Abstract
En atferdssyndrom foreligger når spesiell oppførsel samhandle under forskjellige sammenhenger. Sebrafisk har vært testpersonene i nyere studier, og det er viktig å standardprotokoller for å sikre riktige analyser og tolkninger. I våre tidligere studier, har vi målt dristighet ved å overvåke en rekke atferd (tid nær overflaten, ventetid i overganger, antall overganger og dart) i en 1,5 L trapesformet tank. Likeledes kvantifisert vi aggresjon ved å observere biter, sideskjermer, dart, og tid i nærheten en tilbøyelig speil i en rektangulær 19 L tank. Ved å dele en 76 L tank i tredjedeler, vi også undersøkt stiming preferanser. Den stiming analysen er en svært tilpasses analysen og kan skreddersys for spesifikke hypoteser. Men protokoller for denne analysen også må være standardisert, men samtidig fleksibel nok for tilpasning. I tidligere studier, endekamrene var enten tom, inneholdt 5 eller 10 sebrafisk, eller 5 perle danios (D. albolineatus). I following manuskript, presenterer vi en detaljert protokoll og representative data som følger vellykkede anvendelser av protokollen, som vil gi rom for replikering av atferdssyndrom eksperimenter.
Introduction
Det er en økende mengde litteratur undersøke assosiasjoner mellom forskjellige atferd innenfor enkelte dyr fra en gitt befolkning. Disse foreningene er kalt atferdssyndromer, og målingene inkluderer vanligvis dristighet, aggresjon, utforskende atferd, og omgjengelighet 1-5. Atferdssyndromer er verdifulle for både direkte og indirekte årsaker. Direkte, kan kunnskap om atferdssyndromer gi et mer komplett bilde av evolusjonsteori, populasjonsstruktur og populasjonsdynamikk 3. Indirekte kan kunnskap om atferds foreninger informere felt som kvantifiserer atferd som farmakologi 6, toksikologi 7, atferdsgenetikk 8,9, og endokrinologi 10. På grunn av disse direkte og indirekte fordeler, økt kunnskap om atferdssyndromer er spesielt verdifullt i vanlig brukte modellorganismer som sebrafisk. Studier ved hjelp av sebrafisk er funnet ina rekke disipliner, inkludert analyse av atferdssyndromer 11-13. Å fremme kunnskap i atferdssyndrom forskning, og fordi andre disipliner også bruke atferdsmålinger for hypotesetesting, pålitelige og fyndig beskrivelser av atferd er nødvendig for gyldige analyser og tolkninger og standardiserte protokoller vil lette inter-studie sammenligninger innen arter. Vår protokollen ble utviklet for å måle en dristighet-aggresjon-stiming atferdssyndrom i en populasjon av lab-oppdratt sebrafisk 14. Imidlertid basis av protokollen (relativ enkeltfisk, som sikrer riktig randomisering, og hensiktsmessige analyser) kan lett modifiseres for en rekke alternative atferdsmessige tiltak. I tillegg kan dristighet, aggresjon, eller stiming analyser kjøres individuelt for testing av ulike hypoteser. Derfor, mens det er vårt mål å beskrive hvordan gjennomføre et atferdssyndrom studie og protokollen for vellykket individuell level atferdsmessige målinger, kan hver fasett av denne prosedyren stå alene.
Litteraturen om atferdssyndromer spenner over flere taksonomiske grupper, fra leddyr til mennesker 4, og for å måle et atferdssyndrom, må minst to atferds sammenhenger kvantifiseres. Dessverre er det ofte lite konsistens i assayene som brukes til å kvantifisere de atferdsmessige måling over aksene for atferd. For eksempel i fisk, dristighet kan måles ved hjelp av T-labyrint analyser, åpen felt analyser, eller innledning av en roman eller utenlandsk stimulans 15. Aggresjon studier i fisk kan innebære dyad interaksjoner, video stimulanse analyser, eller leire modellanalyser 12,16,17. Likeledes, analyse av stiming oppførsel, som typisk innebærer måling av shoalmate preferanse, kan utføres i forskjellige typer tanker, med ulike metoder for å bestemme krets tid 21-23. I denne protokollen en bestemt undergruppe av Overall atferdsanalyse repertoar er presentert. Spesielt presenterer denne protokollen en metode for å spore individer gjennom dristighet, aggresjon, og stiming analyser på en måte som muliggjør sammenligninger innen enkeltpersoner til å fastslå om sammenligninger er konsistente på tvers av alle individer innenfor en populasjon. Vi har utført denne protokollen med sebrafisk og sebraciklide (amatitlania nigrofasciata) i tidligere studier 14,18, og det vil fungere med alle samme størrelse ferskvannsfisk.
