의 진행을 수행하는 방법을 보여줍니다 비. brucei는 인간의 아프리카 트리파노소마 증의 모델이. 그림 1 치료 및 이미징 단계의 시간표를 보여주는 실험 프로토콜의 타임 라인을 보여줍니다.이 주변 기생충을 정량하는 데 사용되는 고정 김사 묻은 혈액 도말 검사에서보기의 전형적인 필드를 보여줍니다 그림, 트리 파노 솜과 적혈구 현재와. 동물에서 감염의 개발은 각 시점에서 이미징 된 동일 동물 실험의 과정을 통해 감염된 동물을 보여준다도 3에서와 생물 발광 측정 하였다 될 수있다. 감염 신호 개 파종하고 강렬한대로 생물 발광의 증가 BLI 높은 영역으로, 제 이십일일 통해 모든 동물에서 관찰 될 수있는 과정을 통해 (적색으로 표시비장 지역에서) 열지도 축척에서. 도 1 포스트 영상에 자세히 D21 생쥐 diminazene aceturate로 처리하고, 주변 감염 클리어로 생물 발광의 감소는 신호의 로우 레벨은 쥐의 머리 영역에 존재하여, D28에서 관찰이 가능. D35에서의 신호는 여전히 헤드 영역에 남아 가능한 뇌 감염을 나타내는 더 강렬되었다. 뇌는 신호가 뇌 조직 내에 존재하고 qPCR에 의해 정량화 될 수 확인 절제된다.
전통적으로, 혈액 얼룩은 감염의 진행과 치료 효과를 정량화하는 데 사용됩니다. 그러나, 이들에만 주연 기생충을 측정하고, 뇌에서 기생충 수준을 평가하기 위해 사용될 수 없다.도 4는 주연 기생충 질병 동력학을 보여 생물 발광 양자의 정량 결합도. D7에서 높은 BLI 신호 (10) (8)의 존재 D35에도 3에서 볼 수있는 두부의 생물 발광 측정을 계속 . 이는 기존의 혈액 필름 계산을 통해 생물 발광 방식의 민감도를 보여줍니다.
헤드 지역의 생물 발광이 진정으로 두뇌가 절제되어 실험과 biolumines의 끝에서, 뇌 조직에 로컬 라이즈되어 있는지 확인하려면cence은 생체 외 (그림 5)를 측정 하였다. 뇌 사이의 감염 부담의 차이는 종종 볼 수와 신호는 감염된 동물 사이에 다를 수 있습니다 강렬한 BLI 신호의 분배로 특정 해부학 지역에 현지화 표시되지 않습니다. 마우스 (1)로부터 뇌의 모든 뇌 위에 BLI 신호의 일반적인 분포를 나타낸다 예를 들면, 강한 BLI 신호는 마우스 (2, 3)와 마우스 3 소뇌의 후각 망울에 존재한다. 뇌는 쥐 컬링 직후에 묘화 될 수있는 바와 같이, 상기 분석은 조직의 생체 외 이미징 과정에서 손상되지 않는 한 뇌 조직에서 수행 될 수있다.
