Abstract
Een gedrags-syndroom bestaat wanneer specifieke gedragingen communiceren onder verschillende contexten. Zebravis zijn proefpersonen zijn de laatste studies en het is belangrijk voor protocollen standaardiseren goede analyses en interpretaties te garanderen. In onze eerdere studies, hebben wij vrijmoedigheid gemeten door het volgen van een aantal gedragingen (tijd buurt van het oppervlak, latency in transities, het aantal overgangen en darts) in een 1,5 liter trapeziumvormige tank. Ook gekwantificeerd we agressie door het observeren beten, laterale displays, darts, en de tijd in de buurt van een schuine spiegel in een rechthoekige 19 L tank. Door het delen van een 76 L tank in drieën, onderzochten we ook shoaling voorkeuren. De ondieper test is een zeer flexibele assay en kan worden afgestemd op specifieke hypothesen. Echter, protocollen voor deze test ook gestandaardiseerd, maar toch flexibel genoeg om maatwerk moet zijn. In eerdere studies, end camera's waren ofwel leeg, bevatte 5 of 10 zebravis, of 5 gouddanio (D. albolineatus). In de volgende manuscript, presenteren we een gedetailleerd protocol en representatieve gegevens die succesvolle toepassingen van het protocol, dat zal zorgen voor replicatie van gedragssyndroom experimenten te begeleiden.
Introduction
Er is een groeiende hoeveelheid literatuur onderzoek naar de relaties tussen verschillende gedragingen binnen de afzonderlijke dieren uit een bepaalde populatie. Deze verenigingen worden genoemd gedrags syndromen, en de metingen omvatten meestal onverschrokkenheid, agressie, verkennend gedrag en gezelligheid 1-5. Behavioral syndromen zijn waardevol voor zowel directe als indirecte oorzaken. Direct, de kennis van behavioral syndromen kan een completer beeld van de evolutietheorie, bevolkingsopbouw, en de populatiedynamiek 3 te bieden. Indirect kan kennis over behavioral verenigingen velden dat gedrag te kwantificeren, zoals farmacologie 6, toxicologie 7, gedragsgenetica 8,9 en endocrinologie 10 informeren. Door deze directe en indirecte voordelen, een grotere kennis van gedragsvariatie is vooral waardevol voor gangbare modelorganismen zoals de zebravis. Studies met behulp van de zebravis worden gevonden ina verschillende disciplines, met inbegrip van de analyse van de gedrags- syndromen 11-13. Om kennis in gedrags-syndroom onderzoek vooruit te helpen, en omdat andere disciplines ook gedrags-wetenschappelijke metingen voor het testen van hypothesen, betrouwbaar en beknopte beschrijvingen van gedrag nodig zijn voor valide analyses en interpretaties en gestandaardiseerde protocollen zal inter-studie vergelijkingen binnen soorten te vergemakkelijken. Ons protocol werd ontwikkeld om een vrijmoedigheid-agressie-shoaling gedragssyndroom in een populatie van-lab gekweekte zebravis 14 te meten. De basis van het protocol (tracking exemplaren, zorgen voor een goede randomisatie en passende analyses) kan eenvoudig worden aangepast voor verschillende alternatieve gedragsmaten. Bovendien kunnen vrijmoedigheid, agressie of ondieper assays individueel worden uitgevoerd voor het testen van verschillende hypothesen. Daarom, terwijl het is ons doel om te beschrijven hoe een gedrags-syndroom studie en het protocol voor een succesvolle individuele l uit te voerenevel behavioral meting kan elk facet van deze procedure alleen te staan.
De literatuur over gedragsvariatie omvat verschillende taxonomische groepen van geleedpotigen mens en 4, teneinde een gedragssyndroom meten, moet ten minste twee gedragsproblemen contexten worden gekwantificeerd. Helaas is er vaak weinig samenhang bij de testen die worden gebruikt om de gedrags meting over de assen van gedrag kwantificeren. Bijvoorbeeld in vissen, lef worden gemeten met T-doolhof assays, open veld assays, of introductie van een nieuwe of buitenlandse stimulus 15. Agressie studies in vis zouden kunnen dyade interacties, video stimulus assays, of klei model assays 12,16,17 betrekken. Ook analyse van ondieper gedrag dat gewoonlijk omvat het meten van shoalmate voorkeur kan worden uitgevoerd in verschillende reservoirs met verschillende methoden om associatie tijd 21-23 bepalen. In dit protocol een specifieke subgroep van de overall gedrags assay repertoire wordt gepresenteerd. Specifiek, dit protocol biedt een methode om individuen door moed, agressie en ondieper assays volgen op een manier die vergelijking mogelijk binnen individuen te bepalen of de vergelijkingen voor alle door individuen in een populatie. We hebben dit protocol met de zebravis en zebracichlide (amatitlania nigrofasciata) uitgevoerd in eerdere studies 14,18, en het zal werken met een vergelijkbare grootte zoetwatervissen.
Vrijmoedigheid testen worden uitgevoerd in een 1,5 liter trapeziumvormige tank die een horizontale lijn afbakening van gelijke grootte gebieden in de bovenste en onderste delen van de tank heeft. Gekwantificeerde gedrag zijn het aantal overgangen van de proefdieren tussen het bovenste en onderste gedeelte van de tank, de tijd doorgebracht in elk gedeelte, het aantal darts, en de latentie om het bovenste gedeelte voeren. Agressie test wordt uitgevoerd in een 19L rechthoekige tank die omvateen 3 inch x 5 inch spiegel een hoek van ongeveer 22 ° zich in de linkerbenedenhoek van de tank 19. Gekwantificeerde gedrag onder meer de totale hoeveelheid tijd die het doel vissen interactie met de spiegel 20, samen met specifieke agressieve indicatoren - aantal beten, laterale displays, darts tussen de test vis en zijn gedachtengang. Voor deze specifieke indicatoren, worden beten gedefinieerd als snel lunges in de richting van de spiegel met een open mond, zijn laterale displays gedefinieerd als het affakkelen van de laterale, borstvinnen, anale en rugvinnen in de richting van de spiegel, en darts zijn eventuele onregelmatige bewegingen die zijn niet gericht naar de spiegel. Ten slotte is de ondieper assay kwantificeert het gedrag van een test vis in het centrum kamer van een tri-chambered tank. Zijkameren van de tank zijn ofwel leeg, of bevat een "target ondiepte" van vis, en de tijd die de test vis besteedt in de buurt van elke kant kamer wordt gemeten 21-23. Een enkele samengestelde score, aangeduid als Strength van ondieper (SOS), wordt berekend voor elk afzonderlijk proefdier specifiek zijn voor de stimuli, en kan in stroomafwaartse analyses 14. Alle gedragingen worden gescoord door een enkele kijker of meerdere kijkers met behulp van gratis behavioral kwantificering software bekend als JWatcher 24.
