Abstract
Поведенческий синдром существует, когда определенное поведение взаимодействуют в разных контекстах. Данио были подопытные в недавних исследованиях, и важно, чтобы стандартизировать протоколы для обеспечения надлежащего анализа и интерпретации. В наших предыдущих исследованиях, мы измерили дерзновение, контролируя ряд поведения (времени вблизи поверхности, задержки в переходах, число переходов и дартс) в 1,5 л трапециевидной бак. Кроме того, мы количественно агрессию наблюдающих укусов, боковые дисплеи, дартс и время возле наклонной зеркала в прямоугольный 19 л бак. Разделив 76 л бак на три, мы также рассмотрели обмеления предпочтения. Анализ обмеление является высоко настраиваемый анализ и может быть адаптирована для конкретных гипотез. Тем не менее, протоколы для данного анализа также должны быть стандартизированы, но достаточно гибкой для настройки. В предыдущих исследованиях, торцевые камеры были либо пусты, содержат 5 или 10 данио или 5 жемчужные данио (Д. albolineatus). В ВОЛПмычание рукопись, мы представляем подробный протокол и репрезентативных данных, которые сопровождают успешного применения протокола, что позволит для репликации поведенческих экспериментов синдрома.
Introduction
Существует растущее тело литературы исследования ассоциаций между различными поведения внутри отдельных животных из данной популяции. Эти ассоциации называются поведенческие синдромы, а измерения обычно включают в себя смелость, агрессивность, исследовательское поведение и коммуникабельность 1-5. Поведенческие синдромы являются ценными для прямых и косвенных причин. Непосредственно, знание поведенческих синдромов может обеспечить более полное представление о теории эволюции, популяционной структуры и динамики популяций 3. Косвенно, знания о поведении ассоциаций может информировать поля, количественную оценку поведения , такие как фармакологию 6, 7 токсикологии, генетики поведения 8,9 и эндокринологии 10. Из-за этих прямых и косвенных выгод, повышенное знание поведенческих синдромов особенно ценно в наиболее часто используемых модельных организмов, таких как данио. Исследования с использованием данио найдены яна разнообразие дисциплин, включая анализ поведенческих синдромов 11-13. Для продвижения знаний в области поведенческих исследований синдрома, а также потому, что другие дисциплины также используют поведенческие измерения для проверки гипотез, надежные и емкие описания поведения необходимы для действительных анализов и интерпретаций и стандартизованных протоколов облегчит между ознакомительные сравнения внутри видов. Наш протокол был разработан для измерения дерзновение-агрессия-обмеления поведенческий синдром в популяции лабораторных выращенных данио 14. Тем не менее, в основе протокола (отслеживание отдельных рыб, обеспечение надлежащего рандомизации, и соответствующие анализы) могут быть легко изменены для различных альтернативных поведенческих мер. Кроме того, смелость, агрессивность, или обмеления анализы могут выполняться индивидуально для тестирования различных гипотез. Поэтому, в то время как наша цель, чтобы описать, как провести исследование поведенческих синдрома и протокол для успешной индивидуальной лEvel поведенческое измерение, каждый аспект этой процедуры может стоять отдельно.
В литературе по поведенческим синдромов охватывает несколько таксономических групп, от членистоногих к человеку 4, и для того , чтобы измерить поведенческого синдрома, по крайней мере , два поведенческие контексты должны быть определены количественно. К сожалению, часто мало последовательности в анализах, которые используются для количественного определения поведенческого измерения поперек осей поведения. Например, в рыбе, дерзновение может быть измерена с помощью T-лабиринту анализы, открытые полевые анализы, или введение романа или иностранного стимула 15. Агрессивность исследования в рыбе может включать в себя диады взаимодействия, видео стимула анализы или глины модели анализов 12,16,17. Подобным же образом, анализ поведения мелеющий, который обычно включает измерение shoalmate предпочтения, могут быть выполнены в различных типах резервуаров, с различными методами для определения временной ассоциации 21-23. В этом протоколе конкретное подмножество Overaповеденческий анализ Л.Л. репертуар представлен. В частности, этот протокол представляет методологию для отслеживания людей через смелостью, агрессии и обмеления анализов таким образом, что облегчает сравнение внутри отдельных лиц, чтобы определить, являются ли сравнения согласуются во всех особей в пределах популяции. Мы выполнили этот протокол с данио и арестантских цихлид (Amatitlania nigrofasciata) в предыдущих исследованиях 14,18, и он будет работать с любым же размера пресноводных рыб.