그림 1 :. 영상, 샘플링 및 치료를 포함하여 실험의 타임 라인으로 인해 생물 발광 영상의 비 침습적 특성, 감염의 모니터링 모 발생할 수 있습니다그림에 설명 된 것보다 자주 다시. 샘플링 및 이미징 7 일마다이 진행 감염의 식별을 가능하게한다. diminazene aceturate와 D21의 치료는 머리와 뇌 감염의 더 나은 시각화 할 수 있도록 주변 기생충을 제거합니다. Diminazene aceturate는 초기 단계의 약물이며, 후기 감염을 취소 할 충분한 양의 혈액 - 뇌 장벽을 통과 할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 김사 스테인드 trypanosomes에 고정 된 혈액 필름에서 김사 염색 트리 파노 솜 (파란색, 열려있는 화살표 스테인드) 적혈구에 대한 검출 용이하고 신속하게 수를 얻기 위해 계산 될 수있다 (핑크 핵 보라색은 화살표 마감) 트리 파노 솜 / 10100X 목표 아래보기의 필드. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 감염된 마우스의 생물 발광 영상 VSL-2 (M = 마우스) 및 (야생형 nonbioluminescent 기생충 라인 감염) 야생 형 감염 제어에 감염된 6 마우스의 그룹의 세 가지 대표하는 동물.. 루시페린 또한 배경의 측정을 제공하기 전에 영상 제어 마우스에 투여 하였다. 히트 맵 스케일은 빨간색, 생물 발광의 높은 수준을 나타내는 기생충의 높은 번호로 동일시, 청색은 생물 발광의 낮은 수준 (D = 일을) 표시와 함께 표시됩니다. 제어 마우스없이 루시 페라 제 - 표현 기생충 예상대로 아무 생물 발광이 없습니다. 이미지 F 롬 버렐 - Saward 등. 8 옥스포드 대학 출판부의 허가에 의해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. (5) 혈액 얼룩에 기생충을 계산하여 정량 주변 기생충에 기술 된 바와 같이 생물 발광 및 혈액 영화 기생충의 비교 각 전체 동물의 총 생물 발광을 정량 하였다. 오차 막대는 평균값의 표준 편차를 나타낸다. 버렐 - Saward 등. 8 옥스포드 대학 출판부의 허가에 의해에서 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
그림 5 :. 4.5에 기술 된 바와 같이 절제 뇌의 전 생체 이미징은 그림 3 군데 쥐의 관류 뇌를 제거하고 몇 군데 있었다. 생물 발광이도 3 야생형 nonbioluminescent 기생충 감염 마우스로부터의 제어 뇌 같은 열지 규모 측정은 루시페린으로 처리하고 어떤 생물 발광이 관찰 될 수 없다. 스케일 바는 1cm이다. 이 그림은 옥스포드 대학 출판부의 허가에 의해 버렐 - Saward 등. 팔에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : VSL-2에 감염된 마우스에서 루시페린 생물 발광의 속도론.세 VSL-2 감염 CD1 생쥐 루시페린 150 ㎎ / ㎏ IP로 주입하고, 이미 저 내에 즉시 넣었다. 생쥐는 60 분에 걸쳐 몇 군데 있었다 및 생물 발광은 관리를 루시페린 후 최적의 영상 창을 결정하기 위해 계산되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
생물 발광의 T. 개발 비. brucei GVR35 변형 후반 단계에 이른에서 트리파노소마 감염의 시각화 할 수 있습니다. 이전 감염 모델 기생충은 뇌에있는 경우 혈액 막 현미경에서 실시간으로, 말기를 검출 할 수 없었다 및 기생 부하 (12)를 결정하기 위해 감염된 마우스에서 뇌의 컬링 및 제거가 필요했다. 하나의 마우스 감염의 전체 및 모든 단계에서 관찰 할 수 감염의 빠른 질적 평가를 통해 추적 할 수 있습니다 같이 생물 발광 간 마우스 변동성을 줄일 수 있습니다. 생물 발광 영상의 매우 민감한 방법은 낮은 수준의 감염이 현미경 9 ml의 검출 5 × 10 3 trypanosomes에 / 비교 영상을 통해 검출 적은 100 trypanosomes에 함께 혈액 영화 현미경보다 일찍 식별 할 수 있습니다. 또한, 실험 전반에 걸쳐 동일한 동물에 이어 제거큰 동물의 사용량을 줄이는 각 시점에 대한 별도의 동물 집단에 대한 필요성이야.
여기에서 설명한 촬상 프로토콜은 비 침습적 자연 추가적인 더 자주 촬상이 (적절한 동물 윤리 승인) 수행 될 수 있다는 의미로서 과학적 필요에 맞게 적합하지만, 뇌 감염 D21의 평가를위한 가장 이른 시간 인 수 포인트. 이 시점에서, 초기 단계 약물은 더 이상 후기 기생충을 청소에 효과적 없습니다. 생쥐, 각 시점에서 동일한 조건으로 촬상되는 것이 필수적이다. 예를 들어, 동일한 노출 시간 및 (복부 또는 지느러미) 동일한 도면 감염 과정의 정확한 측정을 보장하기 위해 사용되어야한다.