Het testen van de aanwezigheid van een gedragssyndroom voornamelijk een statistisch inspanning en is het raadzaam om de richtlijnen zoals door Budeav 2010 25. Specifiek is het raadzaam om een principale componenten analyse (PCA) uitvoeren op gecentreerd en genormeerd gegevens waarin de ingangen zijn de vectoren van het gedrag van een individu in testen met meerdere gedrags-wetenschappelijke metingen (dat wil zeggen, durf en agressie). De PSO, uitgevoerd op een correlatiematrix, vermindert de dimensionaliteit van de gedragsmaten en haalt dus de meest belangrijke kennis dat een meerderheid van de variatie verklaart. De geëxtraheerde componenten kan vervolgens worden uitgelegd based op hoge factorladingen het individueel gedrag plaats en regressie scores kunnen worden verwijderd voor elke persoon op basis van de verklarende componenten. Deze regressie scores kunnen dan worden vergeleken met de SOS-meting en andere non-gedragsmatige metingen zoals vis grootte of geslacht.
Deze workflow is in een studie van zebravis behavioral ziektebeelden waarbij een sex specifieke gedrags-syndroom dat bestaat tussen durf en shoaling 14 werd ontdekt geïmplementeerd. In deze situatie, bolder zebravis mannetjes vaker associëren met een grotere, agressievere soorten (D. albolineatus), maar deze associatie is verloren bij vrouwen. Deze workflow werd eveneens uitgevoerd in een studie van jonge zebracichlide kin (amatitlania nigrofasciata) 18, waarin een gedrags-syndroom niet werd ontdekt, die mogelijk wijzen op behavioral plasticiteit van de soort. Daarom wordt het volgende protocol voorgesteld wet een doel van de afbakening van de aard van de drie specifieke assays (onverschrokkenheid, agressie, en ondieper) in het kader van het bestuderen van een individueel niveau behavioral syndroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De volgende methoden voor de huisvesting, zorg, en de studie van zebravis zijn goedgekeurd door de Saint Joseph's University IACUC.
1. zebravis Wonen en Zorg
- Het verkrijgen van het onderwerp zebravis van een lokale leverancier, of uit het wild gevangen populaties. Houdt u er rekening mee dat de huisvesting van de zebravis is onderworpen aan IACUC richtlijnen en aanvullende vergunningen nodig zijn voor de huisvesting van het wild gevangen populaties.
- Identificeer en aparte zebravis naar geslacht. Als alternatief, deze stap overslaan of vervangen door een andere manier van de scheiding op basis van de studie hypothese.
OPMERKING: geslachtskenmerken moeilijk om, zebravis, vooral bij vrouwen. Raadpleeg deze richtlijnen 10 of handige online handleidingen om seks te onderscheiden. - Willekeurig scheiden de bevolking verder in de juiste verhouding van focale vis tot stimulus. Opmerking: Focal vissen zijn de proefpersonen gevolgd worden via de reeks van behavioral assays en stimulus vissen zijn de mensen die de prikkel kamers in de agressie en shoaling assays zal bezetten.
LET OP: Traditioneel, tussen 1 en 5 stimulus vis per focal vis in shoaling assays en een 1: 1 stimulus: focal vissen verhouding in agressie assays 14,17 worden gebruikt. Echter, de onderzoeker moet in het bijzonder het ontwerp van de studie met de hypothese in het achterhoofd (dat wil zeggen, moet stimulus vis constant worden gehouden om de consistentie in de focale vis gedrag te behouden, of moet stimulus vis worden gedraaid tussen elke test om de juiste randomisatie te verzekeren). - Bewaar alle vissen in de zebravis huisvesting racks (27,5-28,5 ° C) onder een strikte 12:12 licht / donker-cyclus. Feed alle focale en stimulus vissen vlok voedsel dagelijks en pekel garnalen wekelijks, op niet-onderzoek dagen.
- Zorg ervoor dat alle tests worden uitgevoerd tussen ZT1 en ZT5 (zeitgeber tijd) aan circadiane ritme effecten 26 te vermijden.
2. randomisatie en Tank Setup
- Randomize alle personen a priori een specifieke sequentie van gedrags- testen. Het opzetten van een consistente randomisatie regeling met behulp van een online willekeurige volgorde generator 27 of een willekeurige volgorde generator van een statistisch softwarepakket (R).
- Label elke test 1-3 en houd deze opdracht consistent. Wijs een willekeurige volgorde elke individuele kaart en de sequentie volgens de gedrags assay label. Bijvoorbeeld, drie totaal assays (1 toegewezen aan ondieper, 2 toegewezen aan Onverschrokkenheid en 3 toegewezen aan agressie), een bepaald individu kan een gerandomiseerde sequentie van "2,3,1" hebben, die deze nodig hebben om de specifieke voeren behavioral tests in de aangegeven volgorde.
- Stel de test tanks (onverschrokkenheid, agressie, en ondieper) in het laboratorium op plaatsen die de mogelijkheid van ongunstige externe stimuli te minimaliseren en zorg ervoor dat u genoeg ruimte voor een video camcorder om de hele tank vast te leggen hebben. Zorg ervoor dat de camcorder is enough duidelijkheid tank labels te bekijken, evenals in staat zijn om subtiele gedrag van het brandpunt vis en stel de camcorder in deze positie te onderscheiden.
