Summary
Transgene manipulasjoner og genom redigering er avgjørende for funksjonelt teste rollene som gener og cis-regulatoriske elementer. Her en detaljert mikroinjeksjon protokoll for generering av genomiske modifikasjoner (inkludert Tol2-mediert fluorescerende reporter transgene konstruksjoner, Talens, og CRISPRs) er presentert for emergent modell fisken, trepigget stingsild.
Abstract
Den trepigget stingsild fisk har dukket opp som et kraftig system for å studere genetiske grunnlaget for et bredt utvalg av morfologiske, fysiologiske og atferdsmessige fenotyper. Den bemerkelsesverdig forskjellige fenotyper som har utviklet seg som marine populasjoner tilpasse seg utallige ferskvannsmiljø, kombinert med evnen til å krysse saltvanns- og ferskvanns former, tilveiebringe et sjeldent virveldyr system hvor genetikk kan benyttes til å kartlegge genomiske regioner kontrollerende utviklet seg trekk. Gode ressurser genomiske er nå tilgjengelig, tilrettelegge molekylær genetisk disseksjon av utviklet seg endringer. Mens kartleggingsforsøk generere lister over interessante kandidatgener, er funksjonelle genetiske manipulasjoner for å teste rollene til disse genene. Genregulering kan studeres med transgene reporter plasmider og BACS integrert i genomet bruker Tol2 transposase system. Funksjoner av spesifikke kandidatgener og cis-regulatoriske elementer kan vurderes ved å fremkalle målrettetmutasjoner med Talen og CRISPR / Cas9 genom redigering reagenser. Alle metoder krever innføring av nukleinsyrer inn befruktede én celle stingsild embryo, en oppgave laget utfordrende av den tykke chorion av stingsild embryoer og relativt liten og tynn blastomere. Her er en detaljert protokoll for mikroinjeksjon av nukleinsyrer i stingsild embryoer beskrevet for transgene og genom redigeringsprogrammer for å studere genekspresjon og funksjon, samt teknikker for å vurdere hvor vellykket transgenesis og gjenopprette stabile linjer.
Introduction
En grunnleggende del av å forstå hvordan biologiske mangfoldet oppstår er å avgjøre de genetiske og utviklings baser utviklet fenotypiske endringer i naturen. Den trepigget stingsild fisk, Gasterosteus aculeatus, har dukket opp som en utmerket modell for å studere genetiske grunnlaget for evolusjon. Stingsild har gjennomgått mange adaptive evolusjonære endringer som marine fisk har kolonisert utallige ferskvannsmiljøer rundt den nordlige halvkule, noe som resulterer i dramatisk morfologiske, fysiologiske og atferdsendringer 1. Genomene av individer fra tjueen stingsild populasjonene er blitt sekvensert og sammenstilt, og en leddforbindelse kart med høy tetthet har blitt generert for ytterligere å forbedre monteringen 2,3. Genetisk kartlegging eksperimenter har identifisert genomiske regioner underliggende utviklet fenotyper 4-6, og i noen tilfeller har de funksjonelle rollene til spesifikke kandidat gener testet 7,8. En rekke genomiske regioner underliggende morfologiske endringer har blitt identifisert med lovende kandidat gener, men disse kandidatene har ennå ikke blitt funksjonelt testet 9-12. I tillegg stingsild er vanlige modeller for studier av populasjonsgenetikk / genomikk 13,14, arts 15, atferd 1, endokrinologi 16, økotoksikologi 17, immunologi 18 og parasittologi 19. Fremtidige studier i hvert av disse feltene vil dra nytte av muligheten til å utføre funksjonelle genetiske manipulasjoner i stingsild. I tillegg til å manipulere sine sekvenser, kan rollene som kandidat gener vurderes ved å studere sine cis-regulatoriske sekvenser og fra funksjonelt økende, synkende, eller eliminere uttrykk for kandidaten genet. Mikroinjeksjon og transgenesis metoder i stingsild er godt etablert 7,8,20 og ble opprinnelig utviklet ved hjelp av en meganuclease-mediertFremgangsmåten 21 først beskrevet i medaka 22. Den modifiserte mikroinjeksjon Metoden som presenteres her er optimalisert for både Tol2-mediert transgenesis og nylig utviklet genom redigering reagenser inkludert Talens og CRISPRs.