(이 모델은 감염을 가져야한다고 알고있을 때)에는 촬상 신호를하지 존재하는 동안 경우 문제의 원인을 결정하기 위해 따라야 할 절차들이있다. 먼저, 노출 시간이 증가 될 수있다매우 낮은 생물 발광 신호를 검출 할 수 있어야 5 분에서 최대. 신호가 여전히 감지되고 혈액 필름 기생충 양성되지 않으면 다음 단계는 기생충 여전히 생물 발광 여부를 확인하는 것이다. 이것은 상업적인 관내 루시페라아제 활성 분석을 사용하여 생물 발광이 조도계를 사용하여 검출 될 의해 수행 될 수있다. 이 시점에서 기생 생물 발광 더 이상이면, 기생의 구조의 안정성이 해결해야 없을 것이다.
방출되는 생물 발광이 어두운 모피 피부 6,9 감쇠 같이 마우스의 컬러 촬상의 감도에 차이를 만든다. 백색 마우스 또는 누드 마우스로 마우스 균주의 선택은, 그러므로 결과를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 색 제한되는 경우 트랜스 제닉 라인을 이용하여, 예를 들어 다음 또는 면도 크게 6 감도를 향상시킬 수 관심 영역에 마우스 제모.
드에도 불구하고 향상된 감도와는 (그림 4 일 7-21)를 생물 발광 직접 혈액 영화에서 관찰 된 주변 기생충에 상관하지 않고, 그 생물 발광 모델이 생성 신호. 문헌, 트리파노소마의 초기 감염은 hemolymphatic 시스템 (1)을 감염시키는 것으로 설명하고 있으며, 단독으로 혈관계에 한정되지 않고, 주연 기생충 혈액 막에서 거의 검출 될 때, 말초 장기의 감염과 함께, 그 이유를 설명 할 수있다 그림 3과 4에서 7 일의 데이터에서 특히 명백한 바와 같이 생물 발광 볼 수 있습니다. 그러나, 이는 생물 발광 영상 만 감염의 정량적 측정으로 사용될 수 있으며, 상기 분석은 절대 기생 부하를 결정할 필요하다는 의미한다.
생물 발광 이미징 MO 어려운 다른 감염성 병원체에 사용되는 능력을 갖는다nitor은, 샤 가스 병, 말라리아, 톡소 플라즈마 증의 설치류 모델 이미 13-16을 설립했다. 생물 발광의 높은 신호 대 잡음비는 유용한 도구에있어 더욱 민감 비 침습적 약 평가를 제공 할뿐만 아니라, CNS 감염 역학의 이해를 얻을 수있는 실시간 감염을 추적 할 수있는 능력과 결합 전염병 연구.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 T.를 제공하는 존 켈리 마틴 테일러 (위생 및 열대 의학의 런던 학교) 감사합니다 비. brucei GVR35-VSL-2 및 생체 내 이미징에 대한 조언 박사 안드레아 Zelmer (LSHTM). 이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 글로벌 건강 프로그램 (허가 번호 OPPGH5337)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Sigma, UK | P4417 | tablets pH 7.4 |
| Glucose | Sigma, UK | G8270 | 99.5% (molecular) grade |
| Ammonium chloride | Sigma, UK | A9434 | 99.5% (molecular) grade |
| Heparin (lithium salt) | Sigma, UK | H0878 | |
| Hi-FCS | Gibco, Life Technologies, UK | 10500-064 | 500 ml |
| DPBS | Sigma, UK | D4031 | Sterile filtered |
| Mr. Frosty | Nalgene, UK | ||
| Giemsa | Sigma, UK | G5637 | |
| D-Luciferin | Perkin Elmer, UK | ||
| Sigma, UK | 115144-35-9 | ||
| Diminazene aceturate | Sigma, UK | D7770 | Analytical grade |
| IVIS Lumina II | Perkin Elmer, UK | other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak | |
| Living Image v. 4.2 | Perkin Elmer, UK | proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own | |
| 1 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10142104 | |
| 20 ml Syringe | Fisher Scientific, UK | 10743785 | |
| 25 G Needles | Greiner Bio-one | N2516 | |
| 21 G Needles | Greiner Bio-one | N2138 | |
| Twin-frosted microscope slide | VWR, UK | 631-0117 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tube | StarLab, UK | I1415-1000 | |
| 7 ml Bijou tube | StarLab, UK | E1412-0710 | |
| Mouse restrainer | Sigma, UK | Z756903 | our restrainer was made in-house, this is a similar model |
References
- Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
- Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
- Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).
- Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).
- Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).
- Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).
- Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).
- McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571 (2013).
- Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).
- Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
- Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).
- Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).
- Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).