- Noteer alle behavioral tests met de camera gehandhaafd in dezelfde positie met een volledig venster van de tank onbedoelde verschillen in behavioral noteren als gevolg van differentiële opname minimaliseren.
LET OP: Vermijd het plaatsen van tanks in zware verhandelde gebieden en door deuren als beweging en geluid zal zebravis gedrag beïnvloeden. - Vestigen unieke JWatcher protocollen 24 voor het maken van elke gedrags-test. Raadpleeg de JWatcher handleiding om te leren hoe focal meester-bestanden te maken om gedrag te toetsaanslagen en focale analyse bestanden toe te wijzen aan de verzamelde gegevens samen te vatten.
LET OP: JWatcher is behavioral scoren software die het mogelijk maakt voor een betrouwbare en herhaalbare beleidsmatige scoren 24. - Definieer een etiketteringsregeling om de datum, vis nummer en assay nummer voor alle gedrags-assays te volgen (bv'F5-B-123115' impliceert Fish 5, Stoutmoedigheid assay, on December 31, 2015) en het etiket van de buitenkant van de tank met tape in het zicht en in de focus van de camera. Houd en deze informatie in een lab notebook voor snelle verwijzing en toekomstige kwaliteitscontrole op te nemen.
- Opzetten van een acclimatisatie tank die wordt gebruikt tussen alle testen en direct na de individuen uit de behuizing rack verwijderd.
LET OP: De acclimatisatie tanks en terminal tanks zijn kleine aquaria (40 cm x 20 cm x 25 cm) met grind en een filter die sterk lijken op de behuizing rack. - Na de testen al zijn voltooid, de overdracht van het individu in een aparte terminal tank die als eindbestemming tank voor alle gebruikte focal personen zal dienen. Gebruik een tank die groot genoeg is om een groep van individuen te huisvesten voor de rest van hun leven (bijvoorbeeld 25 liter).
LET OP: Het is zeer belangrijk om een consistente en soortgelijke water temperaturen en omstandigheden te handhaven Across alle tanks. Dit omvat behuizing, acclimatisatie en alle tests tanks.
3. Het uitvoeren van de Agressie Assay
- Het gedrag van de agressie test in een 19 L rechthoekige tank van 30 cm x 15 cm x 10 cm. Kleedt tank in externe ondoorzichtige wanden rond drie zijden van de tank agressie, waardoor de voorste blootgesteld bekijken, ongewenste externe stimuli te verminderen. Verdeel de tank met externe markeringen in vier gelijke rechthoekige kwadranten en permanent vast te stellen een spiegel (met siliconenkit) binnen het kwadrant linksonder, een hoek van 22,5 ° de vorming van een rechthoekige driehoek tegen de uiterst linkse kant van de tank.
- Zorg ervoor dat de temperatuur van het water in de acclimatisering tank en agressie tank binnen 2 ° C van de behuizing rack. Om dit te doen, hebben een frisse, verouderde water voorverwarmd tot 27,5-28,5 ° C klaar om toe te voegen aan de agressie tank. Let op dat het belangrijk is om het water te veranderen tussen elke bepaling ongegrond eliminerenolfactorische signalen.
- Transfer, door cupping, een brandpunt vis uit de behuizing rack in een aparte acclimatisatie tank waar het zal wennen gedurende 10 min.
Opmerking: Het is belangrijk stimulans ingevoerd om de vissen door middel ondeskundig gebruik beperken. Transfer individuen zoals eerder beschreven 27.- In het bijzonder, de hand voorzichtig een kleine, doorzichtige plastic beker te plaatsen in de tank van belang. Zonder verstoring van de vis zoveel overbrengen via een net, langzaam schep de vis in de beker.
- Zorg ervoor dat de camcorder is klaar om op te nemen door te bevestigen dat de agressie test tank (zie stap 3.1) is in focus en onmiddellijk vóór de overdracht van het individu in de agressie tank, drukt record op het apparaat. Transfer focal vis via cupping van acclimatisatie tank tot agressie tank.
NB: Het is belangrijk om op te nemen voordat de vis het invoeren van de agressie tank om de exacte tijd van binnenkomst te volgen. - Noteer de aggrsessieschijven tank voor 10 min en 30 sec en dan cup het brandpunt vis uit de agressie tank terug in de acclimatisering tank.
- Bij het bekijken van de opname, wacht 30 seconden na de vis is ingevoerd om de tank als een extra acclimatisatie periode vóór scoren gedrag.
- Met het JWatcher scoresysteem gedefinieerd voor agressief gedrag, kwantificeren de volgende problemen voor 10 min: Tijd gespendeerd dichtbij spiegel, aantal spiegel benaderingen aantal darts, aantal pogingen beten (openen mond richting spiegel), en het aantal laterale displays (rug-, borst-, anale en staartvin erectie) 9.
- Score een enkele agressie test ten minste twee keer, totdat de test wordt gescoord met een hoge overeenkomst tussen iteraties.
4. Het uitvoeren van de Onverschrokkenheid Assay
- Het gedrag van de vrijmoedigheid assay in een kleine 1,5 liter trapeziumvormige tank, meet 15 cm hoog x 26,5 cm x 22,5 cm boven bodem x 6 cm breed. Wikkel ondoorzichtig papier om alle kanten of de tank, maar laat de voorkant blootgesteld voor het bekijken. Plaats één, dun stuk tape buiten de tank boven bakenen van het bodemgedeelte van de tank.
- Zorg ervoor dat de temperatuur van het water in de vrijmoedigheid tank binnen 2 ° C van de behuizing rack (zie stap 3.2)
- Breng de focal vis uit de behuizing rack en de acclimatisering tank (zie stap 3.3) en laat acclimatiseren gedurende 10 min.