Дерзновение анализы проводили в 1,5 л трапециевидной бак, который имеет горизонтальную линию очерчивания равные по размеру области, в верхней и нижней частях бака. Количественные модели поведения включают число переходов с помощью теста рыбы между верхней и нижней части резервуара, время, проведенное в каждой порции, количество дротиков, а также задержки, чтобы войти в верхнюю часть. Анализ агрессии производится в 19L прямоугольной резервуар, который включает3 дюйма х 5 дюймов зеркало наклонены приблизительно 22 ° , расположенные в нижнем левом углу резервуара 19. Количественные модели поведения включают в себя общее количество времени , затрачиваемое целевой рыбы , взаимодействующей с зеркалом 20, наряду с конкретными агрессивными показателями - количество укусов, боковые дисплеи, дартс между тестовым рыбы и ее отражение. Для этих конкретных показателей, укусы определяются как быстро выпады в сторону зеркала с открытым ртом, боковые дисплеи определяются как сжиганию боковая, грудные, анальных и спинных плавников в сторону зеркала, и дартс любые беспорядочные движения, которые не направлен к зеркалу. И, наконец, анализ обмеление квантифицирует поведение тест-рыб в центральной камере три-камерные танка. Боковые камеры резервуара являются либо пустыми, либо содержать "мишень" косяк рыбы, а время тест рыба проводит вблизи каждой боковой камеры измеряется 21-23. Один составной показатель, называемый СтренGTH из Шаолинь (КНС), рассчитывается для каждого отдельного теста рыбы, определенной на раздражители, и могут быть использованы в анализе ниже по течению 14. Все модели поведения оцениваются одним зрителем или нескольких зрителей с помощью бесплатного программного обеспечения поведенческого квантификации известный как JWatcher 24.
Тестирование на наличие поведенческого синдрома, прежде всего , статистический стремиться, и желательно , чтобы следовать рекомендациям, представленные Budeav 2010 25. В частности, рекомендуется провести анализ главных компонент (PCA) на сосредоточенных и нормированных данных , в которых входы векторы поведения индивидуума в анализах с несколькими поведенческими измерениями (т.е., смелостью и агрессии). PCA, выполненный на корреляционной матрицы, уменьшает размерность поведенческих измерений, и, таким образом извлекает наиболее важные знания, что объясняет большую часть вариации. Извлеченные компоненты затем могут быть интерпретированы БАВред на высоких нагрузках фактором для индивидуального поведения процентных ставок и регрессии оценки могут быть извлечены для каждого человека на основе пояснительных компонентов. Эти оценки регрессии можно затем сравнить с измерением SoS и других различных не-поведенческих измерений, таких как размер рыбы или пола.
Этот рабочий процесс был реализован при изучении данио поведенческих синдромов , в которых был обнаружен секс специфический поведенческого синдрома , который существует между смелостью и обмеления 14. В этой ситуации смелее данио мужчины более склонны ассоциировать с более крупными, более агрессивные виды (D. albolineatus), но эта связь теряется у самок. Этот рабочий процесс был также реализован в исследовании молоди цихлид каторжной родственников (Amatitlania nigrofasciata) 18 , в котором поведенческий синдром не был обнаружен, потенциально указывает на поведенческую пластичность вида. Таким образом, следующий протокол представлен WIth с целью оконтуривания природы трех конкретных анализов (дерзость, агрессивность, и обмеления) в рамках изучения в поведенческого синдрома индивидуальном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующие методики для жилищного строительства, ухода и исследования данио были одобрены университета IACUC Святого Иосифа.
1. рерио жилье и уход
- Получить предмет данио от местного поставщика, или из пойманных населения. Пожалуйста, обратите внимание, что размещение данио подлежит директивам IACUC и дополнительных разрешений, необходимых для жилищного пойманных населения.
- Выявление и отдельный данио по половому признаку. В качестве альтернативы, пропустить этот шаг или заменить другим методом разделения на основе исследования гипотезы.
Примечание: половые признаки трудно определить в данио, особенно у женщин. Обратитесь к этим рекомендациям 10 или полезные интерактивные руководства отличить секс. - Случайным образом разделить население дополнительно в соответствующее отношение фокусного рыбы стимул рыбы. Примечание: Focal рыбы испытуемые следовали через серию behavioанализы, RAL и стимул рыбы являются физические лица, которые будут занимать раздражителя камеры в агрессии и обмеления анализов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Традиционно, от 1 до 5 особей на раздражитель фокальной рыбы в обмеления анализах и 1: 1 стимул: светосила рыбы в агрессии анализах 14,17 используются. Тем не менее, исследователь должен специально разработать исследование с гипотезой в виду (то есть, должно стимул рыбы оставаться постоянной , чтобы поддерживать согласованность в фокальной поведения рыб, или должны стимул рыбы быть повернуты между каждым анализом , чтобы обеспечить надлежащее рандомизации). - Храните всю рыбу в данио жилищных стойках (27.5-28.5 ° C) под строгим 12:12 циклом свет / темнота. Подача всех фокусных и раздражитель рыбы чешуйчатый пищу ежедневно и еженедельно артемии, на не-исследовательских дней.