Endringer i cis-regulatoriske elementer er antatt å være kritisk for morfologisk evolusjon, som cis-regulatoriske endringer kan unngå de negative pleiotrope konsekvenser av mutasjoner som koder 23. Derfor teste og sammenligne mulige cis-regulatoriske sekvenser er blitt et sentralt mål for et økende antall evolusjonære studier. I tillegg har de fleste humane sykdomsvarianter regulatoriske varianter 24,25 og modell virveldyr systemer er sårt tiltrengt for å studere cis-regulatoriske element funksjon og logikk. Fisk som befrukte sine embryoer eksternt i store tall tilby kraftige virveldyr systemer for å studere cis -regulation. Den Tol2 transposon system, der utenrgn DNA som skal integreres i genomet er flankert av transposase Tol2 bindingsseter og ko-injisert med Tol2 transposase mRNA, arbeider med høy virkningsgrad for å lykkes med å integrere plasmid-konstruksjoner inn i fiske genomer 26 - 28. Vanligvis er en potensiell enhancer klonet oppstrøms fra et basal promoter (for eksempel hsp70l 29) og fluorescerende reportergen så som EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller mCherry i en Tol2 ryggrad og injisert med mRNA transposase 26. Observasjon av uttrykk for fluorescerende reporter, enten i injiserte embryoer eller avkom med stabilt integrert transgener, gir informasjon om tid og rom regulering av genekspresjon drevet av den antatte enhancer. I videre forsøk kan validerte forsterkere brukes til å drive vevsspesifikt overekspresjon av gener som er av interesse.
For analyse av større cis-regulatoriske regioner, høy kvalitet, stor-insert genomic bibliotekene ved bruk av bakterie- kunstige kromosomer (Bacs) er konstruert for både saltvanns- og ferskvanns stingsild 30. Disse BACS kan recombineered for å erstatte et gen med en fluorescerende reporter gen i forbindelse med en stor (150-200 kb) genomisk region 31. Det fluorescerende reporter blir deretter uttrykt i en tid og rom mønster som bestemmes av regulatoriske sekvenser innenfor BAC. For studier i fisk, kan Tol2 sider legges til BAC å lette genomiske integrasjons 32,33. I senere stadier av utviklingen når in situ-hybridisering er teknisk utfordrende, kan den fluorescerende avlesning av BAC benyttes til å studere mønstre av genekspresjon, som har blitt vist for stingsild benmorfogenetisk protein 6 (Bmp6) 20. I tillegg kan fluorescerende ekspresjonsmønstre i et individ kan spores over tid, noe som ikke kan oppnås med in situ-hybridisering. BACS kan også brukes til å legge til en additional kopi av en genomisk region for å øke doseringen av et gen av interesse.
For studier av genfunksjon, er genomet redigering en eksplosjonsartet ekspanderende felt som kan benyttes for å fremstille målrettede endringer av genomiske sekvenser i en rekke forskjellige organismer 34. Transkripsjons aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens) er modulære, sekvensspesifikke nukleaser opprinnelig isolert fra plante patogener som kan presist konstruert for å binde direkte til en genomisk sekvens av valg og generere en dobbel tråd bryte 35,36. Gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromic repetisjoner (CRISPR) / CAS-systemer ble opprinnelig funnet i bakterier og bruke en guide RNA og Cas9 protein for å generere en pause i en target DNA sekvens som er komplementær til guiden 37. Den etterfølgende reparasjon av dobbeltstrenget bryte laget av både Talens og CRISPRs ofte etterlater en liten innskudd eller delesjon, noe som kan forstyrre funksjonen av målsekvensen35-37. I stingsild, har Talens blitt brukt til å forstyrre genuttrykk ved å målrette en forsterker 20, og både Talens og CRISPRs har blitt produsert mutasjoner i sekvensene (upubliserte data). En detaljert protokoll for generering av CRISPRs for bruk i sebrafisk kan brukes som en retningslinje for å utvikle CRISPRs for stingsild 38.
Transgene og genom redigering eksperimenter kreve innføring av nukleinsyrer inn i en nylig befruktede en celle-embryo. Ved å innføre transgenet eller genom-redigeringsverktøy tidlig i utviklingen, er antallet av genetisk manipulerte datterceller i embryoet maksimert. Injiserte embryoer blir så visuelt skjermet for fluorescens eller molekylært screenet for genom modifikasjoner. Hvis cellene bidrar til kimcellelinje er vellykket målrettet, kan transgenet eller mutasjon bli gitt videre til en undergruppe av avkom, selv når postinjeksjons dødelighet er høy. Mosaikk fisk kan outcrossed ellerintercrossed og deres avkom skjermet for å gjenopprette den muterte alleler eller et stabilt integrert transgen av interesse. Denne protokollen beskriver metoder for å innføre transgener og genom redigering reagenser i ett-celle stingsild embryoer og overvåking for vellykkede genomiske modifikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All fisk arbeidet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of California i Berkeley (protokoll nummer R330).