- Zorg ervoor dat de camcorder is klaar om de vrijmoedigheid bepaling op te nemen en, eenmaal klaar om het brandpunt vis, drukt u opnemen over te dragen op het apparaat. Breng de focal vis uit de acclimatisering tank naar de vrijmoedigheid tank en record voor 8 min en 30 sec.
- Wanneer de hele opname toestaan gedurende 30 sec acclimatiseringsperiode nadat de vis wordt ingebracht in de tank voor scoring.
- Met behulp van JWatcher software, kwantificeren vrijmoedigheid gedrag gedurende 8 minuten. In het bijzonder, kwantificeren van de volgende problemen: Tijd in de buurt van het oppervlak, latency naar bovenste gedeelte, het aantal tra in te voerennsitions in het bovenste gedeelte en het aantal onregelmatige bewegingen (pijltjes) 29.
- Score een enkele vrijmoedigheid test ten minste twee keer, totdat de test wordt gescoord met een hoge overeenkomst tussen iteraties.
5. Het uitvoeren van de shoaling Assay
- Het gedrag van de ondieper assay in een 76 L tank die drie compartimenten verdeeld door twee glasindeling afgedicht met siliconenkit heeft (de resulterende drie compartimenten bestaan uit twee stimulus zones en één centraal compartiment). Extern, markeren twee voorkeur zones aangewezen 6,35 cm uit elk van glas divider de stimulus zones ', een indicatie van twee lichaam lengtes 30. Solliciteer ondoorzichtige wanden uitwendig rond drie zijden van het shoaling tank, maar laat de voorzijde blootgesteld voor het bekijken.
LET OP: Deze voorkeur zone kan worden aangepast om te testen op specifieke hypotheses voor verschillende grootte soorten. - Afhankelijk van de aard van het onderzoek, selecteert stimulus ondiepten te acclimatiseren voor ten minste 12 uur before testen en verblijf in ondieper tank gedurende het verloop van het experiment.
LET OP: Stimulus ondiepten zijn verzamelingen van individuele vissen die worden gebruikt om te beoordelen hoe het brandpunt vis zich gedraagt in de aanwezigheid of afwezigheid van deze scholen. Verschillende stimulus ondiepe combinaties kunnen worden geselecteerd om een aantal verschillende ondieper hypothesen te testen. Zorg ervoor dat de stimulus ondiepten worden geroteerd tussen elke stimulus zone naar de andere kant vertekening te voorkomen en zijn ook toegestaan om te acclimatiseren voor ten minste 12 uur voor het testen. - Breng de focal vis in de acclimatisering tank zoals eerder beschreven (zie stap 3.3)
- Transfer, door cupping, het brandpunt vis uit de tussenliggende acclimatisatie tank naar de centrale ruimte in het shoaling tank.
- Zorgen voor een 10 min acclimatisatie periode voorafgaand aan een 10 min voor live-scoring observatieperiode. Als alternatief, noteer de shoaling assays en scoor later met behulp van JWatcher. Vissen worden bepaald ondieper zijn wanneer ze binnen de voorkeur zone in de kamerde huisvesting van de doelgroep ondiepte.
- Kwantificeren tijd doorgebracht in elk preferent zone en de tijd doorgebracht in het centrum volume.
- Als extra beschrijvende maatregel, te berekenen 'kracht van shoaling' (SoS). Wijs een waarde tussen -1 en +1 waar de magnitude beschrijft hoe vaak een afzonderlijke vis scholen.
- Bereken de verhouding van de tijd ondieper gedeeld door het oppervlak van de shoaling zones en trek de verhouding van tijd niet ondieper en het gebied van de niet-shoaling zones. Plaats deze hoeveelheid over de som van de tijd doorgebracht in elke zone gedeeld door het volume van elke zone afzonderlijk. Meer informatie over deze berekening is te vinden in een eerdere studie 14.
6. Gegevens Quality Control
- Analyseer gegevens met behulp van traditionele data analyse-instrumenten 31-32.
- Test voor de homogeniteit van de variantie met behulp van testen parametrische Levene voor alle gedragingen. Als een gedrag is niet homogeen uitvoeren van een log-transformatie33.
- Controleer dat er geen sequentie effecten (dwz de randomisatie volgorde had geen invloed op het gedrag van het individu) met een Kruskal-Wallis ANOVA op homogene gegevens 34.
- Bevestigen dat er geen bijwerkingen biases voor de ondieper assay door het creëren van univariate algemene lineaire modellen op SoS indices met kant als een vaste factor 35.
LET OP: Als er weinig tot geen problemen met de data, kan downstream analyses worden uitgevoerd. Als er problemen zijn, met elkaar te verzoenen met extra transformaties, rationaliseren met biologisch plausibele verklaringen en / of het verhogen van steekproefomvang.
7. Gegevens analyseren
- Bereken tweezijdig Spearman correlaties 36 voor alle gedragingen afzonderlijk binnen de vrijmoedigheid en agressie assays.
- Bereken intraclass correlatiecoëfficiënten (ICC) als een twee-weg gemengd model met consistentie voor gedragsverandering tests die werden uitgevoerd meer dan één time voor één bepaald 36. In deze instelling, het ICC is een meting van hoe consequent een vis gedroeg zich in een gegeven test gemeten meer dan één keer.
- Preprocess vrijmoedigheid en agressie gedrag door centreren en norming alle gedragingen voor te bereiden op input voor een principale componenten analyse (PCA) 25.
LET OP: Preprocessing de metingen door het centreren en norming is een cruciale stap. Zonder deze voorbewerkingsstap gedragingen die optreden bij meer frequenties en meer variabel laat te beïnvloeden de interpretatie van de geëxtraheerde bestanddelen. Het proces van centreren en norming zal deze bias te verwijderen. - Voer een PCA met een correlatie matrix om te bepalen of durf en agressie aan elkaar zijn gekoppeld als een gedrags-syndroom. Interpreteren gedrags beladingen van elke component significant op> 0,6. Zie Budaev 2010 24 voor een uitgebreide gids voor het melden van PCA voor gedragsstudies. Een scree plot zal informatief waarop eigenvectors moet worden bewaard voor interpretatie.