- Убедитесь , что все тестирование проводится между ZT1 и ZT5 (время zeitgeber) , чтобы избежать циркадного ритма эффектов 26.
2. Рандомизация и Tank установки
- Randomize всех индивидов априори определенной последовательности поведенческих анализов. Настройка последовательной схемы рандомизации с использованием онлайн - генератор случайных последовательностей 27 или генератор случайных последовательностей из статистического пакета программного обеспечения (R).
- Добавьте описание каждого анализа от 1 до 3 и держать это задание последовательно. Назначают случайную последовательность для каждого человека и отображают последовательность в соответствии с поведенческой наклейке анализа. Например, в течение трех полных анализов (1, отображенных в Шаолинь, 2 отображенной в дерзновением и 3, отображенных в агрессии), данное лицо может иметь рандомизированное последовательность '2,3,1', который будет требовать от них, чтобы выполнить конкретный поведенческие тесты в указанной последовательности.
- Проводите анализ танков (дерзость, агрессивность, и обмеления) в лаборатории в тех местах, которые сводят к минимуму возможность неблагоприятных внешних раздражителей и быть уверены, чтобы иметь достаточно места для видеокамеры, чтобы захватить весь бак. Убедитесь, что видеокамера enougч ясность для просмотра танковые этикетки, а также быть в состоянии различить тонкие поведения фокальной рыбы и установки видеокамеры в этом положении.
- Запишите все поведенческие анализы с помощью камеры, поддерживаемой в том же положении, с полным учетом указанного резервуара, чтобы свести к минимуму непреднамеренные различия в поведенческой скоринга в результате дифференциальных записей.
Примечание: Избегайте размещения резервуаров в тяжелых торговли районах, а также двери, как движение и звук будет влиять на поведение данио. - Создание уникальных JWatcher протоколов 24 для оценки каждого поведенческого анализа. Обратитесь к руководству JWatcher, чтобы узнать, как создать координационные мастер-файлы, чтобы назначить поведение на нажатие клавиш и очаговых файлов анализа для обобщения собранных данных.
Примечание: JWatcher является поведенческая программа подсчета очков , что позволяет надежно и многократно подгонять поведенческого скоринга 24. - Определить схему маркировки для отслеживания даты, количество рыбы, и количество анализа для всех поведенческих анализов (например,'F5-B-123115' подразумевая Рыба 5, Смелость анализ, на 31 декабря 2015 - го,) и разметить снаружи цистерны с лентой в поле зрения и в фокусе камеры. Хранить и записывать эту информацию в лаборатории ноутбук для быстрого ознакомления и дальнейшего контроля качества.
- Установите бак акклиматизации, который будет использоваться между всеми анализами, а также непосредственно после того, как отдельные лица удаляются из корпуса стойки.
Примечание: акклиматизации цистерны и терминальные цистерны небольшие аквариумы (40 см х 20 см х 25 см) с гравием и фильтр, который близко напоминают корпуса стойки. - После того, как анализы все завершено, передача индивида в отдельный резервуар терминала, который будет служить в качестве конечного резервуара назначения для всех используемых фокусных лиц. Используйте танк , который является достаточно большим , чтобы вместить группу лиц на оставшуюся часть своей жизни (например, 25 галлонов).
Примечание: Очень важно поддерживать последовательные и одинаковые температуры и состояния воды ACROSs все танки. Это включает в себя корпус, акклиматизацию, и все танки тестирования.
3. Проведение Агрессия Пробирной
- Проведение анализа агрессии в 19 л прямоугольного резервуара измерения 30 см х 15 см х 10 см. Оборудуйте бак во внешних непрозрачных перегородок, окружающих с трех сторон агрессии резервуара, оставляя переднюю открытую для просмотра, чтобы уменьшить нежелательные внешние раздражители. Разделите бак с внешней маркировки на четыре равные прямоугольные квадранта и закрепить зеркало на постоянной основе (с силиконовым затыкают) в нижнем левом квадранте, наклоненной под 22,5 ° образуя прямоугольный треугольник против дальней левой стороне бака.
- Убедитесь, что температура воды в баке акклиматизации и агрессии бак находится в пределах 2 ° C от корпуса стойки. Для этого были свежее, в возрасте от воды, предварительно подогревают до 27.5-28.5 ° С готовы добавить к агрессии бак. Обратите внимание, что важно, чтобы изменить воду между каждого анализа исключить необоснованноеобонятельные сигналы.
