Summary
Her præsenterer vi en protokol til at syntetisere viruslignende partikler ved hjælp af enten baculovirus eller pattedyrekspressionssystemer og ultracentrifugering rensning. Denne meget tilpasselig tilgang bruges til at identificere virale antigener som vaccine mål på en sikker og fleksibel måde.
Abstract
Virus-lignende partikler (VLP'er) og subvirale partikler (SVPs) er en alternativ tilgang til viral vaccine design, der giver fordelene ved øget biosikkerhed og stabilitet i forhold anvendelse af levende patogener. Ikke-infektiøse og selv-samling, der VLP bruges til at præsentere strukturelle proteiner som immunogener, uden om behovet for levende patogener eller rekombinante virale vektorer til antigen levering. I denne artikel viser vi de forskellige stadier af VLP design og udvikling til fremtidige applikationer i præklinisk dyreforsøg. Proceduren omfatter følgende faser: udvælgelse af antigen, ekspressionen af antigen i cellelinje af valg, rensning af VLP / SVPs, og kvantificering for antigen dosering. Vi demonstrerer anvendelse af både pattedyr- og insektcellelinier til ekspression af vores antigener og vise, hvordan metoder adskiller sig i udbytte. Metoden præsenteres kan gælde for en række patogener og kan opnås ved at erstatte de antigener med immunogen structural proteiner af brugerens mikroorganisme af interesse. VLP'er og SVPs hjælpe med antigen karakterisering og udvælgelse af de bedste vaccinekandidater.
Introduction
Viruslignende partikler (VLP'er) er en godkendt teknologi til vaccination af mennesker. Faktisk er nogle af de mere contemporarily licenserede vacciner, herunder det humane papillomavirus (HPV) og hepatitis Β (HepΒ) vacciner anvender denne fremgangsmåde. VLP'er er dannet af strukturelle proteiner stand til selv-samling. De samlede partikler efterligne virale morfologier, men kan ikke inficere eller replikere fordi de mangler virale genomer. VLP'er kan udtrykkes og oprenses fra en række prokaryote og eukaryote systemer. En gennemgang af litteraturen viste, at forskellige ekspressionssystemer er ansat på følgende satser: bakterier - 28%, gær - 20%, plante - 9%, insekt - 28%, og pattedyr - 15% 1. Af note, er HPV-vacciner baseret på L1-capsidprotein produceret i gær (Gardasil) eller i en insektcelle-system (Cervarix) 2. HepΒ vacciner, Recombivax og Engerix-Β, fremstilles også i gær, og er sammensat af HepΒ overfladeantigen 34.
Vi anvender pattedyr og insekter-ekspressionssystemer til frembringelse af VLP'er der kræver co-ekspression af multiple strukturelle proteiner til samling. Vores arbejde fokuserer på at designe, producere, og rensningsprocesser VLP-baserede vacciner mod humane patogener: influenzavirus, respiratorisk syncytialvirus (RSV), dengue virus (DENV), og chikungunya virus (CHIKV). Vores metoder er fleksible nok til at muliggøre co-ekspression af de multiple strukturelle proteiner fra flere ekspressionsplasmider, eller et enkelt ekspressionsplasmid (figur 1). Vi har tidligere fremstillet og oprenset H5N1 VLP'er samlet af co-ekspression af plasmider, der koder influenza hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og matrix (M1) i humane embryonale nyre 293T-celler 5,6. Generne blev kodon-optimeret til ekspression i mammale celler og klonet ind pTR600, en eukaryot ekspressionsvektor indeholdende cytomegalovirus immediate-early-promotor plus intron A til initiering transcription af eukaryote indsatser og bovint væksthormon polyadenyleringssignalet for terminering af transskription 7. En lignende fremgangsmåde under anvendelse af tre-plasmid co-ekspression af HA, NA (figur 1A) og et alternativt viral matrix protein, HIV Gag p55, blev anvendt til generering af sæsoninfluenza subtype human H3N2 VLP'er i denne