- Middel van statistische software zoals R of SPSS 31,32, extract scores voor elke component voor elk individu. De scores geven hoeveel het gedrag van de gegeven individu kan worden verklaard door de specifieke component.
- Bereken Spearman correlaties tussen factor regressie scores en de sterkte van shoaling 36.
LET OP: Een gedragssyndroom aanwezig is overwogen als durf en agressie gedrag te laden op hetzelfde onderdeel of, indien een component met een significante interpreteerbaar ladingen correleert met kracht van shoaling. Merk ook op dat de sterkte van shoaling niet is opgenomen in de PSO om een betere interpretatie van de meer complexe gedragsmatige kwantificeringen (lef en agressie). De PSO zal orthogonaal instorten lef en agressie is voorzien in eigenvectoren aan de hoeveelheid variatie toegelicht en is zeer geschikt voor deze complexe metingen te maximaliseren. Tolkende resulterende eigenvectoren en regressie onze kracht van shoaling metingen op elk van hen geeft een veel meer intuïtieve interpretatie van hoe elk van de complexe gedragingen (lef en agressie) hebben betrekking op een goed gedefinieerde binaire shoaling meting (dat wil zeggen, de vis wordt shoaling of niet shoaling).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhankelijk van de aard van het onderzoek, en specifieke gebruikte protocol, verscheidene verschillende resultaten mogelijk een gedragsvariatie experiment. De volgende tabellen en figuren, waarbij is aangegeven, worden aangepast van onze eerdere studie gepubliceerd in het tijdschrift Behavioural Processes 14 en het tijdschrift zebravis 17. Wanneer het voorstel (zoals hierboven beschreven) in zijn geheel twee resultaten, "in assay correlaties en wordt uitgeoefend" tussen assay correlaties, zullen vermoedelijk (figuur 1).
De eerste set resultaten beschrijft binnen assay consistentie. Met name de resultaten beschrijven hoe gedrag gecorreleerd zijn met elkaar binnen de vrijmoedigheid test en de binnen de agressie test afzonderlijk. Tabellen 1 en 2 beschrijven wat deze correlaties eruit moet zien voor de durf en agprogressie assays en de gepresenteerde gegevens zijn afgeleid van een eerdere studie 14. Voor het lef test wordt verwacht dat het aantal overgangen en de tijd doorgebracht op het bovenste gedeelte van de tank zijn positief gecorreleerd, maar de latentie bovengedeelte negatief gecorreleerd voeren. Representatieve resultaten voor individuen gemeten aan de moed as van gedrag in de lef tank (zie stap 4,1) worden gegeven in tabel 1. Voor de agressie test wordt verwacht dat bijt, laterale displays en tijd nabij de spiegel al gecorreleerd. Representatieve resultaten voor individuen gemeten op agressie as van gedrag agressie tank (zie stap 3,1) worden gegeven in tabel 2. Pijltjes meestal niet gecorreleerd met agressief gedrag, hoewel, in sommige gevallen, agressieve vis vaak dart (derhalve een negatieve correlatie ). Tot slot, een sterkte van ondieper (SoS) maat voor de ondieper assay voorziet in een individueel niveau meting van shoaling tendency. Ondieper is een zeer herhaalbaar gedrag in een verscheidenheid van shoaling assays gemeten met behulp van SoS (ICC = 0,641) 14 en een aantal van onze eerdere studies hebben shoaling gedrag in de zebravis 23,38 bevestigd. Aangezien alle personen worden gemeten voor elk van de gedragingen, kunnen we Spearman correlatie in deze gedragingen berekenen en verwachten bepaalde gedragingen te correleren, zoals die welke in de zebravis representatieve resultaten.
Het tweede deel van de resultaten wordt onderzocht of de een gedragssyndroom. De resultaten van de integratieve analyse van gedrag gekwantificeerd in de lef en agressie behavioral tests samengevat met een Principal Components Analysis (PCA). Er moeten 03:58 interpreteerbare componenten op basis van hoge ladingen per gedrag. Als een eigenvector die een groot deel van de variatie verklaart omvat gedrag van zowel de lef eend agressie testen, dan is een gedrags-syndroom werd waargenomen. Echter, als het gedrag van de durf en agressie assays elkaar niet overlappen op een enkele eigenvector, dan is de studie beschrijft niet een gedrags-syndroom. Representatieve resultaten zijn weergegeven voor de afwezigheid van een lef-agressie gedragssyndroom (figuur 2). In dit voorbeeld component 1 het sterkst representatief agressie gedrag terwijl component 2 is het sterkst gekoppeld aan lef gedrag. Omdat agressie en durf gedrag niet worden vertegenwoordigd door dezelfde component, kan worden geconcludeerd dat er sprake is het ontbreken van een vrijmoedigheid-agressie behavioral syndroom (vrijmoedigheid vectoren zijn ruwweg loodrecht op agressie vectoren). Ook zijn deze gedragingen niet beïnvloed door geslacht omdat het verspreidingspatroon is hetzelfde tussen mannen en vrouwen. Om te zien of durf of agressie gedragingen worden geassocieerd met ondieper, de uitgepakte regressie scores voor elke vis zijn corropgetogen met SoS meting van de vis. Het is van belang ervoor te zorgen dat het correleren van componenten in feite een interpreteerbare reeks gedrag beschrijven. Als er hoge absolute waarde Spearman correlaties tussen elke component en de shoaling meting, dan is een shoaling gedrags-syndroom aanwezig. Ongeacht de specifieke resultaten, is het belangrijk om mogelijk biologisch interpretaties aan alle waarnemingen. Representatieve resultaten worden voor een beschrijving van een lef shoaling gedragssyndroom (tabel 3) 14. Terwijl de gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen typische resultaten voor de zebravis, mogen ze niet worden geïnterpreteerd als metingen van de kwaliteit van de gegevens. Er zijn verschillende redenen waarom de gegevens over verschillende verschillende experimenten zal kijken zoals soort of populatie verschillen.