- Перевод, кровопускание, фокусного рыбу из корпуса стойки в отдельный акклиматизации резервуар, где он будет акклиматизироваться в течение 10 мин.
Примечание: Важно, чтобы уменьшить стимулы, введенные для рыбы из-за неправильного обращения с ним. Передача лица , как описано ранее 27.- В частности, вручную и аккуратно поместите маленькую прозрачную пластиковую чашку в бак интерес. Не нарушая рыбы столько, сколько передачи, используя сеть, медленно выкопать рыбу в чашку.
- Убедитесь, что видеокамера готова к записи, подтвердив, что агрессия анализа бак (см шаг 3.1) находится в фокусе и непосредственно перед передачей индивида в агрессии танка, пресс-записи на устройстве. Передача фокусного рыбы через кровопускание из акклиматизации бака агрессии бака.
Примечание: Важно, чтобы записать до рыбы, поступающей в бак агрессии отслеживать точное время записи. - Запись Aggression бак в течение 10 мин и 30 сек, а затем чашка фокусного рыбы от агрессии бака обратно в бак акклиматизации.
- При просмотре записи, подождите 30 секунд после того, как рыба была введена в бак в качестве дополнительного периода акклиматизации до голевых поведений.
- Используя систему подсчета очков JWatcher, определенный для агрессивного поведения, количественно следующие модели поведения в течение 10 мин: время, проведенное рядом с зеркалом, количество зеркальных подходов, количество стрел, количество попыток укусов (открытие рта в направлении зеркала), а также количество боковых дисплеев (спинные, грудные, анальный, и монтаж хвостового плавника) 9.
- Оценка единого анализа агрессии, по крайней мере в два раза, пока анализ не забил с высокой степенью согласия между витками.
4. Проведение смелостью Пробирной
- Проведение анализа дерзновение в небольшой 1,5 л трапециевидной бак, размером 15 см высотой х 26,5 см х 22,5 верх см Ширина нижней х 6 см. Оберните непрозрачную бумагу вокруг всех сторон ое цистерны, но оставить переднюю открытую для просмотра. Одиночные, тонкий кусочек ленты с наружной стороны корпуса, чтобы разграничить верхнюю от нижней части резервуара.
- Убедитесь в том, что температура воды в резервуаре смелостью находится в пределах 2 ° С корпуса стойки (см шаг 3.2)
- Передача фокусного рыбы из корпуса стойки к акклиматизации бака (см шаг 3.3), и пусть акклиматизироваться в течение 10 мин.
- Убедитесь, что видеокамера готова к записи анализа смелостью и после того, как готов передать фокусного рыбу, нажмите запись на устройстве. Передача фокусного рыбы из акклиматизации бака в бак смелостью и записи в течение 8 минут и 30 секунд.
- При просмотре записи, позволяют еще в течение 30 сек периода акклиматизации после того, как рыба вводится в бак перед скоринг.
- Использование ПО JWatcher, количественно поведение смелость в течение 8 мин. В частности, количественно оценить следующие варианты поведения: времени вблизи поверхности, время задержки, чтобы ввести верхнюю часть, количество траnsitions в верхней части, и количество беспорядочных движений (дартс) 29.
- Оценка единого анализа смелости, по крайней мере в два раза, пока анализ не забил с высокой степенью согласия между витками.
5. Проведение обмеления Пробирной
- Проведение анализа обмеления в 76 л бак, который имеет три отсека, разделенных двумя стеклянными перегородками залиты силиконовым затыкают (результирующие три отсека состоит из двух стимулов зон и одного центрального отсека). Внешне, отметьте две привилегированные зоны , обозначенные 6,35 см от каждого из стеклянной перегородки стимула зон ", что указывает на два тела Длины 30. Применение непрозрачные перегородки снаружи вокруг трех сторон обмеление резервуара, но оставить переднюю открытую для просмотра.
Примечание: Это предпочтение зона может быть настроена для проверки конкретных гипотез для разных видов размеров. - В зависимости от характера исследования, выберите стимула косяки акклиматизироваться в течение по крайней мере 12 часов BEFORе тестирования и оставаться в обмеления баке на протяжении всего эксперимента.
Примечание: Стимул отмели представляют собой наборы отдельных рыб, которые используются для оценки того, как фокусное рыба ведет себя в присутствии или отсутствии этих отмелей. Различные комбинации стимула Shoal могут быть выбраны, чтобы проверить ряд разнообразных мелеющий гипотез. Убедитесь, что стимул косяки вращаются между каждой зоны стимула, чтобы избежать бокового смещения и также могут акклиматизироваться в течение по крайней мере 12 часов перед испытанием. - Перенести фокусного рыбу в акклиматизации резервуар, как описано выше (см 3.3)
- Перевод, кровопускание, фокусного рыбу из промежуточного резервуара акклиматизации в центральный отсек в обмеления баке.