undersøgelse og er blevet vist at frembringe VLP'er af lignende størrelse som influenza partikler 8. Selvom influenzavacciner overvejende fremkalder anti-HA-antistoffer, tilsætning af influenza-neuraminidase medierer sialidase aktivitet at aktivere VLP spirende fra transficerede celler 9 og også præsentere yderligere immunogene mål. For at producere RSV VLP'er, vi valgte også den uafhængige kerne af HIV Gag at designe prototypiske vacciner, der præsenterer udelukkende RSV overfladeglycoproteiner for yderligere at vise fleksibilitet VLP-dannelse ved hjælp af HIV Gag, som tidligere beskrevet og karakteriseret ved elektronmikroskopi 6,10. Andrehar tidligere vist, at VLP'er præsenterer RSV-glycoproteiner kan samles ved anvendelse af forskellige virale komponenter fra Newcastle Disease-virus (NDV) 11, og influenza-matrix 12. Fuld længde overfladeglycoprotein sekvenser blev brugt i dette studie at fastholde native konformationer, som kan være nødvendige for funktionel receptorbinding og antistofgenkendelse assay gennem enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA).
Vores eksempler på brug af enkelte plasmid ekspressionssystemer til at generere partikler er DENV og CHIKV. I tilfælde af DENV, kan vi producere subvirale partikler (SVPs) uden capsid i 293T-celler fra et enkelt plasmid indeholdende et PRM / E strukturelle gen ekspressionskassetten 13. Udtrykket SVP anvendes til at betegne den manglende en kerne eller capsidprotein ved samling af virale strukturelle proteiner. Chik VLP'er kan også fremstilles under anvendelse af et enkelt plasmid indeholdende nogle CHIKV strukturelle gen kassette, der koder for capsid og kappeproteiner, eller i insect celler ved infektion med et rekombinant baculovirus der koder for det samme strukturelle gen kassette optimeret til insektcelleekspression (figur 1B - C).
Slutresultatet af udtrykket tilgange beskrevet ovenfor er frigivelsen af VLP'er i celledyrkningsmedium, som derefter kan oprenses via ultracentrifugering gennem en 20% glycerolpude. I denne rapport præsenterer vi metoder til at udtrykke og rense disse VLP'er fra pattedyr og insektcellesystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. pattedyrsekspression System for Generation of Influenza H3N2 VLP
- Subklon viral strukturelle glycoproteiner hæmagglutinin (HA), neuraminidase (NA) og humant immundefektvirus (HIV) Gag p55 i eukaryote ekspressionsvektorer, såsom tidligere beskrevne pTR600. 7
- Amplificere DNA i kemisk kompetente Escherichia coli (fx DH5a) og isolere transfektion-grade plasmid under anvendelse af et plasmid-oprensningskit ifølge producentens instruktioner. Mængden af DNA er afhængig af udbytte og brugerens behov.
- Oprethold mammal cellelinie, 293T, i vækstmedier indeholdende 10% føtalt bovint serum-(FBS) ved 37 ° C med 5% CO2 i en fugtig inkubator.
- Grow celler, således at en T-150 vævskulturkolbe indeholder 45-75 x 10 6 celler pr kolbe, således at kolben opnår fuldstændig celleadhærens og 85-95% cellekonfluens ved følgende dag. Undersøg celler under mikroskop for ønskede conflutighed.
Bemærk: Høj celledensitet anbefales typisk til opnåelse optimal proteinekspression med minimal cytotoksicitet ved brug kommercielle transfektionsreagenser dog over-sammenflydning kan resultere i akkumulering af cellulær affald biprodukter og reducere cellernes levedygtighed. - På dagen for transfektion, forberede liposom og DNA-blandingen i henhold til fabrikantens anbefalinger og transficere DNA-celler med en DNA-sammensætning på 1: 1: 2 i HA: NA: Gag med en total DNA mængde på 40 ug per T-150-kolbe. Fortynd DNA- og liposomopløsninger i serumfrit transfektion medier uden antibiotika, således at hver kolbe indeholder et samlet volumen på 20-30 ml.