Dristighet analysene er utført i en 1,5 l trapesformet tank som har en horisontal linje som avgrenser like store områder i de øvre og nedre deler av tanken. Kvantifiserte oppførsel omfatter det antall overganger ved forsøksfisken mellom det øvre og nedre parti av tanken, tid brukt i hver porsjon, antall piler, og latens for å angi den øvre del. Aggresjon Analysen utføres i en 19L rektangulær tank som inkludereren 3 tommers x 5 tommer speil tilbøyelig til ca 22 ° ligger i nedre venstre hjørne av tanken 19. Kvantifiserte atferd inkluderer den totale mengden av tid brukt av målet fisk samspill med speil 20, sammen med spesifikke aggressive indikatorer - antall biter, sideskjermer, dart mellom forsøksfisken og dens refleksjon. For disse spesifikke indikatorer, er biter definert som raske lunges mot speilet med en åpen munn, er side viser definert som brenning av laterale, bryst, anal og ryggfinner i retning av speilet, og piler er noen uregelmessige bevegelser som er ikke rettet mot speilet. Til slutt, kvantifiserer stiming analysen oppførselen til et test fisk i sentrum kammer av en tri-kammer tank. Sidekamrene i tanken er enten tom eller inneholder en "target stim" av fisk, og den tid forsøksfisken tilbringer i nærheten av hver side kammer måles 21-23. En enkelt sammensatt score, referert til som strength av stiming (SOS), beregnes for hver enkelt test fisk, spesielt for stimuli, og kan brukes i nedstrøms analyser 14. Alle atferd er scoret av en enkelt seer, eller flere seere ved hjelp av fri atferds kvantifisering programvare kjent som JWatcher 24.
Testing av tilstedeværelsen av et atferdssyndrom er først og fremst en statistisk forsøke, og det anbefales å følge retningslinjene som presenteres av Budeav 2010 25. Spesielt anbefales det å utføre en rektor komponenter analyse (PCA) på sentrert og normerte data der innganger er vektorer av den enkeltes atferd i analyser med flere atferds målinger (dvs. dristighet og aggresjon). PCA, utført på en korrelasjonsmatrise, reduserer dimensjonalitet av de atferdsmessige målinger, og derved trekker det viktigste kunnskap som forklarer et flertall av variasjonen. De ekstraherte komponentene kan deretter tolkes based på høy faktor ladninger for individuell oppførsel av interesse og regresjon score kan hentes ut for hver enkelt på grunnlag av forklarings komponentene. Disse regresjon score kan deretter sammenlignes med SOS måling og andre ulike målinger ikke-atferds som fisk størrelse eller kjønn.
Denne arbeidsflyten er implementert i en studie av sebrafisk atferdssyndromer som en sex bestemt atferdssyndrom som eksisterer mellom dristighet og stiming 14 ble oppdaget. I denne situasjonen, kraftigere sebrafisk menn er mer sannsynlig å assosiere med en større, mer aggressive arter (D. albolineatus), men denne foreningen er tapt hos kvinner. Denne arbeidsflyten ble også implementert i en studie av ungdoms sebraciklide pårørende (amatitlania nigrofasciata) 18 som et atferdssyndrom ikke ble oppdaget, potensielt indikerer atferds plastisitet av arten. Derfor er den følgende protokoll presentert wed et mål om å skildre natur tre konkrete analyser (dristighet, aggresjon, og stiming) innenfor rammen av å studere et individuelt nivå atferdssyndrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende metoder for boliger, omsorg, og studier av sebrafisk har blitt godkjent av Saint Joseph University IACUC.
1. Sebrafisk Bolig og omsorg
- Skaff emnet sebrafisk fra en lokal leverandør, eller fra villfanget populasjoner. Vær oppmerksom på at boliger sebrafisk er underlagt IACUC retningslinjer og ytterligere tillatelser er nødvendig for boliger villfanget populasjoner.
- Identifisere og skille sebrafisk i henhold til sex. Alternativt, hopper du over dette trinnet eller erstatte med en annen metode for separasjon basert på studier hypotesen.
MERK: Sex egenskaper er vanskelig å fastslå i sebrafisk, spesielt hos kvinner. Henvis til disse retningslinjene 10 eller nyttige elektroniske håndbøker å skille sex. - Tilfeldig skille populasjoner videre inn i passende forhold av fokal fisk på stimuli fisk. Merk: Focal fisk er forsøkspersonene fulgt gjennom serien av behavioral analyser og stimulans fisk er enkeltpersoner som vil oppta tiltaks kamre i aggresjon og stiming analyser.
