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Immunology and Infection

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

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Ethik
Alle Arbeiten wurden im Rahmen der Genehmigung der britischen Home Office Tiere durchgeführt (Scientific Procedures) Act 1986 und der London School of Hygiene & Tropical Medicine Tierschutz und Ethik Review Board. ANKOMMEN Leitlinie werden in diesem Bericht folgt.

1. In - vivo - Passage von Biolumineszenz Trypanosoma brucei brucei

  1. Entfernen eines kryokonservierten Lager (genannt Stabilat) von T. b. brucei Stamm GVR35-VSL-2 (erhältlich von Professor John Kelly an der London School of Hygiene & Tropical Medicine durch MTA) 9 aus flüssigem Stickstoff und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Verdünnte Stabilat bis 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in steriler Phosphat - gepufferter Glukosesalzlösung (PBS-G) pH 8,0 (1 l PBS + 15 g Glucose) 10.
    Anmerkung: T. b. brucei GVR35-VSL-2 ist nicht infektiös für den Menschen und erfordert SAPO Einrichtungen lizenziert Experimente durchzuführen.
  2. inject 20-25 g weiblichen CD1-Maus mit 0,2 ml Trypanosomen über die intraperitoneale Injektion (ip) mit einer 25 G-Nadel verdünnt. Dies ist der "Spendermaus". Legen Sie die infizierte Maus in eine spezifische pathogenfreie (SPF) -cage und Futter ad libitum.
    Hinweis: CD1 - Mäuse sind ein Auszucht Stamm und T. b. brucei GVR35 - Infektionen sind in diesem Stamm gut charakterisiert. Jedoch ist dieses Protokoll auch für angeboren oder genetisch veränderte Stämme, aber es ist wichtig , dass die Fellfarbe zu beachten , kann auf die Empfindlichkeit der Bildgebung 6,9 auswirken.
  3. Überwachen peripheren Parasitämie durch Blutentnahme. Platzieren Sie die Maus in eine Plastik Verzögerer und nehmen 5 ul Blut aus dem Schwanz von venepuncture mit 21 G-Nadel oder Aderlässe und mischen 1/10 mit 0,85% sterilem Ammoniumchlorid roten Blutkörperchen zu lysieren und einfacher Zählung ermöglichen.
  4. Zählen Sie die verdünntes Blut in einer Neubauer-Zählkammer.
    1. Legen Sie das verdünnte Blut in beiden Kammern. Zählen Sie die gesamte zentrale grID von einer Kammer zu geben n Trypanosomen. Konzentration von Trypanosomen in Blut = n x 10 4 Trypanosomen / ml, für jede Verdünnungsfaktor einzustellen und die Mittel der beiden Kammern berechnen.
      Hinweis: Nach ca. 5-7 Tage nach der Infektion sollte peripheren Parasitämie steigen ausreichend um eine Infektion bei einer Konzentration von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml durchzuführen.
  5. Wenn Trypanosomen ist hoch genug für die Anzahl der Mäuse erforderlich, bewegen sich auf 1,6 zu treten. Ein Parasitämie Niveau von 6 x 10 4 Trypanosomen / ml in einer Spendermaus ist für die Infektion von 10 Mäusen ausreichend.
    Hinweis: Für die statistisch signifikante Gruppengrößen, n = 6 für jede Behandlungsgruppe von Mäusen werden 8 benötigt. Für andere Modelle der Infektion, müssten Leistungsberechnungen angewandt werden, um geeignete Gruppengrößen zu bestimmen.
  6. Ort Mäuse in einem Wärmefeld (bei 28-30 ° C für etwa 5-10 min) die Schwanzvenen zu erlauben, zu dilatieren.Zur Auslösung einer Klemme Narkose verabreichen 20 mg / kg Pentobarbital iv mit einer 25 G-Nadel. Bestätigen Sie die Maus wird durch sanftes Drücken der Fußballen narkotisiert, um sicherzustellen, gibt es keine Rückzugsreflex ist.
  7. Heparinisierung eine 21 G Nadel durch Aliquotieren 5 ml Heparin bei 5000 USP-Einheiten / ml in einem Bijou Rohr und Saugen zweimal in die und aus der Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt.
  8. Nehmen Sie die heparinisierte 21 G Nadel und 1-ml-Spritze und führen Herzpunktur auf der narkotisierten Passage Maus durch die Nadel mittig unter dem Brustkorb eingefügt (eine Perle von Blut wird in der Basis des Nadel Pool) und ziehen Sie vorsichtig zurück auf den Kolben um nicht die Kammer des Herzens zu kollabieren. Sammeln Sie ein Minimum von 0,7 ml Blut.
  9. Verdünnte infiziertem Blut ein Inokulum von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als Schritt 1.1 oben zu erzeugen.
    Hinweis: An dieser Stelle kann das restliche Blut kryokonserviert werden Stabilat herzustellen, indem man mit 8% Glycerin mischen, 20% hitzeinaktiviertem fötalen calf Serum (hallo-FCS) und 72% infiziertem Blut. Langsam bei -80 ° C einfrieren ein langsam einfrieren Behälter mit einer Kühlrate von 1 ° C / min zu erreichen, bevor sie mit flüssigem Stickstoff übertragen.