Bemærk: Forholdet mellem genkonstruktioner kan kræve brugerens optimering. Selvom det ikke er påvist her, har en lignende procedure transfektion udført med respiratorisk syncytialvirus (RSV) F og HIV Gag ved en 1: 1-forhold. For DENV og CHIKV enkelt ekspressionsplasmider, i alt 20 ug DNA pr T-150-kolbe anvendes til optimal eXPRESSION. DNA: transfektionsreagens forhold er brugeren optimeres. Anvend anbefalet transfektion medium baseret på transfektion metode, dvs. polykationiske lipid transfektioner anbefaler reduktion eller fravær af føtalt bovint serum således medier kan suppleres med væksthormoner og sporstoffer til at støtte vækst i fravær af serum. - Retur kolber til 37 ° C med 5% CO2-inkubator. For et volumen på 200 ml, anvende 9 T-150 kolber. Cellerne holdes i transfektion dyrkningsmedium, indtil dagen for VLP høst.
- Høst dyrkningssupernatant af celler efter 72-96 timer efter transfektion afhængigt antigen, eller når cellelevedygtighed er faldet til 70-80%, som anslået ved mikroskopisk inspektion. Overfør supernatanten i 50 ml koniske rør og spin cellerne ned ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C for at pelletere celledebris.
Bemærk: Udskiftning af 3 døgn supernatanten med frisk forvarmet, serumfrit transfektion medier til adhærente celler vil yielda andet parti af VLP'er med tilsvarende eller lidt reduceret udbytte og bør optimeres af brugeren. - Pool supernatanten og filtreres gennem et 0,22 um pore membran før sedimentering via ultracentrifugering.
- Test hæmagglutinering aktivitet af HA-udtrykkende VLP'er efter standard hæmagglutineringsassay 14 ved 0,8% kalkun eller mammale røde blodlegemer eller fortsætte med antigen-specifik ELISA. Se figur 2 for repræsentative resultater.
2. Chik VLP ekspression under anvendelse Baculovirus / insektcellesystem
- Generer rekombinante baculovirus udtrykker chikungunya virus kapsid og kappeproteiner (C-E3-E2-6K-E1) fra S-27 stammen anvendelse af et kommercielt baculovirusekspressionssystem.
- Kultur Spodoptera frugiperda Sf9-celler i serumfrit Sf9 vækstmedium med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 28 ° C. Brug 3-5 x 10 5 c / ml at initiere spinner kolbe kulturer til suspension cellevækst. Passage rutinemæssigt når de når celledensiteter på 2-4 x 10 6 c / ml (hver 3-4 dage).
- Kultur Sf9 celler i suspension i spinner kolber med omrøring ved 130 rpm på en multipoint omrører plade-system. For korrekt beluftning, vedligeholde kulturomfang på ikke mere end halvdelen af volumenet af spinnerkolben.
- Til ekspression af Chik VLP'er, inficere Sf9-celler ved en densitet på 2 x 10 6 celler / ml med rekombinant baculovirus ved en infektionsmultiplicitet på 1 og vende tilbage til 28 ° C inkubator. Typisk inficere en eller to spinner kolber, der indeholder 250 ml Sf9-celler.
Bemærk: Selvom vi ikke bruge denne fremgangsmåde kan Sf9-celler dyrkes i rystekolber ved 28 ° C under anvendelse af en ryster platform. - Harvest kulturer efter 72-96 timer efter infektion, eller når cellelevedygtighed er faldet til 70-80% som bestemt ved trypanblåtudelukkelse ifølge producentens protokol.