MERK: Tradisjonelt mellom 1 og 5 stimulus fisk per fokal fisk i stiming analyser og en 1: 1 stimulus: fokal fisk forholdet i aggresjon analyser 14,17 benyttes. Imidlertid må forskeren å spesifikt designe studien med hypotesen i tankene (dvs. bør stimulans fisk holdes konstant for å opprettholde konsistens i midt fiskens atferd, eller skal stimulans fisk roteres mellom hver analyse for å sikre riktig randomisering). - Oppbevar all fisk i sebrafisk boliger stativer (27,5 til 28,5 ° C) under et strengt 12:12 lys / mørke syklus. Mate alle fokus og stimulans fisk flake mat daglig, og artemia ukentlig, på ikke-forskningsdager.
- Vær sikker på at all testing er gjort mellom ZT1 og ZT5 (zeitgeber tid) for å unngå døgnrytme effekter 26.
2. Randomisering og Tank Setup
- Randomize alle personer a priori til en bestemt sekvens av atferdsanalyser. Sett opp en konsekvent randomisering ordningen bruke en online tilfeldig sekvens generator 27 eller en tilfeldig sekvens generator fra en statistisk programpakke (R).
- Merk hver analyse 1-3 og holde dette oppdraget konsekvent. Tildele en tilfeldig sekvens til hver enkelt og kartlegge sekvensen ifølge atferdsanalyse etiketten. For eksempel, for tre totalt analyser (1 tilordnet stiming, 2 kartlagt til frimodighet og tre tilordnet Aggresjon), kan et gitt individ har en randomisert sekvens av "2,3,1", som vil kreve dem til å utføre den spesifikke atferdsanalyser i bestemt rekkefølge.
- Sett opp analysetanker (dristighet, aggresjon, og stiming) i laboratoriet på steder som minimerer muligheten for uønskede ytre stimuli og sørg for å ha nok plass til en videokamera for å fange opp hele tanken. Påse at videokameraet har enough klarhet for å vise tank etiketter samt være i stand til å skille subtile atferd av fokus fisk og oppsett av videokameraet i denne posisjonen.
- Spill alle atferdsanalyser med kameraet holdes i samme stilling med full utsikt over den angitte tank for å minimalisere utilsiktede forskjeller i atferds score som følge av differensial innspillinger.
MERK: Unngå å plassere tanker i tunge trafikkerte områder og ved dører som bevegelse og lyd vil påvirke sebrafisk atferd. - Etablere unike JWatcher protokoller 24 for å utføre hver atferdsanalyse. Se i JWatcher veiledning for å lære å lage brenn master filer å tildele atferd til tastetrykk og fokale analysefiler for å oppsummere dataene som samles inn.
MERK: JWatcher er behavioral scoring programvare som gjør det mulig for pålitelig og repeterbar tilpasset atferds scoring 24. - Definer en merkeordning for å spore dato, fisk nummer, og analysen nummer for alle atferdsanalyser (f.eks'F5-B-123115' antyde Fish 5, Dristighet analysen, December 31 st, 2015) og merke på utsiden av tanken med tape i lys og i fokus på kameraet. Hold og registrere denne informasjonen i en lab notatbok for hurtigreferanse og fremtid kvalitetskontroll.
- Sett opp en akklimatiseringstanken som skal brukes mellom alle analyser samt direkte etter individer er fjernet fra huset rack.
MERK: akklimatiseringen tanks og terminal tanker er små akvarier (40 cm x 20 cm x 25 cm) med grus og et filter som ligner huset rack. - Etter at analysene er alt ferdig, overfører den enkelte til en egen terminal tank som vil fungere som det endelige målet tank for alle fokale individer. Bruk en tank som er stor nok til å huse en gruppe individer for resten av livet (for eksempel 25 gallon).
MERK: Det er svært viktig å opprettholde konsekvente og lignende vanntemperaturer og betingelser across alle tanker. Dette omfatter boliger, akklimatisering, og alle testtanker.
3. Gjennomføring av Aggression analysen
- Gjennomføre aggresjonen analysen i en 19 L rektangulær tank måler 30 cm x 15 cm x 10 cm. Utstyre tanken i ytre opake skillevegger som omgir tre sider av aggresjon tank, slik at den fremre utsatt for visning, for å redusere uønskede ytre stimuli. Dele tanken med utvendige markeringer i fire like kvadranter rektangulære og feste et speil permanent (med silikon fugemasse) inne i den nedre venstre kvadrant, skrådd ved 22,5 ° som danner en rettvinklet trekant mot den ytterste venstre side av tanken.
- Sikre at temperaturen av vannet i tanken, og akklimatiserings aggresjon tanken er mindre enn 2 ° C av huset stativet. For å gjøre dette, har friskt, i alderen vann forvarmes til 27,5 til 28,5 ° C klar til å legge til aggresjon tanken. Legg merke til at det er viktig å endre vann mellom hver analyse for å eliminere uberettigetolfactory pekepinner.