2. Infektion von Versuchsmäusen

  1. Platzieren CD1 weibliche Mäuse (~ 21-25 g) in einen Heizkasten sanft warmen Venen zu dilatieren. Legen Sie die erwärmte Mäuse in eine Plastikstütze und injizieren 0,2 ml verdünnte Inokulum intravenös mit einer 25 G-Nadel in die Schwanzvene, das entspricht 4000 Trypanosomen pro Maus. Platzieren Druck an der Injektionsstelle danach die Blutung einzudämmen.
    Hinweis: Die intraperitoneale Infektion eine gültige Route der Infektion und wurde in früheren Studien verwendet worden , 10, aber wir haben festgestellt , diese weniger reproduzierbar als intravenöser Applikation.
  2. Randomize infizierten Mäusen und Käfig in Gruppen von 3 in SPF-belüftete Käfige. Als Kontrolle injizieren CD1 weibliche Mäuse mit Wildtyp nicht Biolumineszenz - Parasiten, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Überwachen Sie die Infektion durch Blut Film Mikroskopie
    1. Spot 5 ul Blut aus venepuncture oder Aderlässe auf einen Glasträger und führen Sie einen Blutabstrich (mit einem zweiten Glasträger vorsichtig die Tropfen Blut schieben über die Rutsche einen dünnen Film zu erzeugen). Lassen Sie Folien an der Luft trocknen.
    2. Befestigen Sie den Blutabstrich mit 100% Methanol und Fleck mit Giemsa für 10 Minuten , bevor sie mit dH 2 O gespült und an der Luft trocknen lassen . Unter 100X Ziel zählen die Anzahl der Trypanosomen in 10 Bereichen (FOV).
      Hinweis: Blutdreharbeiten wird neben ganzen Tier nicht-invasive Bildgebung bereits einen Tag nach der Infektion durchgeführt. Wenn eine Anzahl von Tieren Verarbeitung dieses Verfahren der Trypanosomen Quantifizierung über Hämozytometer Zählen bevorzugt, da die Proben können später bei Raumtemperatur und gezählt gespeichert werden.

3. Biolumineszenz Imaging-Infektion zu verfolgen

Hinweis: Um die Infektion zu überwachen, ganze animal nichtinvasive Bildgebung verwendet werden.