Bemærk: Cellerne fortsætter med at proliferere, mens inficerede og der era ~ 80% levedygtighed i Sf9-kulturer inficeret med rekombinante Chik VLP baculovirus på 3 dage efter infektion (dpi). Baculovirus-inficerede celler er større i udseende. Morfologi kan også ændre sig fra runde til aflange. I sene stadier af baculovirus- infektioner, begyndte cellerne at lysere. - Overfør kulturer direkte fra suspension kultur i 50 ml koniske rør og spin cellerne ned ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Saml supernatanter og filtreres gennem et 0,22 um pore membran før sedimentering via ultracentrifugering.
3. Sedimentation / Oprensning af VLP / SVPs
- Sterilisere 25 mm x 89 mm åben-top ultracentrifugerør med 70% ethanol i biosikkerhed hætte. Sørg for ethanol er tørret ud før brug.
- Lægge op til 32 ml af supernatanten i et rent rør. En minimal volumen på 25 ml anbefales for at forhindre kollaps og beskadigelse af utilstrækkeligt fyldt ultracentrifugerør.
- underlag forsigtigt supernatanter with steril 3 ml 20% glycerol i PBS (v / v). Sørg rør er afbalanceret.
- Centrifugering ved 135.000 xg i 4 timer ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten, sikrer pelleten ikke løsne fra røret.
- Resuspender sedimenteret VLP'er ved bunden af reagensglassene med sterilt PBS ved kraftig pipettering op og ned. Mængden af PBS nødvendigt at opblande VLP'er afhænger VLP totalt udbytte protein og efterfølgende anvendelser. Typisk resuspenderes hver VLP pellet i mindst 100 pi.
- Opbevar prøverne 4 ° C til kortvarig opbevaring og -80 ° C opbevaring til langtidsopbevaring.
4. Fastlæggelse Protein Udbytter og specifikt antigen Udbytter
- Bestemme det samlede proteinindhold under anvendelse af et kommercielt protein kvantificering fremgangsmåde, såsom BCA assay som pr producentens protokol.
- For at vurdere specifikt antigen indhold, udføre direkte enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) ved at coate seriefortyndinger af standard antigen og 2-51 g af den samlede proteinprøve til en ELISA 96-brønds fladbundet plade.
- Følg med antigenspecifikke antistoffer til at probe tilstedeværelsen af antigenerne på pladen og anvende traditionelle ELISA udviklings- substrater til at producere påviselig absorbans for mikropladelæser. Se figur 2 for repræsentative resultater af HA og ELISA-assay for en prøve HA-udtrykkende VLP; mange kombinationer af HA og NA er muligvis, men udbyttet kan afvige upon HA-NA kompatibilitet 15.
Bemærk: Antigen-specifikke antistoffer har variable tilhørsforhold, og det anbefales, at endpoint-fortynding titrering af antistoffer bestemmes, før du udfører VLP kvantificering. Kommercielle antistoffer vil har foreslået koncentration eller fortynding intervaller til anvendelse i ELISA, såvel som foreslået protokoller.