- Разрешить в течение 10-минутного периода акклиматизации до 10 мин периода наблюдения живой забил. В качестве альтернативы, запись обмеление анализы и оценка позже с помощью JWatcher. Рыба определяются быть мелеющий, когда они находятся в пределах привилегированной зоны в камережилье целевой косяк.
- Количественно время, проведенное в каждой зоне предпочтений и времени, затраченного в объеме центра.
- В качестве дополнительной меры описательной, вычислить 'силу обмеления' (СЦ). Присвоить значение между -1 и +1, где величина описывает, как часто отдельные косяки рыб.
- Рассчитывают соотношение времени, затраченного обмеления, деленное на площади обмеления зон и вычесть соотношение количества времени, затраченного не обмеления и площадь не-обмеления зон. Поместите эту величину по сумме времени, затраченного в каждой зоне, деленная на объем каждой зоны в отдельности. Более подробную информацию об этом расчета можно найти в предыдущем исследовании 14.
6. Контроль качества данных
- Анализ данных с использованием традиционных инструментов анализа данных 31-32.
- Тест на однородность дисперсии с использованием непараметрического теста Levene для всех форм поведения. Если поведение является неоднородным выполнить лог-преобразование33.
- Убедитесь , что нет последовательности эффектов (то есть, что порядок рандомизации не влияет на поведение физических лиц ") с использованием Крускала-Уоллиса ANOVA на однородных данных 34.
- Убедитесь , что нет никаких побочных уклоны для анализа обмеления путем создания унивариантный общие линейные модели на индексы Сос со стороной в качестве фиксированного фактора 35.
Примечание: При наличии практически нет проблем с данными, вниз по течению анализ может быть проведен. Если есть вопросы, согласовать с дополнительными преобразованиями, рационализировать с биологически правдоподобные объяснения, и / или увеличить размер выборки.
7. Анализ данных
- Вычислить двухвостый Спирмен ранговые корреляции 36 для всех поведения отдельно в пределах смелостью и агрессии анализов.
- Вычислить внутриклассовых коэффициенты корреляции (ICC) в качестве двусторонней смешанной модели с последовательностью поведенческих анализов, которые были проведены более одного тиме для данного индивида 36. В этой установке ICC является измерение того, как последовательно рыбы вели себя в данном тесте измеряется более чем один раз.
- Предварительная обработка смелостью и агрессивность поведения по центрирование и нормирование все типы поведения , чтобы подготовиться к входу к анализу главных компонент (PCA) 25.
Примечание: Предварительная обработка результатов измерений с помощью центрирования и нормированием является жизненно важным шагом. Без этой предварительной обработки ступенчатых поведения, которые происходят с большей частотой и более переменно будет чрезмерно влиять на интерпретацию извлеченных компонентов. Процесс центровки и нормированием удалит эту предвзятость. - Выполните PCA с корреляционной матрицей, чтобы определить, является ли дерзость и агрессия связаны друг с другом как поведенческого синдрома. Интерпретировать поведенческие нагрузки каждого компонента значим на> 0,6. См Будаев 2010 24 для всеобъемлющего руководства по отчетности РСА для изучения поведения. Осыпи сюжет будет информативен, на котором eigenvectors должны быть сохранены для интерпретации.
- С помощью статистического пакета программного обеспечения , таких как R или SPSS 31,32, извлекать оценки для каждого компонента для каждого индивидуума. Оценки представляют, насколько поведение данного индивида может быть объяснено конкретным компонентом.
- Вычислить ранг Спирмена корреляции между фактором регрессии и оценки прочности мелел 36.
Примечание: поведенческий синдром считается, если присутствует смелость и агрессивность поведения нагрузки на том же компоненте или, если какой-либо компонент со значительными интерпретируемых нагрузок коррелирует с силой обмеления. Кроме того, обратите внимание, что сила обмеления не входит в РСА для обеспечения лучшего интерпретации более сложных поведенческих количественными (смелостью и агрессии). PCA будет ортогонально разрушаться дерзновение и агрессии в особенности собственных векторов, чтобы максимизировать количество объяснимых колебаний и хорошо подходит для этих сложных измерений. толкованияв результате собственных векторов и регрессирует наши силы измерений обмеления на каждом из них дает гораздо более интуитивным интерпретацию того , как каждый из сложного поведения (смелостью и агрессии) связаны с более четко определенной измерения двоичный обмеления (т.е. рыба мелел или не мелел).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В зависимости от характера исследования и конкретного протокола, используемого, несколько различных результатов возможны в поведенческих синдромов эксперимента. В приведенных ниже таблицах и цифры, где указаны, взяты из нашего предыдущего исследования , опубликованного в журнале Поведенческие процессы 14 и журнал Zebrafish 17. Когда предложение (как описано выше) осуществляется в полном объеме, два набора результатов, ' в пределах анализа корреляций' и 'между анализа корреляций,' , как ожидается , (рис 1).