  1. Vorbereitung einer Stammlösung von D-Luciferin, das Glühwürmchen-Luciferase-Substrat, in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 30 mg / ml. Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 ° C einfrieren.
    Hinweis: D-Luciferin Licht empfindlich ist, daher schützen sie vor Licht von Aliquoten in Folie gewickelt wird. Nicht wiederholt Frost-Tau - Luciferin , wie es 11 - Aktivität beeinflussen können.
  2. Wärmen eines Aliquots von D-Luciferin auf Raumtemperatur. Entfernen Sie jede Maus aus dem Käfig (einschließlich Kontrollmäuse infiziert mit nonbioluminescent Stamm Wildtyp-Parasiten) und injizieren 150 mg / kg des erwärmten D-Luciferin (verdünnt in DPBS) intraperitoneal mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Mäuse in eine Isofluran Kammer für ca. 5 min zu induzieren Anästhesie mit 2% Isofluran / O 2 Mix bei 2,5 l / min.
    Hinweis: Die Mäuse werden unbeweglich, wenn sie unter Narkose sind. Für den Bildaufnehmer hier verwendet, 3 Mäuse können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn Mäuse sind anesthetized länger als 30 min, können ophthalmische künstliche Tränen Salbe angewendet werden, um die Augen der Mäuse verhindert das Austrocknen.
  3. Verwendung der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den Imager hier beschrieben, die Software öffnen und die Maschine zu initialisieren. Erwerben Sie Bilder einmal Kamera und beheizte Plattentemperatur erreicht haben.
    Hinweis: Dieses Gerät nicht in der Regel ausgeschaltet ist, so dass die Maschine über Nacht Hintergrund Kalibrierungen durchzuführen. Für den Fall, dass es neu gestartet werden muss, es muss eine Überprüfung der Kalibrierung laufen zuerst.
  4. Legen Sie die narkotisierten Mäusen in den Imager (siehe 3.5). Verwenden Sie große schwarze Trennzeichen zwischen den Mäusen zu minimieren bluten durch jedes helle Biolumineszenz-Signal. Bild Mäuse eine Reihe von Belichtungszeiten; 1, 3, 10, 30, 60 und 180 Sekunden, mit mittlerer Binning, 1 f / stop und einem offenen Filter und Sichtfeld E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Hinweis: Die Kontrollmäuse infiziert mit den Wildtyp-nonbioluminescent GVR35 Parasiten bieten eine background Biolumineszenz Wert. Aus einem Luciferin Kinetik Experiment (Abbildung 6) mit diesem Modell haben wir die Biolumineszenz Signalspitzen bei 10 Minuten nach der Verabreichung und Imaging dauert ca. 5 min für 3 Mäuse gefunden. Nehmen Sie diesen Zeitplan in Betracht, wenn anesthetizing und Abbilden der Mäuse.
  5. Um sicherzustellen, gründliche Abbildung der Mäuse, drehen einen ventralen, dorsalen und Seitenansicht zu erhalten. Pflegen Sie die Konsistenz in der Reihenfolge der Orientierung für die Bildgebung zwischen aufeinanderfolgenden Tieren.
  6. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose unter Beobachtung zu erholen, bevor zu SPF-Käfig zurück.
  7. Weiter Mäuse Bildgebung alle 7 Tage bis zum Tag 21 nach der Infektion. Es sollte eine stetige Zunahme der Biolumineszenz-Signal über das gesamte Tier sein.
  8. Bei D21, Bild und Blut Film die Mäuse wie oben beschrieben, und der Dosis-Mäuse mit 40 mg / kg Diminazen aceturat intraperitoneal. Dieses Medikament wird die periphere Parasitämie klar, aber das Blut-brai nicht überquerenn-Schranke und ermöglicht somit eine bessere Visualisierung der ZNS-Infektion.
    Hinweis: Diminazen aceturat ist ein gut etabliertes Medikament zur Frühstadium nagana behandeln.
  9. Weiter Bildgebung und Überwachung bei D28 und D35.