- Overfør ved kopping, et samlings fisk fra huset rack til en egen akklimatisering tank hvor den vil akklimatisere seg i 10 min.
MERK: Det er viktig å redusere stimulans introdusert til fisken gjennom feil håndtering. Overføre enkeltpersoner som tidligere beskrevet 27.- Spesielt manuelt og forsiktig plassere en liten, gjennomsiktig plastkopp i tanken av interesse. Uten å forstyrre fisken så mye som overfører ved hjelp av et nett, langsomt øse opp fisken i koppen.
- Påse at videokameraet er klart til opptak ved å bekrefte at aggresjon analysen tanken (se trinn 3.1) er i fokus og umiddelbart før du overfører den enkelte inn i aggresjon tank, trykker rekord på enheten. Overfør samlings fisk via kopping fra akklimatiseringstanken til aggresjon tank.
MERK: Det er viktig å ta opp før fisken kommer inn i aggresjon tanken å spore nøyaktig tidspunkt for innreise. - Noter aggression tank i 10 min og 30 sek og deretter kopp brenn fisk fra aggresjon beholderen tilbake inn i akklimatiserings tanken.
- Når du ser på opptaket, vente 30 sekunder etter at fisken har blitt introdusert til tanken som en ekstra akklimatiseringsperiode før scorings atferd.
- Bruke JWatcher scoring system definert for aggressiv atferd, kvantifisere følgende atferd for 10 min: Tid brukt nær speil, antall speil tilnærminger, antall dart, antall forsøk biter (åpner munnen i retning av speil), og antall sideskjermer (dorsal, pectoral, anal, og halefinnen ereksjon) 9.
- Resultat en enkelt aggresjon assay i det minste to ganger, helt til analysen er scoret med høy avtale mellom iterasjoner.
4. Gjennomføring av Dristighet analysen
- Gjennomføre dristighet analysen i en liten 1,5 L trapesformet tank måler 15 cm høy x 26,5 cm topp x 22,5 cm nederst x 6 cm bredde. Pakk ugjennomsiktig papir rundt alle sider of tanken, men la front utsatt for visning. Plassere et enkelt, tynt stykke av båndet på utsiden av tanken for å markere toppen fra den nedre delen av tanken.
- Sikre at temperaturen av vannet i trossen tanken er mindre enn 2 ° C av huset stativet (se trinn 3.2)
- Overfør det fokale fisk fra huset stativ til akklimatiseringstanken (se trinn 3.3) og la akklimatisere seg i 10 min.
- Påse at videokameraet er klart til opptak dristighet analysen, og en gang klar til å overføre fokus fisk, trykk rekord på enheten. Overfør midt fisk fra akklimatisering tanken til dristighet tank og rekord for 8 min og 30 sek.
- Når du ser på opptaket, gir mulighet for ytterligere 30 sek akklimatiseringsperiode etter at fisken er innført til tanken før scoring.
- Bruke JWatcher programvare, kvantifisere frimodighet atferd i 8 min. Spesielt kvantifisere ett av følgende: Tid nær overflaten, til latency angir øvre del, antall transitions i den øvre delen, og antall uberegnelig bevegelser (piler) 29.
- Resultat en enkelt boldness assay i det minste to ganger, helt til analysen er scoret med høy avtale mellom iterasjoner.
5. Gjennomføring av stiming analysen
- Gjennomføre stiming analysen i en 76 L tank som har tre avdelinger fordelt på to glass skillevegger forseglet med silikon caulk (de resulterende tre delene består av to tiltakssoner og en samlingsrommet). Eksternt markere to preferanse soner utpekt 6,35 cm fra hver av tiltakssoner 'glass skillelinje, indikerer to karosserilengder 30. Påfør ugjennomsiktig skillevegger eksternt rundt tre sider av stiming tank, men la front utsatt for visning.
MERK: Denne innstillingen sonen kan tilpasses for å teste for spesifikke hypoteser for forskjellige størrelser arter. - Avhengig av arten av studien, for å velge stimulans stimer akklimatiseres i minst 12 timer before testing og forbli i stiming tank i løpet av eksperimentet.
MERK: Tiltaks stimer er samlinger av enkeltfisk som brukes til å vurdere hvor fokus fisken oppfører seg i nærvær eller fravær av disse stimer. Ulike stimulans Shoal kombinasjoner kan velges for å teste en rekke ulike stiming hypoteser. Vær sikker på at tiltaks stimer er rotert mellom hver stimulus sone for å unngå side skjevhet og er også lov til å akklimatisere seg i minst 12 timer før testing. - Overfør det fokale fisken inn i akklimatiserings tank som tidligere beskrevet (se trinn 3.3)
- Overfør ved kopping, fokus fisk fra mellom akklimatisering tank til sentralrommet i stiming tanken.