Первый набор результатов описывает в последовательности анализа. В частности, результаты описывают , как поведение соотносятся друг с другом в рамках анализа смелостью и в анализе агрессии по отдельности. В таблицах 1 и 2 описывают то , что эти соотношения должны выглядеть для смелостью и AGгрессированием анализы и данные , представленные адаптированы из предыдущего исследования 14. Для анализа смелостью, ожидается, что количество переходов и времени, проведенного в верхней части резервуара положительно коррелируют, но задержки, чтобы войти в верхнюю часть отрицательно коррелированными. Типичные результаты для лиц , измеренных на оси смелостью поведения в дерзости резервуаре (см шаг 4.1) приведены в таблице 1. Для анализа агрессии, то ожидается , что укусы, боковые дисплеи, и время , проведенное рядом с зеркалом все связаны между собой . Типичные результаты для лиц , измеренных на оси агрессии поведения в агрессии бака (см шаг 3.1) приведены в таблице 2. Дартс как правило , не коррелирует с агрессивным поведением , хотя в некоторых случаях, неагрессивные рыбы , как правило, бросаются (отсюда отрицательную корреляцию ). И наконец, Сила обмеления (СЦ) измерения для анализа обмеления обеспечивает измерение индивидуально-уровня обмеления тendency. Обмеление водоемов является весьма повторяемые поведение в различных анализах обмеления при измерении с использованием SoS (ICC = 0,641) 14 и некоторые из наших предыдущих исследований подтвердили поведение обмеления в данио 23,38. Так как все люди будут измеряться для каждого из поведения, мы можем вычислить Спирмена корреляции через эти поведения и ожидать, что некоторые формы поведения, коррелируют, как это определено для данио в представительных результатов.
Вторая часть результатов исследует наличие поведенческого синдрома. Результаты интегративного анализа всех поведения в количественной оценке смелостью и агрессии поведенческая анализов суммированы с использованием анализа главных компонент (PCA). Там должно быть от двух до четырех интерпретируемые компоненты, основанные на высоких нагрузок для каждого поведения. Если один собственный вектор, который объясняет большую часть вариации включает в себя модели поведения как со стороны смелостью апD агрессии анализы, то поведенческого синдрома наблюдалось. Однако, если поведение от смелостью и агрессии анализов не перекрывают друг друга на одном собственный вектор, то исследование не описывает поведенческий синдром. Типичные результаты представлены на отсутствие дерзновение-агрессии поведенческого синдрома (рис 2). В этом примере компонент 1 является наиболее сильно представитель агрессии поведения в то время как компонент 2 наиболее сильно связан с дерзновением поведения. Поскольку агрессия и смелостью поведения не представлены одним и тем же компонентом, можно сделать вывод, что есть отсутствие дерзновение-агрессии поведенческого синдрома (смелостью векторы примерно ортогональным к агрессии векторов). Кроме того, эти модели поведения не зависит от пола, потому что картина распределения та же между мужчинами и женщинами. Для того, чтобы наблюдать, если смелостью или агрессии поведения связаны с обмеления, извлекаемые регрессии оценки для каждой рыбы коррприподнятое с измерением SoS рыбы. Важно обеспечить, чтобы любые коррелирующие компоненты фактически описывая интерпретируемые набор поведения. Если есть высокие абсолютные значения корреляции Спирмена между любым компонентом и измерением обмеления, то мелел поведенческий синдром присутствует. Независимо от конкретных результатов, важно, чтобы обеспечить возможные биологические интерпретации для всех наблюдений. Типичные результаты представлены для описания дерзости-мелел поведенческий синдром (таблица 3) 14. В то время как данные, представленные представляют собой типичные результаты для данио рерио, они не должны быть интерпретированы как измерения качества данных. Есть несколько причин, по которым данные будут выглядят по-разному в различных экспериментах, таких как виды или различия населения.