4. Bestätigen ZNS-Infektion

  1. Bei D35, Bild Mäuse wie oben beschrieben (Schritte 3,1-3,4).
  2. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose und exsanguinate Mäuse in so detailliert Schritt 1,6-1,8, das Sammeln zur weiteren Analyse Blut zu erholen.
  3. Nach Herzpunktur, perfuse Mäuse, die mit 20 ml PBS (optional: add 3 mg / ml Luciferin zu Perfusionslösung) über das Herz das Blut aus den Organen zu löschen und Luciferin Etikett wieder einführen, die aus der Region des Gehirns über das Zeitintervall gelöscht haben könnte aus Schritt 4.1.
  4. Vorsichtig in das Gehirn zu entfernen, die durch gekrümmte Schere, die um den Umfang des Schädels von der Basisschneiden und das Oberteil des Schädels Abhebens, das Gehirn zu ermöglichen,sanft herausgehoben mit einer gebogenen Pinzette werden.
  5. Legen Sie das ausgeschnittene Gehirn auf einen Abschnitt aus schwarzem Kunststoff und Pipette 50 ul 15 mg / ml Luciferin über das Organ vor der Bildgebung, um sicherzustellen, ausreichende Luciferin hat ausgeschnittenen Gehirn hinzugefügt. Bild die Einstellungen wie oben. Dies wird die Lokalisierung der Infektion zu den Gehirnhälften demonstrieren.
    Hinweis: Downstream Quantifizierung von Parasitämie am exzidiert Gehirn kann durch qPCR , durchgeführt werden , wie zuvor 8 beschrieben. Andere alternative Downstream-Anwendungen könnte Histologie oder Immunhistochemie umfassen Parasiten im Hirngewebe folgenden Fixierung zu identifizieren.

5. Die Quantifizierung der Biolumineszenz-Bildgebung

Hinweis: Die Biolumineszenz quantifiziert werden können, die Region von Interesse (ROI) mit der Bildverarbeitungssoftware und für die Hintergrund Biolumineszenz korrigiert.

  1. den ROI-Tool verwenden, erstellen Sie einen rechteckigen ROI für ganze Tier Quantifizierung einnd positionieren sie über die Maus Bild der Nasenspitze zur Basis des Schwanzes der Maus zu decken. Verwenden Sie die gleiche Größe Box für jedes Tier und jeden Zeitpunkt. Bei der Betrachtung der ROI für das Gehirn suchen, verwenden Sie einen kreisförmigen ROI in der gleichen Art und Weise, sie über die Maus Kopfbereich in die Bildposition.
  2. Falls gewünscht, einstellen Bilder auf dem gleichen Spektrum für eine visuelle Darstellung der Infektion zu erscheinen.
    Hinweis: Die Software, die hier erzeugt eine Farbkarte für jedes Bild automatisch angepasst für minimale und maximale Photonenzählungen. Um einen visuellen Vergleich zwischen einer Reihe von Bildern zu ermöglichen, die Farbskala muss für alle Bilder auf die gleichen Werte eingestellt werden.
    1. Mit dem Bild mit der höchsten Biolumineszenz und der "Bild anpassen" Registerkarte auf der Werkzeugpalette, wählen Sie eine logarithmische Skala und eine entsprechende Farbskala Minimum und Maximum (empirisch ermittelt werden). Wenden Sie diese Skala auf alle Bilder während des gesamten Experiments.

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Representative Results

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Dieses Protokoll zeigt , wie Krankheitsprogression nach einer Infektion von Mäusen mit T. folgen b. brucei, ein Modell für die afrikanische Trypanosomiasis. 1 , die die Zeitleiste des Versuchsprotokoll zeigt, den Zeitplan für die Behandlung und Imaging - Schritte zeigt, Fig . 2 eine typische Sichtfeld in einer festen Giemsa-gefärbten Blutausstrich zeigt , verwendet periphere Parasitämie quantitativ zu bestimmen, mit Trypanosomen und roten Blutkörperchen vorhanden. Entwicklung der Infektion bei Tieren kann durch Messung der Biolumineszenz , wie in Abbildung 3, die die infizierten Tieren im Verlauf eines Experiments zu jedem Zeitpunkt abgebildet mit den gleichen Tieren zeigt , folgen. Durch den Verlauf der Infektion kann eine Erhöhung der Biolumineszenz in allen Tieren in den ersten 21 Tagen beobachtet werden, da das Signal mehr verbreitet und intensiv, mit hohen Regionen BLI wird (als rot dargestelltvon der Hitze Kartenmaßstab) in der Milz-Bereich. Bei D21 - Mäuse werden mit Diminazen aceturat behandelt , wie in Abbildung 1, post-Bildgebungs detailliert, und ein Abfall der Biolumineszenz kann bei D28 beobachtet werden , wie die periphere Infektion gelöscht ist, mit geringen Mengen an Signal im Kopfbereich der Mäuse vorhanden ist. Bei D35 bleibt das Signal immer noch im Kopfbereich und hat sich intensiver geworden eine mögliche Infektion des Gehirns anzeigt. Das Gehirn wird ausgeschnitten, um zu bestätigen Signal innerhalb des Hirngewebes vorhanden ist, und kann dann durch qPCR quantifiziert werden.