- Tillat for en 10 min akklimatiseringsperiode før en 10 min live scoring observasjonsperioden. Alternativt registrere stiming analyser og scorer senere med JWatcher. Fisk blir bestemt til å være stiming når de er innenfor preferanse sone i kammeretbolig målet stim.
- Kvantifisere tid brukt i hver preferanse sone og tid tilbrakt i sentrum volum.
- Som en ekstra beskrivende mål, beregne 'styrke stiming' (SOS). Tilordne en verdi mellom -1 og 1, hvor omfanget beskriver hvor ofte en person fiskestimene.
- Beregne forholdet av tid brukt stiming dividert med arealet av stiming sonene og subtrahere forholdet mellom tiden som brukes ikke stiming og arealet av de ikke-stiming soner. Plasser denne kvantitet over summen av tid brukt i hver sone delt på volumet av hver sone individuelt. Mer informasjon om denne beregningen kan bli funnet i en tidligere studie 14.
6. Data Quality Kontroll
- Analyser data ved hjelp av tradisjonelle data analyseverktøy 31-32.
- Test for homogenitet av varians hjelp nonparametric Levene test for alle atferd. Hvis en atferd er ikke-homogen utføre en log-transformasjon33.
- Kontroller at det ikke er noen sekvens effekter (dvs. at randomisering rekkefølgen ikke påvirke den enkeltes atferd) ved hjelp av en Kruskal-Wallis ANOVA på de homogene data 34.
- Kontroller at det ikke er noen side fordommer for stiming analysen ved å opprette univariate generelle lineære modeller på SOS indekser med siden som en fast faktor 35.
MERK: Hvis det er lite eller ingen problemer med data, kan nedstrøms analyser skal gjennomføres. Hvis det er problemer, forene med flere transformasjoner, rasjonalisere med biologisk plausible forklaringer, og / eller øke utvalgsstørrelser.
7. Analyser av data
- Beregn to-tailed Spearman rank korrelasjoner 36 for alle atferd separat innenfor dristighet og aggresjon analyser.
- Beregn intra korrelasjonskoeffisienter (ICC) som en to-veis blandet modell med konsistens for atferdsmessige analyser som ble utført mer enn en time for et gitt individ 36. I denne innstillingen, er ICC en måling av hvor konsekvent en fisk opptrådt på en gitt analyse målt mer enn én gang.
- Preprocess dristighet og aggresjon atferd ved sentrering og norming alle atferd for å forberede innspill til en rektor komponenter analyse (PCA) 25.
MERK: forbehandling målingene ved sentrering og norming er et viktig steg. Uten denne forbehandlingstrinn atferd som forekommer med mer frekvens og mer variabelt vil overdrevent påvirke tolkninger av ekstraherte komponentene. Prosessen med sentrering og norming vil fjerne denne skjevhet. - Utfør en PCA med en korrelasjonsmatrise for å avgjøre om dristighet og aggresjon er knyttet sammen som et atferdssyndrom. Tolke atferdsmessige mengder av hver komponent signifikant ved> 0,6. Se Budaev 2010 24 for en omfattende guide for rapportering PCA for atferdsstudier. En steinur tomten vil være informativ som eigenvectors bør holdes for tolkning.
- Ved hjelp av statistisk programvarepakke som R eller SPSS 31,32, trekke score for hver komponent for hver enkelt. Stillingen representerer hvor mye en gitt individuell oppførsel kan forklares med den spesielle komponent.
- Beregn Spearman rank korrelasjon mellom faktor regresjon score og styrken på stiming 36.
MERK: En atferdssyndrom anses tilstede hvis dristighet og aggresjon atferd laste på samme komponent eller, hvis noen komponent med betydelige tolk belastninger korrelerer med styrke stiming. Vær også oppmerksom på at styrken på stiming ikke er inkludert i PCA for å tillate bedre tolkninger av mer komplekse atferds quantifications (dristighet og aggresjon). PCA vil orthogonally kollapse dristighet og aggresjon har i egenvektorer for å maksimere mengden av variasjon forklart og er godt egnet for disse komplekse målinger. tolkeden resulterende egenvektorer og tilbakegang vår styrke stiming målinger på hver av dem gir en mye mer intuitiv forståelse av hvordan hver av de komplekse atferd (dristighet og aggresjon) forholde seg til en mer veldefinert binære stiming måling (det vil si at fisken stiming eller ikke stiming).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avhengig av arten av studien, og spesifikk protokoll som anvendes, flere forskjellige resultatene er mulig i en adferdssyndromer eksperiment. Følgende tabeller og figurer, hvor angitt, er tilpasset fra vår tidligere studie publisert i tidsskriftet Behavioural Processes 14 og tidsskriftet Sebrafisk 17. Når forslag (som beskrevet ovenfor) blir utført i sin helhet, to sett av resultater, 'innenfor analyse korrelasjoner' og 'mellom analyse korrelasjoner,' er forventet (figur 1).