Рисунок 1. Предлагаемыйрабочий процесс для смелостью, агрессии, и мелел поведенческий эксперимент синдромов. Типичные измерения приведены для каждого анализа. Схема того , как анализировать анализы по отдельности , а затем , как интегрировать анализ также указан. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Типичные результаты РСА , указывающие , что дерзновение-агрессия поведенческого синдрома отсутствует. Красные векторы указывают виды поведения , которые вносят вклад в баллами компонент (левая и нижняя оси) , а точки представляют собой индивидуальные баллы вдоль каждого компонента (правый и верхние оси ). Самцы представлены синими точками и самки представлены зелеными точками. Обратите внимание, что 'неустойчивое поведение »относятся к« дротики »и«Скорость агрессии» может быть вычислена путем добавления количества укусов и боковых экранов , деленное на общее время , взаимодействующей с зеркалом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Переходы | Задержка | Дартс | ||||
| ᴩ | п | ᴩ | п | ᴩ | п | |
| Поверхностный Время | 0,65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0,42 | 0,007 * |
| Переходы | -0,40 | 0,012 * | 0,33 | 0,041 * | ||
| Задержка | -0,47 | 0.002 | ||||
| * Α <0,05 |
Таблица 1:. Смелость Спирмена ранга корреляции в анализе романа танкового Эта таблица была изменена с пути и др., 2015.
| Боковые дисплеи | Дартс | Зеркало Время | ||||
| ᴩ | п | ᴩ | п | ᴩ | п | |
| Укусы | 0,69 | <0,001 * | -0,10 | 0,547 | 0,63 | <0,001 * |
| Боковые дисплеи | -0,06 | 0.735 | 0,66 | <0,001 * | ||
| Дартс | -0,18 | 0.285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Таблица 2:. Агрессивность Спирмена ранг корреляции в анализе романа танкового Эта таблица была изменена с пути и др., 2015.
| ᴩ | п | |
| PCA Компоненты | ||
| Смелость | 0,339 | 0,035 * |
| Агрессия | 0.075 | 0,65 |
| дротик | -0,012 | 0,944 |
T в состоянии . 3: Использование компонентов PCA , чтобы подтвердить наличие обмеления и смелостью поведенческого синдрома , присутствующего в этой популяции Эта таблица была изменена с пути и др., 2015.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол будет определить, есть ли последовательные ассоциации в смелостью, агрессии и обмеления поведения в данио. Если существуют последовательные ассоциации в данной популяции между любыми из этих поведений, то поведенческого синдрома присутствует. Изучая естественный поведенческий синдром населения, исследователи могут иметь более полное представление о его поведенческой динамики, структуры населения, а также, возможно , эволюционной истории 3. Кроме того, манипулируя окружающей среды , которая влияет на эти поведенческие синдромы, как и в фармакологии, токсикологии 6 7, генетики поведения, 8,9 и эндокринологии 10 исследований, могут пролить свет на то, как различные факторы могут влиять на поведенческие ассоциации. Конкретный состав агрессии-дерзновение-обмеления поведенческого синдрома , найденного в этом протоколе охватывает общее поведение хорошо изучены в модели организма данио 11-13. Хотя этой методологиимогут быть применены к любым видам рыб, широкое применение для использования данио может помочь с междисциплинарной стандартизации этого протокола. Каждый анализ описанный выше, может быть более легко контролировать и манипулировать, чем другие аналогичные методы. Например, анализ агрессии использует наклонное зеркало , чтобы вызвать более широкий спектр реакций агрессии , а не с помощью живой или глиняную модель, видео стимул, или вертикальное зеркальное отображение стимула 17. Поведение , измеренные в анализе смелостью более легко поддаются количественной оценке , чем в Т-лабиринт или тест большой открытое поле 15. И, наконец, анализ обмеление описано может легко отслеживать физическое лицо, которое имеет важное значение для изучения поведенческих синдромов на индивидуальном уровне, и может позволить для неограниченного числа комбинаций целевых отмели, чтобы задать новые экспериментальные вопросы. Хотя этот протокол может быть изменен, чтобы приспособить различные поведенческие вопросы, стандартизация этого может привести к дальнейшему понимание о том, как ДНК, клеточный механизмS, сотовая развития, а также введены химические вещества могут влиять на индивидуальные и поведенческие синдромы.