Figuur 1. Voorgesteldeworkflow voor een vrijmoedigheid, agressie en shoaling gedragsmatige syndromen experiment. Typische metingen worden vermeld voor elke test. Een overzicht van hoe de tests individueel en vervolgens hoe de analyses te integreren is ook vermeld te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Representatieve resultaten van een PCA aangeeft dat een lef-agressie gedragssyndroom ontbreekt. Het rode vectoren geven gedragingen die bijdragen tot de component scores (linkerbovenhoek en as) en de punten stellen individuele punten langs elke component (rechts en van boven assen ). Mannetjes worden vertegenwoordigd door blauwe punten en vrouwen worden vertegenwoordigd door groene punten. Merk op dat de 'grillige gedrag' wordt verwezen naar 'darts' en'agressie rate' kan worden berekend door het aantal beten en laterale displays gedeeld door de totale tijd interactie met de spiegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Transitions | Wachttijd | Darts | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Surface Time | 0.65 | <0,001 * | -0,68 | <0,001 * | 0.42 | 0.007 * |
| Transitions | -0,40 | 0,012 * | 0.33 | 0,041 * | ||
| Wachttijd | -0,47 | 0.002 | ||||
| * Α <0,05 |
Tabel 1:. Boldness Spearman rank correlaties in een roman tank assay Deze tabel was gewijzigd van Way et al, 2015..
| Lateral Displays | Darts | Mirror Time | ||||
| ᴩ | p | ᴩ | p | ᴩ | p | |
| Bites | 0.69 | <0,001 * | -0.10 | 0,547 | 0.63 | <0.001 * |
| Lateral displays | -0.06 | 0,735 | 0.66 | <0,001 * | ||
| Darts | -0.18 | 0,285 | ||||
| * Α <0,05 | ||||||
Tabel 2:. Agressie Spearman rank correlaties in een roman tank assay Deze tabel was gewijzigd van Way et al, 2015..
| ᴩ | p | |
| PCA Components | ||
| Vrijmoedigheid | 0,339 | 0,035 * |
| Agressie | 0,075 | 0.65 |
| pijl | -0,012 | 0,944 |
T abel 3:. De PCA componenten om de aanwezigheid van een shoaling en lef gedragssyndroom aanwezig in deze populatie bevestigen Deze tabel was gewijzigd van Way c.s., 2015..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol zal bepalen of er consistente verenigingen in vrijmoedigheid, agressie en ondieper gedrag in de zebravis. Als er overeenstemming associaties in een bepaalde populatie tussen een van deze gedragingen, dan is een gedragssyndroom aanwezig. Door het bestuderen van natuurlijke gedragssyndroom een bevolking kunnen onderzoekers een beter begrip van zijn behavioral dynamische, bevolkingsopbouw, en eventueel evolutionaire geschiedenis 3 hebben. Bovendien, het manipuleren van de omgeving die deze behavioral syndromen beïnvloedt, net als in de farmacologie 6, toxicologie 7, gedragsgenetica 8,9 en endocrinologie 10 studies, kan licht werpen op hoe de verschillende factoren die van invloed kunnen zijn behavioral verenigingen. De specifieke samenstelling van de agressie-durf-shoaling behavioral syndroom gevonden in dit protocol omvat gemeenschappelijke gedrag goed bestudeerd in het model organisme zebravis 11-13. Hoewel deze methodologiekunnen worden toegepast op alle vissoorten, kan de brede toepassing voor het gebruik van zebravis hulp bieden bij interdisciplinaire standaardisatie van dit protocol. Elke hierboven beschreven test kan gemakkelijker worden gecontroleerd en gemanipuleerd dan andere vergelijkbare technieken. Bijvoorbeeld, agressie test gebruikt de schuine spiegel een breder gamma van agressie responsen opwekken in plaats van een beeld verticale spiegel levende of klei model, video stimulus of stimulus 17. Het gedrag gemeten lef assay worden gemakkelijker dan gekwantificeerd in een t-doolhof of grote open veldtest 15. Tenslotte de ondieper assay beschreven kan gemakkelijk een individu, die essentieel is voor het bestuderen gedragsvariatie op individueel niveau, en kan zorgen voor onbeperkte combinaties van doel ondiepten om nieuwe experimentele vragen volgen. Hoewel dit protocol kan worden aangepast om een verscheidenheid aan gedrags- vragen tegemoet te komen, kan de standaardisatie ervan leiden tot nieuwe inzichten hoe DNA, cellulaire mechanismens, celontwikkeling, en introduceerde chemicaliën kan invloed hebben op de individuele en de bevolking behavioral syndromen.
Om vertrouwen dat de waargenomen verenigingen waar te zijn, dient het protocol zorgvuldig gevolgd. Voor het grootste deel, het protocol kan bepaald worden volgens de specifieke hypothese; Echter, er zijn verschillende stappen die moeten worden uitgevoerd om het vertrouwen in de resultaten te garanderen. Ten eerste is het belangrijk dat de individuen zijn ondergebracht in een geschikte tank, bij optimale omstandigheden (zie protocol) en worden goed ingevoerd. Het water voorwaarden moeten in overeenstemming zijn in de woningbouw rekken, acclimatisatie tanks en testen tanks. Als het water niet consistent, zal de vis langer duren om te acclimatiseren aan de omstandigheden en de gedragsmatige metingen niet goed opgeslagen. Het is ook belangrijk dat het water wordt gerecycled tussen lef en agressie tanks zodat geur- niet meer tussen assays worden uitgevoerd. Ten tweede is het van groot belang dat alle Behaviors correct gescoord. Om dit te garanderen, worden alle assays gefilmd mogelijk te maken voor meerdere bezichtigingen, en een aantal opleidingsmogelijkheden. Een enkele getrainde scorer nauwkeurig kan meten vis gedrag, maar training vergt wel wat tijd. Indien een zorgvuldige stage wordt genegeerd, dan het vertrouwen van de resultaten van het gedragsonderzoek laag. Een zorgvuldige studie met een lage steekproeven uitgevoerd door een goed opgeleide waarnemer is krachtiger dan een studie met hoge steekproefomvang uitgevoerd door een slecht opgeleide waarnemer. Tenslotte kwaliteitscontrole van de verzamelde gegevens is ook kritisch. De stappen die worden genomen om individuen willekeurig en verwijder vertekeningen moet resulteren in bruikbare, betrouwbare data en data transformaties worden aanbevolen voor preprocessing volgens de specifieke statistische toets (zie protocol). Als deze stappen niet zorgvuldig uitgevoerd, kan de uitgang van de analyses niet betrouwbaar interpreteerbaar zijn.