Det første sett av resultater beskriver innenfor analyse konsistens. Spesielt resultatene beskrive hvordan atferd er korrelert med hverandre innenfor dristighet analysen og i aggresjon analysen separat. Tabeller 1 og 2 beskriver hva disse sammenhengene bør se ut for dristighet og aggression analyser og data som presenteres er tilpasset fra en tidligere studie 14. For trossen analysen, er det forventet at antallet overganger og tid i den øvre delen av tanken er positivt korrelert, men ventetid for å angi den øvre del er negativt korrelert. Representative resultater for enkeltpersoner målt på dristighet aksen atferd i dristighet tank (se trinn 4.1) er gitt i tabell 1. For aggresjon analysen, er det forventet at biter, side skjermer, og tid brukt nær speilet er alle korrelert. Representative resultater for enkeltpersoner, målt på aggresjon akse oppførsel i aggresjon tanken (se trinn 3.1) er gitt i Tabell 2. Dart er vanligvis ikke korrelert med aggressiv oppførsel, selv om i noen tilfeller, nonaggressive fisk har en tendens til å dart (følgelig en negativ korrelasjon ). Til slutt, en styrke for stiming (SOS) måling for stiming analysen gir et individuelt nivå mål på stiming tendency. Stiming er en svært repeterbare atferd på tvers av en rekke stiming analyser målt ved hjelp av SoS (ICC = 0,641) 14 og flere av våre tidligere studier har bekreftet stiming atferd i sebrafisk 23,38. Siden alle personer vil bli målt for hver av atferd, kan vi beregne Spearman korrelasjon på tvers av disse atferd og forventer noen atferd for å være korrelert, som er identifisert for sebrafisk i de representative resultater.
Den andre delen av resultatene undersøker det tilstedeværelsen av en adferdssyndrom. Resultatene av integrerende analyse av alle atferd kvantifiseres i dristighet og aggresjon atferdsanalyser oppsummeres ved hjelp av en Principal Components Analysis (PCA). Det bør være to til fire tolkbare komponenter basert på høye belastninger for hver opptreden. Hvis en enkelt egenvektor som forklarer en god del av variasjonen inkluderer atferd fra både dristighet end aggresjon analyser, deretter et atferdssyndrom har blitt observert. Men hvis atferd fra dristighet og aggresjon analyser ikke overlapper på en enkelt egenvektoren, da studien beskriver ikke et atferdssyndrom. Representative Resultatene presenteres for fraværet av en dristighet-aggresjon atferdssyndrom (figur 2). I dette eksempelet komponent 1 er sterkest representant for aggresjon atferd mens komponent 2 er sterkest assosiert med frimodighet atferd. Fordi aggresjon og dristighet atferd ikke er representert av den samme komponent, kan det konkluderes med at det er fraværet av en dristighet-aggresjon atferdssyndrom (dristighet vektorer er omtrent vinkelrett på aggresjon vektorer). Dessuten er disse problemene ikke påvirket av sex fordi fordelingen mønsteret er det samme mellom menn og kvinner. For å observere om dristighet eller aggresjon atferd er forbundet med stiming, de utpakkede regresjon score for hver fisk er korropprømt med fiskens SoS måling. Det er viktig å sikre at eventuelle samkjøre komponentene er faktisk beskriver en tolke sett av atferd. Hvis det er høye absolutte verdi Spearman korrelasjon mellom noen av komponentene og stiming måling, deretter en stiming atferdssyndrom er til stede. Uavhengig av de spesifikke resultater, er det viktig å tilveiebringe mulige biologiske tolkninger til alle observasjoner. Representative resultater er gitt for en beskrivelse av en dristighet-stiming atferdssyndrom (Tabell 3) 14. Mens de data som presenteres representerer typiske resultater for sebrafisk, bør de ikke tolkes som målinger av datakvalitet. Det er flere grunner til at dataene vil se annerledes på tvers av ulike eksperimenter som art eller bestand forskjeller.