- Følg med antigenspecifikke antistoffer til at probe tilstedeværelsen af antigenerne på pladen og anvende traditionelle ELISA udviklings- substrater til at producere påviselig absorbans for mikropladelæser. Se figur 2 for repræsentative resultater af HA og ELISA-assay for en prøve HA-udtrykkende VLP; mange kombinationer af HA og NA er muligvis, men udbyttet kan afvige upon HA-NA kompatibilitet 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
VLP udbyttet var variabel ved virusantigen konstrukt design. I denne protokol, har vi vist brug af insekt- og mammale celler til produktion af SVP eller VLP'er i supernatant og oprensning ved ultracentrifugering. Fire undertyper af DENV prM / E strukturel genekspression kassetter blev brugt til at konstruere versioner af DENV SVPs (afgrænsede som 1-4) i tabel 1 og viser et interval mellem 1,1 til 2,6 mg totalt protein i 0,6 ml volumener. For VLP, der kræver en tre genkonstruktioner, fandt vi den optimerede DNA transfektion forholdet 1: 1: 2 for HA: NA: Gag henholdsvis at syntetisere influenza VLP; derimod et enkelt plasmid udtrykker flere chikungunya virale proteiner var passende for generering af rekombinant baculovirus og pattedyr Chik VLP. Derudover en dual-plasmid transfektion procedure er også muligt med pattedyrceller, som sådan med RSV-F og Gag transficeret ved et 1: 1 forhold, og giver indbyrdesende 0,01 mg / ml total cellekultursupernatant. Som vist i tabel 1, kan Chik SVP udbytte fra Sf9-celler i området mellem 0,008-0,016 mg totalt protein / ml supernatant volumen, mens produktionen gennem mammal 293T giver en 10 gange reduktion af protein. Mellem de to versioner af H3N2 VLP'er med forskelligt vildtype, fuldlængde HA plasmider, den H3N2 VLP Prøve 2 havde en reduceret udbytte af både total protein og specifik HA-indhold. Anden prøve VLP HA mængder er vist i figur 2 og 3, og illustrerer, hvordan HA og ELISA anvendes til at estimere overflade indhold på VLP'erne. Som med en konventionel direkte ELISA-metoden, er en standardkurve genereret under anvendelse af kendte koncentrationer af en rekombinant HA at sammenligne ELISA reaktivitet prøve H3 VLP'er fyldt på en ELISA-plade. ELISA eller lignende immunoassay anbefales til kvantificering af VLP'er, der har let tilgængelige monoklonale antistoffer med kendt krydsreaktivitet til en velbevaret epitholder åben, men kan ikke være til rådighed for alle antigener. RSV-F er velkarakteriseret, derfor en ELISA under anvendelse af monoklonalt anti-RSV-F-antistoffet kan også anvendes til kvantificering af overfladen F på pelleteret RSV F VLP'er. Foruden antigen funktionalitet og antigen-genkendelse af specifikke antistoffer, kan VLP præparater strukturelt vurderet ved elektronmikroskopi. Figur 4 er et repræsentativt billede, der viser, at HA (Gag-kerne) influenza VLP'er med held udtrykkes, samlet og oprenset som VLP'er.
| Beskrivelse | Kultur Vol (ml) | Harvest en | Samlet volumen | Total protein Udbytte (mg) | Udbytte (mg) / Vol (ml) | Specifik indhold antigen |
| DENV1 SVP | 293T186 | 4 d | 0,6 ml | 1,115 | 0,006 | nd |
| DENV2 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2.5 | 0,0134 | nd |
| DENV3 SVP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 1,536 | 0,0083 | nd |
| DENV4 SVP | 293T / 186 | 4 d | 0,6 ml | 2,613 | 0,014 | nd |
| Chik VLP | Sf9 / 186 | 3 dpi | 0,6 ml | 1,503 | 0,0081 | nd |
| Chik VLP | Sf9 / 500 | 4 dpi | 2,0 ml | 8,276 | 0,0166 | nd |
| Chik VLP | 293T / 186 | 3 d | 0,6 ml | 0,296 | 0,0016 | nd |
| H3N2 VLP 1 | 293T /216 | 3 d | 0,6 ml | 1.25 | 0,0058 | 1,9 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 2 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 0,956 | 0,0044 | 0,96 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 3 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1.6 | 0,0074 | 1,2 ug HA / pl |
| H3N2 VLP 4 | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 1,54 | 0,0071 | 0,98 ug HA / pl |
| RSV-F-VLP | 293T / 216 | 3 d | 0,6 ml | 2.3 | 0,0106 | 0,15 pg RSV F / ul |
| en d = dage efter transfektion dpi = dage efter infektion | ||||||
Tabel 1: subvirale og v Irus-lignende partikel udbytter ved konstruktionen. Repræsentative data for VLP volumener, er totalt protein udbytte (bestemt ved konventionel BCA assay) eller specifikt antigen indhold (bestemt ved ELISA) vist blandt en række SVP / VLP konstruktioner. Udbytter er variable på grund af forskel i SVP / VLP-samling og celletype, og maksimalt udbytte kan kræve brugerens optimering. De forskellige versioner af enten DENV1-4 variere baseret på serotype, mens Chik VLP'erne bruge den samme sekvens, men forberedelserne er forskellige i enten volumen eller cellekultur type. De forskellige versioner af H3N2 VLP'er (1-4) udtrykker fire unikke HA-sekvenser, der deler en HA-specifik ELISA reaktive epitop og blev co-udtrykt med samme NA og Gag kerne. RSV-F-VLP, som genereres fra en dual-plasmid transfektion af RSV-F og Gag, blev syntetiseret og RSV-F-indhold blev tilnærmet ved hjælp af RSV-F specifikt ELISA assay.