Traditionell werden Blutausstrichen verwendet Infektion Progression und Therapieeffekte zu quantifizieren. Diese jedoch nur periphere Parasitämie messen und nicht verwendet werden kann Parasiten Spiegel im Gehirn zu untersuchen. Abbildung 4 Quantifizierung von Kinetiken sowohl dem peripheren Parasitämie und Biolumineszenz zu zeigen Krankheit verbindet. Bei D7 ein hohes BLI - Signal vorhanden ist , von 10 8 Abbildung 3 zu sehen . Dies zeigt die höhere Empfindlichkeit des Biolumineszenz-Ansatz über das Zählen der traditionellen Blut Film.

Um sicherzustellen, dass der Biolumineszenz im Kopfbereich auf Hirngewebe wirklich lokalisierende, am Ende des Experiments wurden die Gehirne entnommen und biolumineszenz gemessen ex vivo (Abbildung 5). Ein Unterschied in der Infektionsbelastung zwischen Gehirn ist oft gesehen, und das Signal wird nicht an bestimmte anatomische Regionen als Verteilung der intensiven BLI-Signal zu lokalisieren kann zwischen infizierten Tieren unterscheiden. Zum Beispiel ist stark BLI-Signal in den Riechkolben in Maus 2 und 3 und im Cerebellum in Maus 3, während das Gehirn von Maus 1 zeigt allgemeine Verteilung von BLI-Signal in allen Gehirn. Da das Gehirn unmittelbar nachdem die Mäuse abgebildet werden kann Culling, kann die weitere Analyse auf Hirngewebe durchgeführt werden , wenn das Gewebe in der ex - vivo - Bildgebungsprozess nicht beschädigt wird.