Figur 1. Forslagarbeidsflyt for en dristighet, aggresjon, og stiming atferdssyndromer eksperiment. Typiske mål er oppgitt for hver analyse. En skisse av hvordan å analysere analysene individuelt og deretter hvordan du kan integrere analysene er også oppført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative resultater av en PCA som indikerer at en boldness-aggresjon adferdssyndrom er fraværende. De røde vektorer indikerer virkemåter som bidrar til komponent score (venstre og nedre akser) og punktene representerer individuelle poeng langs hver komponent (høyre og topp akser ). Hanner er representert med blå punkter og kvinner er representert av grønne poeng. Merk at «uberegnelig oppførsel 'se' piler 'og'aggresjon rate' kan beregnes ved å legge antall biter og sideskjermer dividert med den totale tiden i samspill med speilet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| overganger | Ventetid | Dart | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Surface Tid | 0,65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| overganger | -0,40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Ventetid | -0,47 | 0,002 | ||||
| * Α <0.05 |
Tabell 1:. Dristighet Spearman rank korrelasjoner i en roman tank analysen Denne tabellen hadde blitt endret fra Way et al, 2015..
| lateral Viser | Dart | Mirror Tid | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Bites | 0.69 | <0,001 * | -0,10 | 0,547 | 0,63 | <0,001* |
| lateral skjermer | -0,06 | 0,735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| Dart | -0,18 | 0,285 | ||||
| * Α <0.05 | ||||||
Tabell 2:. Aggresjon Spearman rank korrelasjoner i en roman tank analysen Denne tabellen hadde blitt endret fra Way et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| PCA-komponenter | ||
| dristighet | 0,339 | 0,035 * |
| Aggresjon | 0,075 | 0,65 |
| dart | -0,012 | 0,944 |
T stand. 3: Bruke PCA komponenter for å bekrefte tilstedeværelse av en stiming og dristighet atferdssyndrom stede i denne populasjonen Denne tabellen hadde blitt endret fra Way et al, 2015..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen vil avgjøre om det er forenlig foreninger i dristighet, aggresjon, og stiming atferd i sebrafisk. Hvis det er konsistente assosiasjoner i en gitt befolkning mellom noen av disse problemene, og deretter et atferdssyndrom er til stede. Ved å studere en populasjon naturlige atferdssyndrom, kan forskere ha en mer fullstendig forståelse av sin atferds dynamisk, befolkningsstruktur, og muligens evolusjonære historie 3. Videre manipulere omgivelsene som påvirker disse atferdssyndromer, som i farmakologi 6, toksikologi 7, atferdsgenetikk 8,9, og endokrinologi 10 studier kan belyse hvordan ulike faktorer kan påvirke atferds foreninger. Den spesifikke sammensetningen av aggresjon-dristighet-stiming atferdssyndrom som finnes i denne protokollen omfatter felles atferd godt studert i modellorganisme sebrafisk 11-13. Mens denne metodikkenkan brukes til alle fiskeslag, kan den bredt program for å bruke sebrafisk hjelpe til med tverrfaglig standardisering av denne protokollen. Hver analyse beskrevet ovenfor kan lettere kontrolleres og manipuleres enn andre sammenlignbare teknikker. For eksempel bruker aggresjon analysen tilbøyelig speilet for å lokke fram et bredere spekter av aggresjon svar i stedet for å bruke en live eller leire modell, video stimulans, eller vertikal speilbilde stimulus 17. Atferd målt i dristighet analysen er lettere kvantifisert enn i en t-labyrint eller store åpne felttest 15. Til slutt, stiming analysen beskrevet kan enkelt spore et individ, som er avgjørende for å studere atferdssyndromer på individnivå, og kan tillate ubegrensede kombinasjoner av målet stimer å stille nye eksperimentelle spørsmål. Selv om denne protokollen kan endres for å imøtekomme en rekke atferds spørsmål, kan standardisering av det føre til ytterligere innsikt i hvordan DNA, cellulære mekanismens, cellulær utvikling, og introduserte kjemikalier kan påvirke individuelle og befolkningsatferdssyndromer.
For å være sikre på at de observerte foreninger er sant, må protokollen følges nøye. For det meste, er protokollen kan modifiseres i henhold til de spesifikke hypotese; Men det er flere trinn som må utføres for å sikre tillit til resultatene. For det første er det viktig at individene er plassert i en egnet tank, ved optimale betingelser (se protokoll) og mates på riktig måte. De vannforhold bør være konsekvent i bolig stativer, akklimatiseringen tanker, og test tanker. Hvis vannet ikke er konsekvent, vil fisken ta lengre tid å venne seg til forholdene, og de atferdsmessige målingene vil ikke være riktig registrert. Det er også viktig at vannet resirkuleres mellom mot og aggresjon tankene slik at kunstige lukt ikke blir overført mellom analyser. For det andre er det av største viktighet at alle Behaviors er scoret riktig. For å sikre dette, er alle analyser filmet for å tillate flere visninger, og for flere treningsmuligheter. En enkelt trent målet kan måle fiskens atferd, men treningen tar litt tid. Hvis en forsiktig treningsperiode ignoreres, da tilliten til resultatene av atferdsstudie er lav. En nøye studie med lave utvalgsstørrelser utført av en godt trent observatør er kraftigere enn en studie med høy utvalgsstørrelsen utført av en dårlig trent observatør. Endelig er også kritisk kvalitetskontroll av de innsamlede data. De som blir gjort for å randomisere enkeltpersoner, og fjerne fordommer bør resultere i brukbare, pålitelige data, og datatransformasjoner er anbefalt for preprosessering henhold til de spesifikke statistisk test (se protokoll). Hvis disse trinnene ikke er nøye gjort, kan utgangen av analysene ikke være pålitelig tolke.