Для того, чтобы быть уверенным, что наблюдаемые ассоциации являются истинными, протокол должен быть внимательно следил. По большей части, протокол является изменяемым в соответствии с конкретной гипотезы; Тем не менее, есть несколько шагов, которые должны быть выполнены для обеспечения достоверности результатов. Во-первых, важно, что лица, размещаются в соответствующем резервуаре, при оптимальных условиях (см протокол) и поступают правильно. Условия воды должны быть последовательными в жилищных стоек, акклиматизации танков и испытательных резервуаров. Если вода не соответствует, рыба будет занимать больше времени, чтобы акклиматизироваться к условиям, а также поведенческие измерения не будут должным образом захвачены. Важно также, что вода перерабатывается между смелостью и агрессии танков, так что искусственные запахи не переносятся между анализами. Во-вторых, крайне важно, чтобы все BehavIORS оцениваются должным образом. Чтобы обеспечить это, все анализы на видеопленку, чтобы позволить нескольким просмотрах, а также для нескольких возможностей для обучения. Один обученный бомбардир может точно измерить рыбы поведение, но обучение займет некоторое время. Если тщательный подготовительный период игнорируется, то доверие к результатам исследования поведенческих низка. Тщательное исследование с низкими размерами выборки в исполнении хорошо обученный наблюдатель является более мощным, чем исследования с высоким размером выборки, выполняемой плохо подготовленным наблюдателем. И, наконец, контроль качества собранных данных также имеет важное значение. Шаги, которые принимаются в случайном порядке лиц, а также удалить уклоны должны приводить к годные к употреблению, надежных данных и преобразования данных рекомендуются для предварительной обработки в соответствии с конкретным статистическим тестом (см протокол). Если эти шаги не будут тщательно сделано, то выход из анализов не может быть надежно интерпретированы.
Как упоминалось ранее, этот метод сильно модифицируемые соответнг до конкретных испытаний гипотез. Там существуют другие поведенческие измерения , которые могут быть исследованы , чтобы быть связаны в поведенческого синдрома у ряда различных видов рыб 39-41. В то время как принципы протокола остаются теми же, конкретные вопросы могут быть легко изменены, чтобы учесть разнообразные проверки гипотез. Например, исследователь может использовать вышеупомянутый протокол для проверки на наличие агрессии и исследовательской активности поведенческого синдрома в арестантских цихлид (Amatitlania nigrofasciata). Вопрос связан, но исследование организм отличается от той, которая описана в протоколе. Тем не менее, общие шаги остаются в значительной степени то же самое. Физические лица должны быть рандомизированы и отслеживали с помощью ряда анализов, с периодами акклимационный между анализами, вода должна быть последовательной и свежей, и ученый должен быть надлежащим образом подготовлены. Одним из основных отличий является поведение, измеряются, вероятно, изменятся в соответствии с КонкретнаяFIC анализа, а также поведенческие ассоциации могут меняться в зависимости от конкретных видов и исходной среды.
Ограничения протокола связаны с некоторыми из традиционных факторов неопределенности поведенческих исследований. В частности, если анализы забили ненадежно, то вполне вероятно, что интерпретации результатов являются ошибочными, и было бы трудно определить эту ошибку. Чтобы преодолеть это ограничение, то возможно, что два хорошо подготовленных бомбардиров наблюдать поведение. Для оценки их надежности, рассчитать коэффициенты корреляции внутриклассовых измерений, применяемых на той же рыбы, и, при необходимости, корректировки различий. В качестве альтернативы, если таковые имеются, программное обеспечение автоматического отслеживания таких как Ethovision могут быть реализованы и проверены хорошо обученным наблюдателем , чтобы увеличить пропускную способность и точность 42. Кроме того, существуют различные возможные интерпретации относительно наименования и озвучивание "смелостью" поведения. Другие исследованияназвали поведение описано 43 и другие описали поведение как "Поисковый" 44,45. В нашей работе поведение было описано как "смелостью", как это было измерения поведения в условиях незнакомой фокусному индивида. Тем не менее, в то время как этот термин может быть предметом альтернативных интерпретаций, это не влияет на протокол или анализа. Кроме того, в то время как мы ожидаем, что измерения в пределах смелостью и агрессии анализов будут сильно коррелировать в пределах популяции, есть, вероятно, будет некоторые случаи низкого до отсутствии корреляции некоторых форм поведения. Это ограничение преодолевается сила PCA, потому что ключи в важных источниках изменчивости и, даже если измерения не коррелируют, анализ будет извлекать изменение поведения последовательной в собранных данных. И, наконец, как в случае со всеми научными методами, если протокол повсеместно принят и последовательно осуществляется несколько лабораторий, и есть некотораянепредвиденное, неизмеренный вмешивающимся введен протоколом, то этот потенциал вредный элемент сохраняется в литературе, и становится трудно разобрать. Фармакологически подтверждение того, что представительный набор анализов вызывают намеченную поведенческой реакции требует более глубокое понимание поведенческих, неврологических и гормональных реакций. Поведенческие синдромы могут помочь объяснить основы поведения, но эта лаборатория ограничение может быть в состоянии быть более регулярно рассматриваться в будущих исследованиях. Тем не менее, результаты были предоставлены уже, что подтверждает использование этого протокола в данио рерио, и, с соответствующими изменениями, протокол может быть распространен на различные гипотезы в ряде различных видов рыб. Тщательно следуя подробный протокол для жилищного, отбора и тестирования различных параметров поведенчески позволит исследователям сделать более конкретные сравнения по широкому спектру исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M.
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