Zoals eerder vermeld, is de techniek sterk aanpasbaar according tot de specifieke test hypothesen. Er bestaan andere gedragsmaten die kunnen worden onderzocht te zijn verbonden in een gedragssyndroom onder een aantal verschillende vissoorten 39-41. Terwijl de leerstellingen van het protocol hetzelfde blijven, kan de specifieke vragen gemakkelijk worden aangepast om rekening te houden diverse hypothese testen. Zo kan een onderzoeker de hiervoor genoemde protocol gebruiken om te testen op de aanwezigheid van een agressie en verkennende activiteiten gedragssyndroom in zebracichlide (amatitlania nigrofasciata). De vraag is verbonden, maar de studie organisme verschilt van die beschreven in het protocol. De algemene stappen zijn onveranderd. Individuen moeten worden gerandomiseerd en gevolgd door een reeks assays, met acclimatisering periodes tussen assays, moet het water consequent en fris, en de wetenschapper moet goed worden opgeleid. Een belangrijk verschil is de gedragingen die worden gemeten die kunnen veranderen afhankelijk van de specifiekefic assay, en de gedrags associaties kunnen veranderen afhankelijk van de specifieke soorten en oorspronkelijke omgeving.
De beperkingen van het protocol zijn verbonden met een aantal van de traditionele onzekerheden van gedragsstudies. Specifiek, indien de testen onbetrouwbaar gescoord dan is het waarschijnlijk de interpretatie van de resultaten onjuist, en het zou moeilijk zijn om deze fout te verhelpen. Om deze beperking te overwinnen, is het mogelijk dat twee goed opgeleide scorers observeren gedrag. Om de betrouwbaarheid te beoordelen, berekenen intraclass correlatiecoëfficiënten van metingen op gelijke vis, en, indien nodig, voor verschillen. Als alternatief, indien beschikbaar, de automatische tracking software zoals Ethovision kunnen worden uitgevoerd en gevalideerd door een goed opgeleide waarnemer om de doorvoer en nauwkeurigheid 42 te verhogen. Verder zijn er verschillende mogelijke interpretaties betrekking tot de naam en scoren van de "moed" gedrag. andere studieshebben genoemd het gedrag beschreven 43 en anderen hebben het gedrag beschreven als "verkennend" 44,45. In ons werk was het gedrag beschreven als "vrijmoedigheid" Zoals het was het gedrag te meten in een omgeving onbekend voor het brandpunt individu. Hoewel de term kan worden onderworpen aan alternatieve interpretaties Dit laat de protocol of de analyse. Bovendien, terwijl we verwachten metingen binnen lef en agressie assays sterk samen te hangen binnen een populatie, is er waarschijnlijk een aantal gevallen van omdat anders geen correlatie van bepaalde gedragingen. Deze beperking wordt overwonnen door de kracht van de PCA, omdat deze sleutels op belangrijke bronnen van variabiliteit en zelfs als voorgeschreven zijn gecorreleerd, zal de analyse gedragsvariatie consistent in de verzamelde gegevens te extraheren. Tenslotte, zoals bij alle wetenschappelijke methoden, als het protocol wordt algemeen aangenomen en wordt consequent door verschillende laboratoria uitgevoerd, en er is enigeonvoorziene, ongemeten verwarrende geïntroduceerd door het protocol, dan is dit potentieel schadelijke element blijft in de literatuur, en wordt het moeilijk om te ontmantelen. Farmacologisch bevestigd dat een representatieve set van testen ontlokken de beoogde gedragsverandering reactie vereist een meer grondige kennis van gedrags-, neurologische en hormonale reacties. Behavioral syndromen kunnen helpen verklaren de basis van gedrag, maar deze beperking laboratorium in staat zijn om in toekomstige studies vaker aangepakt. Desalniettemin waren de resultaten levert dat het gebruik van dit protocol in zebravis valideert, en, met de juiste modificaties, kan het protocol worden uitgebreid tot verschillende hypothesen in een aantal verschillende vissoorten. Door het zorgvuldig volgen van een gedetailleerd protocol voor de woningmarkt, de selectie en het testen van verschillende gedragsmatig parameters zullen onderzoekers in staat om meer specifieke vergelijkingen te maken over een breed scala aan studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Rack System | Aquaneering Inc | Cat. # ZS550 | |
| Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g | Pet Valu | Cat. # 31700 | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz | Brine Shrimp Direct | ||
| 1.5 L Trapezoidal Tank | Pentair Aquatic Ecosystems | Cat. # itsts-a | |
| 19 L rectangular tank | That Fish Place | 211932 | |
| 76 L rectangular tank | That Fish Place | 212180 | |
| Hitachi KP-D20A CCD Camera | Prescott's, Inc. | ||
| Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens | Nikon Corporation | ||
| ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3" x 3" | Michaels | Cat. # 10334162 | |
| Jwatcher | |||
| SPSS Statistics Base | IBM | ||
| R | The R Foundation |
References
- Huntingford, F. The relationship between anti-predator behaviour and aggression among conspecifics in the three-spined stickleback, Gasterosteus aculeatus. Anim Behav. 24, 245-260 (1976).
- Réale, D., Reader, S. M., Sol, D., McDougall, P. T., Dingemanse, N. J. Integrating animal temperament within ecology and evolution. Biol Rev. 82 (2), 291-318 (2007).