Som tidligere nevnt, er den teknikk som tungt modifiser according til de spesifikke teste hypoteser. Det finnes andre atferds målinger som kan undersøkes for å være relatert i et atferdssyndrom blant en rekke ulike fiskearter 39-41. Mens grunnsetningene i protokollen forblir den samme, kan de konkrete spørsmålene enkelt endres for å tillate mangfoldig hypotesetesting. For eksempel kan en forsker bruker den nevnte protokoll for å teste for tilstedeværelse av en aggresjon og utforskende aktivitet atferdssyndrom i sebraciklide (amatitlania nigrofasciata). Spørsmålet er beslektet, men studien organisme er forskjellig fra det som er beskrevet av protokollen. Men den generelle fremgangsmåten forblir stort sett den samme. Enkeltpersoner må være randomisert og spores gjennom en rekke tester, med akklimatiseringen perioder i mellom analyser, må vannet være konsekvent og frisk, og forskeren skal være riktig trent. En stor forskjell er atferd som blir målt er sannsynlig å endres i henhold til spesiFIC-analysen, og de atferds foreninger kan endres i henhold til de spesifikke arter og originalt miljø.
Begrensningene i protokollen er knyttet til noen av de tradisjonelle usikkerheten i atferdsstudier. Spesielt hvis analysene er scoret unreliably så er det sannsynlig tolkninger av funnene er feilaktige, og det ville være vanskelig å identifisere denne feilen. For å overvinne denne begrensningen, er det mulig at to veltrente scorers observere atferd. For å vurdere deres pålitelighet, beregne intra korrelasjonskoeffisienter på målinger anvendt på den samme fisk, og, om nødvendig, justere for forskjeller. Alternativt, hvis tilgjengelig, automatisk sporing programvare som Ethovision kan gjennomføres og godkjennes av en godt trent observatør for å øke gjennomstrømningen og nøyaktighet 42. Videre er det forskjellige mulige tolkninger om navngiving og scoring av "dristighet" atferd. andre studierhar kalt oppførselen beskrevet 43 og andre har beskrevet oppførselen som "utforskende" 44,45. I vårt arbeid virkemåten ble beskrevet som "dristighet" som det ble måling av oppførsel i et miljø ukjent for den sentrale individ. Imidlertid, mens begrepet kan være gjenstand for alternative tolkninger, dette påvirker ikke protokollen eller analysen. I tillegg, mens vi forvente målinger innenfor mot og aggresjon analyser for å være sterkt korrelert innenfor en befolkning, er det sannsynlig å være noen tilfeller av lav eller ingen korrelasjon av enkelte atferd. Denne begrensningen overvinnes ved styrken av den PCA, fordi det tastene i den viktige kilder for variasjon og, selv om målingene ikke er korrelert, vil analysen trekke atferdsmessige variasjon konsekvent i de innsamlede dataene. Til slutt, som er tilfellet med alle vitenskapelige metoder, dersom protokollen er allment vedtatt og er konsekvent utføres ved flere laboratorier, og det er noenuforutsett, umålt forvirrende introdusert av protokollen, så er dette potensialet skadelig element vedvarer i litteraturen, og det blir vanskelig å demontere. Farmakologisk bekrefter at en representant sett av analyser lokke fram den tilsiktede atferdsrespons krever en mer grundig forståelse av atferdsmessige, nevrologiske og hormonelle reaksjoner. Atferdssyndromer kan bidra til å forklare grunnlaget for atferd, men dette laboratoriet begrensning kan være i stand til å være mer regelmessig opp i fremtidige studier. Ikke desto mindre resultater er gitt som validerer bruk av denne protokollen i sebrafisk, og, med egnede modifikasjoner kan protokollen bli utvidet til en rekke hypoteser i en rekke forskjellige fiskearter. Ved nøye å følge en detaljert protokoll for boliger, utvelgelse og testing av ulike behaviorally parametre vil gjøre forskerne til å gjøre mer spesifikke sammenligninger på tvers av et bredt spekter av studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