Abbildung 1
Abb . 1: Timeline von Experiment einschließlich Imaging, Probenahme und Behandlung Durch die nicht-invasive Natur der Biolumineszenz - Bildgebung kann die Überwachung der Infektion auftreten mowieder als oft in dem Diagramm detailliert. Die Abtast- und Abbildungs ​​alle 7 Tage ermöglichen die Identifizierung der fortschreitenden Infektion. Die Behandlung bei D21 mit Diminazen aceturat entfernt peripheren Parasitämie eine bessere Visualisierung des Kopfes und Gehirninfektion zu ermöglichen. Diminazen aceturat ist ein frühes Stadium Droge und ist nicht in der Lage , die Blut-Hirn - Schranke in Mengen passieren ausreichend , um die späten Stadium der Infektion zu löschen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2:. Giemsa Stained Trypanosomen auf einem festen Blutausstrich, Giemsa gefärbt Trypanosomen (lila mit rosa Kerne, Pfeil geschlossen) sind leicht erkennbar an den roten Blutkörperchen (blau gefärbt, offener Pfeil) und schnell die Anzahl der gezählten werden kann zu erhalten Trypanosomen / 10Sichtfelder unter einem 100X Ziel. Der Maßstab bezeichnet 10 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Biolumineszenz - Bildgebung infizierter Mäuse Drei repräsentative Tiere einer Gruppe von 6 Mäusen mit VSL-2 infiziert (M = Maus) und einem Wildtyp - infizierten Kontroll (mit dem Wildtyp nonbioluminescent Parasit Linie infiziert).. Luciferin wurde auch vor der Bildgebung mit dem Steuer Maus verabreicht, die die Hintergrundmessung zur Verfügung stellt. Ein Wärmekartenmaßstab wird gezeigt mit roten hohen Biolumineszenz anzeigt, das entspricht eine hohe Zahl von Parasiten und blau anzeigt, geringe Mengen an Biolumineszenz (D = Tag). Die Kontroll-Maus hat keine Biolumineszenz als ohne Luciferase-exprimierenden Parasiten erwartet. Bild f rom Burrell-Saward et al. 8 mit Genehmigung von Oxford University Press. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung . 4: Vergleich von Biolumineszenz und Blut Film Parasitämie Gesamt Biolumineszenz für jedes ganze Tier wurde quantifiziert , wie in Abschnitt 5 und periphere Parasitämie durch Zählen Parasiten in Blutabstrichen quantitativ beschrieben. Die Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung vom Mittelwert. Bild von Burrell-Saward et al. 8 mit Genehmigung von Oxford University Press. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb . 5: Ex Vivo Imaging of exzidiert Gehirn perfundierten Gehirnen der Mäuse abgebildet in Figur 3 wurden entfernt und bebildert , wie in 4.5 beschrieben. Biolumineszenz ist auf einer Heatmap-Skala gemessen, wie für Abbildung 3. Die Steuerung Gehirn einer Maus, die mit Wildtyp nonbioluminescent Parasiten infiziert wurde auch mit Luciferin behandelt und keine Biolumineszenz beobachtet werden können. Der Maßstab ist mit 1 cm. Diese Zahl wurde von Burrell-Saward et al modifiziert. 8 mit Genehmigung von Oxford University Press. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Kinetik der Luciferin Biolumineszenz in VSL-2-infizierten Mäuse.Drei VSL-2-infizierten CD1-Mäuse wurden mit 150 mg / kg ip von Luciferin injiziert, und unmittelbar innerhalb der Abbildungsvorrichtung angeordnet. Die Mäuse wurden über 60 min bebildert und ihre Biolumineszenz wurde nach Luciferin Verwaltung die optimale Abbildungsfenster zu bestimmen , berechnet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die Entwicklung eines biolumineszenten T. b. brucei GVR35 Stamm ermöglicht die Visualisierung eines Trypanosomeninfektion von den frühen bis späten Stadium. Zurück Infektionsmodellen konnten die späten Stadium zu erkennen, wenn Parasiten im Gehirn, in Echtzeit aus dem Blut Film Mikroskopie sind und erforderlich , um die Keulung und Beseitigung von Gehirnen von der infizierten Mäuse Parasitenlast 12 zu bestimmen. Die Biolumineszenz reduziert inter Maus Variabilität als eine einzige Maus kann über die Gesamtheit der Infektion und eine schnelle qualitative Bewertung der Infektion verfolgt werden kann in jedem Stadium beobachtet werden. Die hochempfindliche Methode von Biolumineszenz - Bildgebung ermöglicht Low-Level - Infektion als Mikroskopie Blutfilm früher identifiziert werden, mit so wenig wie 100 Trypanosomen nachweisbar durch Abbildungs ​​im Vergleich zu den 5 x 10 3 Trypanosomen / ml nachweisbar durch Mikroskopie 9. Darüber hinaus nach den gleichen Tieren während des Experiments zu beseitigens die Notwendigkeit für separate Tiergruppen für jeden Zeitpunkt, Tiernutzung stark reduziert.