.jpg "/>
Figur 1:. Approach - VLP design, syntese og oprensning Skematisk fremstilling af plasmid gen motiver til ekspression af virale strukturelle proteiner, der vil danne VLP'er: (A) co-ekspression af multiple strukturelle proteiner ved co-transfektion af tre plasmider i 293T-celler , (B) ekspression af strukturelle proteiner fra et enkelt gen-kassette kodet i et enkelt plasmid i 293T-celler, og (C) rekombinant baculovirus der koder Chik strukturelle proteiner anvendes til at inficere Sf9 celler dyrket i centrifugekolber at fremme høj densitet cellevækst i suspension . De VLP'erne høstes fra cellen dyrkningsmedier, afklaret cellerester, og adskilt fra ikke-partikler via sedimentation ved ultracentrifugering på en 20% glycerol pude. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 2: Eksempel hæmagglutineringsassay af H3 VLP En konventionel hæmagglutineringsassay blev udført på et repræsentativt udsnit af H3N2 VLP og dens tilsvarende klarede supernatant; H3N2 HA-analyse kan udføres under anvendelse 0,8% kalkun røde blodlegemer eller marsvin røde blodlegemer (ikke vist). Totalt proteinindhold estimeres ved anvendelse af standard BCA-analysen på den rensede VLP og blev ikke udført eller anbefalet til klarede supernatant. ELISA blev udført på den rensede VLP og HA-indhold blev vurderet ved hjælp af en rekombinant HA standard med kendt koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ex rigelig H3 ELISA til kvantificering af H3-indhold i H3 VLP'er. en ELISA-plade blev overtrukket med serielle fortyndinger af en rekombinant HA standard med kendt koncentration og udvandet H3N2 VLP prøver genereret fra forskellige HA-sekvenser (prøverne 1-9). Korrelering af koncentrationen (pg / pl) af standarden til lysabsorptionsvaerdierne opnået ved 492 nm (OD), er koncentrationer opnået ved at udlede x-værdien, som skærer den lineære del af standardkurven. Fortyndinger af rekombinante HA standard og ukendte prøver blev lagt i to eksemplarer i brønde A & B eller C & D hhv. Den endelige koncentration af VLP prøve bestemmes ved at gange koncentrationen med fortyndingsfaktoren af VLP prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.