- Sih, A., Bell, A., Johnson, J. C. Behavioral syndromes: an ecological and evolutionary overview. Trends Ecol Evol. 19 (7), 372-378 (2004).
- Conrad, J. L., Weinersmith, K. L., Brodin, T., Saltz, J. B., Sih, A. Behavioural syndromes in fishes: a review with implications for ecology and fisheries management. J Fish Biol. 78 (2), 395-435 (2011).
- Wolf, M., Weissing, F. J. Animal personalities: consequences for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 27 (8), 452-461 (2012).
- Langheinrich, U. Zebrafish: a new model on the pharmaceutical catwalk. BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).
- Dai, Y. -J., Jia, Y. -F., et al. Zebrafish as a model system to study toxicology: Zebrafish toxicology monitoring. Environ Toxicol Chem. 33 (1), 11-17 (2014).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. Neuroscience. 11 (1), 90 (2010).
- Gerlai, R. Zebra fish: an uncharted behavior genetic model. Behav Genet. 33 (5), 461-468 (2003).
- Dzieweczynski, T. L., Campbell, B. A., Marks, J. M., Logan, B. Acute exposure to 17α-ethinylestradiol alters boldness behavioral syndrome in female Siamese fighting fish. Horm Behav. 66 (4), 577-584 (2014).
- Miklòsi, Á, Andrew, R. J. The Zebrafish as a Model for Behavioral Studies. Zebrafish. 3 (2), 227-234 (2006).
- Zebrafish protocols for neurobehavioral research. , Humana Press. New York. (2012).
- Moretz, J. A., Martins, E. P., Robison, B. D. Behavioral syndromes and the evolution of correlated behavior in zebrafish. Behav Ecol. 18 (3), 556-562 (2007).
- Way, G. P., Kiesel, A. L., Ruhl, N., Snekser, J. L., McRobert, S. P. Sex differences in a shoaling-boldness behavioral syndrome, but no link with aggression. Behav Process. 113, 7-12 (2015).
- Toms, C. N., Echevarria, D. J., Jouandot, D. J. A methodological review of personality-related studies in fish: Focus on the shy-bold axis of behavior. J Comp Psychol. 23, 1-25 (2010).
- Rowland, W. J. Studying visual cues in fish behavior: A review of ethological techniques. Environ Biol Fish. 56 (3), 285-305 (1999).
- Way, G. P., Ruhl, N., Snekser, J. L., Kiesel, A. L., McRobert, S. P. A Comparison of Methodologies to Test Aggression in Zebrafish. Zebrafish. 12 (2), 144-151 (2015).
- Moss, S., Tittaferrante, S., et al. Interactions between aggression, boldness and shoaling within a brood of convict cichlids (Amatitlania nigrofasciatus). Behav Process. 121, 63-69 (2015).
- Ruhl, N., Kiesel, A. L., McRobert, S. P., Snekser, J. L. Behavioural syndromes and shoaling: connections between aggression, boldness and social behaviour in three different Danios. Behaviour. 149 (10-12), 1155-1175 (2012).
- Larson, E. T., O'Malley, D. M., Melloni, R. H. Jr Aggression and vasotocin are associated with dominant-subordinate relationships in zebrafish. Behav Brain Res. 167 (1), 94-102 (2006).
- McRobert, S., Bradner, The influence of body coloration on shoaling preferences in fish. Anim Behav. 56 (3), 611-615 (1998).
- Ruhl, N., McRobert, S. The effect of sex and shoal size on shoaling behaviour in Danio rerio. J Fish Biol. 67 (5), 1318-1326 (2005).
- Snekser, J., Ruhl, N., Bauer, K., McRobert, S. The influence of sex and phenotype on shoaling decisions in zebrafish. J Comp Psychol. 23, 70-81 (2010).
- Blumstein, D. T., Evans, C. S., Daniel, J. C. JWatcher. , Available from: http://www.jwatcher.ucla.edu/ (2006).
- Budaev, S. V. Using Principal Components and Factor Analysis in Animal Behaviour Research: Caveats and Guidelines. Ethology. 116 (5), 472-480 (2010).
- Paciorek, T., McRobert, S. Daily variation in the shoaling behavior of zebrafish Danio rerio. Curr Zool. 58 (1), 129-137 (2012).
- Haahr, M. Sequence randomiser. , Available from: http://www.random.org/lists/ (1998).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nat Protoc. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Cachat, J., Stewart, A., et al. Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish. Nat Protoc. 5 (11), 1786-1799 (2010).
- Croft, D. P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries. Fish Fish. 4, 138-146 (2003).
- IBM Corp. IBM SPSS Statistics for Mac OS. , IBM Corp. Armank, NY. Available from: http://www.ibm.com/analytics/us/en/technology/spss/spss.html (2011).
- R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2013).
- Brown, M. B., Forsythe, A. B. Robust Tests for the Equality of Variances. J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).
- Kruskal, W. H., Wallis, W. A. Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis. J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).
- Nelder, J. A., Wedderburn, R. W. M. Generalized Linear Models. J Roy Stat Soc A Sta. 135, 370-384 (1972).
- Iman, R. L., Conover, W. J. A distribution-free approach to inducing rank correlation among input variables. Commun Stat Simulat. 11 (3), 311-334 (1982).
- Fleiss, J. L., Cohen, J. The Equivalence of Weighted Kappa and the Intraclass Correlation Coefficient as Measures of Reliability. Educ Psychol Meas. 33 (3), 613-619 (1973).
- Ruhl, N., McRobert, S. P., Currie, W. J. S. Shoaling preferences and the effects of sex ratio on spawning and aggression in small laboratory populations of zebrafish (Danio rerio). Lab Animal. 38 (8), 264-269 (2009).
- Bell, A. M. Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus). J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).
- Wilson, A. D. M., Godin, J. -G. J. Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus. Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).
- Brodin, T. Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly. Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).
- Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments. Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).
- Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis). Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).
- Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration. Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).
- Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback. J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).