Das Abbildungsprotokoll hier beschriebenen kann die wissenschaftliche Notwendigkeit als die nicht-invasive Natur Mittel angepasst werden, dass zusätzliche und häufigere Bildgebung durchgeführt werden kann (mit Genehmigung geeigneten Tierethik), aber für die Beurteilung der D21 Gehirninfektion ist der früheste Zeitpunkt, Punkt. Zu diesem Zeitpunkt sind frühzeitig Medikamente nicht mehr wirksam bei der späten Phase Parasiten zu löschen. Es ist auch wichtig, dass die Mäuse unter den gleichen Bedingungen zu jedem Zeitpunkt abgebildet werden. Zum Beispiel sollten die gleichen Belichtungszeiten und derselben Ansicht (ventral oder dorsal) verwendet werden, um eine genaue Messung der Infektionsverlauf zu gewährleisten.

Wenn während der Bilderzeugung kein Signal vorhanden ist (wenn bekannt ist, dass das Modell eine Infektion haben soll), gibt es eine Reihe von Schritten, die ausgeführt werden kann, die Quelle des Problems zu bestimmen. Zum einen kann die Belichtungszeit erhöht werden,auf ein Maximum von 5 min, die sehr niedrige Biolumineszenz-Signal zu erfassen der Lage sein sollte. Wenn Signal noch nicht erfaßt wird und Blutfilme sind positiv für Parasiten, wäre der nächste Schritt, zu bestätigen, ob der Parasit noch biolumineszierenden ist. Dies kann durchgeführt werden unter Verwendung eines kommerziellen in vitro Luciferase - Aktivitätstest und Biolumineszenz würde detektierenden unter Verwendung eines Luminometers durchgeführt. Wenn an diesem Punkt der Parasit nicht mehr biolumineszierenden ist, müsste die Stabilität des Konstrukts in der Parasiten behandelt werden.

Die Farbe der Mäuse macht einen Unterschied in der Empfindlichkeit der Bildgebung wie die emittierte Biolumineszenz durch dunkle Fell und Haut 6,9 gedämpft wird. Wahl der Mausstamm, wie weiße Mäuse oder Nacktmäusen, kann daher Ergebnisse zu verbessern. Wenn Maus Farbe beschränkt ist, zum Beispiel durch die Verwendung einer transgenen Linie, dann rasieren oder enthaaren die Mäuse in einer Region von Interesse stark 6 Empfindlichkeit zu verbessern.

DeTrotz der verbesserten Empfindlichkeit und das Signal , daß biolumineszente Modell erzeugt, wird das Biolumineszenz nicht direkt mit dem peripheren Parasitämie in Blutausstriche (Tage 7-21 in 4 gezeigt) beobachtet korrelieren. Literatur dokumentiert , dass die frühen Stadium der Infektion von Trypanosomiasis infiziert die hemolymphatic System 1, und ist nicht nur auf das Blutsystem beschränkt , und dies, zusammen mit der Infektion von peripheren Organen, mag erklären , warum , wenn periphere Parasitämie kaum nachweisbar in den Blutausstriche ist, Biolumineszenz ist sichtbar , wie besonders deutlich aus den Daten für Tag 7 in Figur 3 und 4. Dies ist jedoch nicht bedeuten, dass Biolumineszenz-Bildgebung kann nur als eine qualitative Messung der Infektion verwendet werden, und weitere Analysen erforderlich absolute Parasitenlast zu bestimmen.

Biolumineszenz-Bildgebung hat die Fähigkeit, mit anderen infektiösen Pathogenen verwendet werden, die mo schwerNitor, mit Nagetiermodellen der Chagas - Krankheit, Malaria und Toxoplasmose bereits 13-16 etabliert. Das hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis von Biolumineszenz gekoppelt mit seiner Fähigkeit, Echtzeit-Infektionen zu verfolgen eine empfindlichere, nicht-invasive Arzneimittelbewertung zur Verfügung stellen kann, sowie ein besseres Verständnis von ZNS-Infektion Kinetik, es zu einem wertvollen Werkzeug machen in Infektionsforschung.

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Acknowledgments

Wir danken John Kelly und Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) für T. Bereitstellung b. brucei GVR35-VSL-2 und Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) für die Beratung über in - vivo - Bildgebung. Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation Global Health Program (Grantnummer OPPGH5337) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

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References

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Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis
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Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

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