4041 / 54041fig4.jpg "/>
Figur 4: Elektronmikroskopi af HA-VLP'er ved hjælp af Gag-core repræsentant elektronmikroskopi foto af oprenset influenza HA VLP'er.. VLP samles til sfæriske partikler belagt med HA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har anvendt de ovenfor beskrevne teknikker med succes udtrykke og oprense SVPs og VLP'er sammensat af flere strukturelle proteiner til forskellige patogener. Generelt anvender vi pattedyrekspressionssystemer at generere vores VLP'er. i vores hænder, mammal-celleafledt imidlertid Chik VLP udbytter var lave. Chik VLP udbytte var mere robust, når du bruger et rekombinant baculovirus-insekt celle system. Generelt baculovirus-insektcellesystemer giver højere mængder af rekombinante proteiner, som kan skyldes de højere celletætheder, der kan dyrkes i centrifugekolber versus vævskulturkolber, og også på grund højt ekspressionsniveau af fremmede gener, mens under kontrol af baculovirus polyhedrin promotoren. 16 imidlertid en ulempe ved anvendelse af baculovirus er selve tilstedeværelsen af baculovirus i VLP præparater, som har adjuvansaktivitet, og skew immunologiske resultater i vaccinen Studies 17 Vi fandt også variabilitet i udbyttet af influenza VLp'er afhængigt af HA- og NA-kombinationer, der anvendes; H3N2 VLP2 havde relativt reduceret udbytte i forhold til H3N2 VLP1 potentielt skyldes mindre effektiv VLP-samling eller NA-kompatibilitet 15 og stadig at blive undersøgt yderligere. Optimering af DNA-konstruktioner og transfektion nøgletal fortsat kritiske trin for at sikre optimale VLP udbytter. Vi har valgt at bruge et pattedyr vektor pTR600 konsekvent blandt vores pattedyr-baserede VLP'er fordi udtryk er generelt effektiv og subkloning er praktisk med flere restriktionsenzymer. Nøgletal af plasmider kan justeres til brugerens krav for at forbedre VLP udbytter. Men som omtalt, nuværende begrænsninger i pattedyrs VLP produktionen forbliver hos omkostningerne ved transfektion og cellevækst kapacitet i løbende vævskulturkolber den. Selvom det ikke er udført i denne protokol, har vi observeret yderligere vellykket produktion af VLP i transfekterede celler, når medierne er genopfyldes med frisk vækst medier (f.eks, OptiMEM) efter granert 72 hr høst og efterfølgende indsamling af VLP'er efter yderligere 72 timer, selv om udbyttet kan blive reduceret en smule i forhold til den første samling af VLP'er.
Vi viser en procedure til ekspression virale strukturelle proteiner i enten insekt- eller mammale cellekulturer til at frigive VLP'er i supernatanten for delvis oprensning ved ultracentrifugering. SVP / VLP'erne er generelt stabile til brug i antigen immunoassays og undersøgelser vaccination, og udgør færre trusler sikkerhed i forhold til at leve viruspartikler, især for udvalgte agenter eller high-patogen aviær influenza (HPAI) stammer 8,18, som kræver biosikkerhedsniveau 3 (BSL-3) laboratorieforhold 19. VLP produktion er relativt enkel og giver ofte partikler, der kan genkendes af antistoffer frembragt mod native virale strukturelle proteiner, ikke udelukkende denaturerede lineære epitoper. VLP tjene som en nyttig platform for at fremkalde specifikke immunreaktioner til antigenet og kanvære en lovende kandidat i udvikling af vacciner.
Denne protokol viser to fremgangsmåder til transfektion virusgener i pattedyrs system. I denne illustration to influenza gener, HA og NA, cotransficeres med HIV Gag at generere en VLP, som har en Gag indre kerne, med HA og NA samles på overfladen. Substitution af Gag stedet for influenza Matrix 1 (M1) demonstrerer fleksibilitet Gag-baserede VLP'er med ubeslægtede virale glycoproteiner, såsom RSV-F og potentielt andre. Alternativt syntesen af CHIKV anvender et strukturelt gen kassette, som udtrykker de nødvendige komponenter til SVP selvsamling, med CHIKV E proteiner præsenteres på overfladen af et center bestående af C-protein. Disse to fremgangsmåder demonstrere fleksibiliteten af VLP-syntese, som kræver minimale strukturelle virale proteiner at samle fra transficerede celler.
Endelig mens vi præsenterede generelle protokoller og repræsentative results til ekspression og oprensning af H3N2, RSV, DENV, og CHIKV, disse procedurer er let modtagelig for generering af VLP bruger andre virale proteiner. Disse procedurer er med held blevet brugt af vores gruppe i dannelsen af andre influenzavirus undertyper, herunder H1, H5, og H7-vira. Desuden enkelt plasmid, prM- / E-design, der anvendes til generering af DENV SVPs kan tilpasses til generering af SVPs for andre medlemmer af Flavivirus familien, der omfatter West Nile og japansk hjernebetændelse virus. Ligeledes kan fremgangsmåderne ifølge Chik VLP produktion anvendes til andre medlemmer af Togaviridae familien, herunder den venezuelanske, øst og vest hesteencephalitisvirus vira.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker at anerkende de forudgående medlemmer af Ross lab, der har hjulpet optimere protokollen for maksimal effektivitet og udbytter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016 | |
| Cimarec I 6 multipoint stirrer plate | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Polyclear ultracentrifuge tubes | Seton | 7025 | Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Phosphate citrate buffer | Sigma | P4922 | |
| o-phenylenediamine dihydrochloride | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μm vacuum filter top (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
References
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug Deliv Rev. , (2014).
- Mair, C. M., Ludwig, K., Herrmann, A., Sieben, C. Receptor binding and pH stability - how influenza A virus hemagglutinin affects host-specific virus infection. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 1153-1168 (2014).
- Engerix-B package insert. GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC. , (2013).
- Giles, B. M., et al. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection. J Infect Dis. 205, 1562-1570 (2012).
- Giles, B. M., Ross, T. M. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets. Vaccine. 29, 3043-3054 (2011).
- Green, T. D., et al. C3d enhancement of neutralizing antibodies to measles hemagglutinin. Vaccine. 20, 242-248 (2001).
- Bright, R. A., et al. Cross-Clade Protective Immune Responses to Influenza Viruses with H5N1 HA and NA Elicited by an Influenza Virus-Like Particle. PLoS ONE. 3, e1501 (2008).
- Yondola, M. A., et al. Budding Capability of the Influenza Virus Neuraminidase Can Be Modulated by Tetherin. J Virol. 85, 2480-2491 (2011).
- Schneider-Ohrum, K., Ross, T. M. Virus-like particles for antigen delivery at mucosal surfaces. Curr Top Microbiol Immunol. 354, 53-73 (2012).
- Murawski, M. R., et al. Newcastle disease virus-like particles containing respiratory syncytial virus G protein induced protection in BALB/c mice, with no evidence of immunopathology. J Virol. 84, 1110-1123 (2010).
- Quan, F. S., et al. Viruslike particle vaccine induces protection against respiratory syncytial virus infection in mice. J Infect Dis. 204, 987-995 (2011).
- Ross, T. M., Tang, X., Lu, H. R., Olagnier, D., Kirchenbaum, G. A., Evans, J. D. COBRA-Based Dengue Tetravalent Vaccine Elicits Neutralizing Antibodies Against All Four Dengue Serotypes. J Vaccine Immunotechnology. 1 (7), (2014).
- Manual for the Laboratory Diagnosis and Virological Surveillance of Influenza. World Health Organization. , (2011).
- Mitnaul, L. J., et al. Balanced Hemagglutinin and Neuraminidase Activities Are Critical for Efficient Replication of Influenza A Virus. J Virol. 74, 6015-6020 (2000).
- Jarvis, D. L. Methods in Enzymology. 463, Academic Press. 191-222 (2009).
- Pijlman, G. P. Enveloped virus-like particles as vaccines against pathogenic arboviruses. Biotechnol J. 10, 659-670 (2015).
- Park, J. K., et al. Protective efficacy of crude virus-like particle vaccine against HPAI H5N1 in chickens and its application on DIVA strategy. Influenza Other Respir Viruses. 7, 340-348 (2013).
- Gangadharan, D., Smith, J., Weyant, R. Biosafety Recommendations for Work with Influenza Viruses Containing a Hemagglutinin from the A/goose/Guangdong/1/96 Lineage. MMWR. Recommendations and reports : Morbidity and mortality weekly report. Recommendations and reports / Centers for Disease Control. 62, 1-7 (2013).