1. Forbered nukleinsyrer for injeksjon
- Tol2 Plasmid transgenesis (Tilpasset fra Fisher 26).
- Klipp 10 mikrogram transposase plasmid (PCS-TP) 39 med 10 U Noti i medfølgende buffer for en time ved 37 ° C for å linear.
Merk: Material Transfer avtaler kan være nødvendig for å oppnå Tol2 plasmider. - Ekstraher kuttet plasmid med en 25: 24: 1 blanding av fenol: kloroform: isoamylalkohol og etanol bunnfall med natriumacetat i henhold til standard protokoller 40. Resuspender plasmidet i 50 ul RNase-fritt vann.
Merk: Fenol-kloroform bør brukes i en hette og avfallet må plasseres forsvarlig i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Sett opp en Sp6 transkripsjon reaksjon i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk en RNA isolasjon kit for å rydde opp transkripsjon reaksjon i henhold til produsentens anvisninger; resuspender RNA i 50 mL RNase-fritt vann.
- Fjerne en 1 mL delmengde av RNA. Oppvarm til 65 ° C i 5 minutter for å denaturere sekundære strukturer så umiddelbart koble på is. Fryse resterende transkripsjonsreaksjon ved -80 ° C.
- Kjør RNA alikvot på en 1% agarosegel i TAE 0,5x (Tris-base, eddiksyre, Ethylenediaminetetraacetic syre) rennende buffer med en RNA-standard størrelse i en veibane. Det forventede produktet er 2200 bp; forkaste hvis> 5% av det totale RNA vises i et utstryk mindre enn 2200 bp, som indikerer utstrakt nedbrytning (figur 1).
- Kvantifisere RNA ved hjelp av et spektrofotometer ved 260 nm. Fortynn til 350 ng / mL i RNase-fritt vann og lagre 1 mL alikvoter ved -80 ° C (bra i minst to år).
- Klon Tol2 reporter plasmid (for eksempel ved bruk av pT2HE 8 eller plasmider fra Tol2 settet 41) med cis- Regulerende element av interesse. I korthet PCR amplifisere en genomisk DNA-sekvens av interesse med primere inneholdende restriksjonsseter som finnes i plasmidet, fordøye PCR-produktet og vektor med det enzym (er), ligate innsatsen inn i vektoren, og omdanne resulterende plasmid inn i kompetente E. coli 40. Isolere plasmid med en pakke som inkluderer en endotoksin skylling i henhold til produsentens protokoll.
- Utføre en andre rensing av Tol2 plasmidet med et PCR-rensesett ifølge fabrikantens protokoll. Elueres i 30 ul RNase-fritt vann.
Merk: utbyttet fra dette trinnet, kan være lav (noen ganger under 50% av input-plasmidet). - Spe plasmid til ~ 125 ng / mL i RNase-fritt vann.
- Klipp 10 mikrogram transposase plasmid (PCS-TP) 39 med 10 U Noti i medfølgende buffer for en time ved 37 ° C for å linear.
Figur 1. Transposase mRNA gel. Renset transkripsjon reaksjon prokanalen (1 mL) ble oppvarmet til 65 ° C, avkjølt på is, og kjørt på en 1% agarosegel med 0,5x TAE-buffer ved 100 V. Størrelsen på RNA stigen i kilobaser (kb) er angitt til venstre . Den fulle lengde transposase mRNA er en lys band på ~ 2,2 kb. En liten, men akseptabel mengde degradert eller ufullstendig mRNA blir sett på under 2,2 kb. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- BAC transgenesis (Se Suster 32,33 for BAC Recombineering Techniques)
- Forbered BAC fra E. coli ved hjelp av BAC rensing kit i henhold til produsentens protokoll. Bruk etanolutfelling for å utvinne DNA med en standard natriumacetat-etanolekstraksjon 40 og resuspender DNA ved ~ 250 ng / mL i RNase-fritt vann.
- Forbered transposase mRNA som i avsnitt 1.1.
- Mutasjon Induksjon med Talens (Se Cermak
- Bruk web-basert program for å designe Talens for genet av interesse 42. Hvis det er mulig, utforming Talens å forstyrre et restriksjonsenzym snitt området for å lette molekylær analyse.
- Clone Talens og forberede plasmider for transkripsjon følgende publisert protokoll 35.
- Transkribere TALEN mRNA med en Sp6 transkripsjon reaksjon i henhold til produsentens instruksjoner og rydde opp mRNA som beskrevet for transposase i avsnitt 1.1.4. Kvantifisere med et spektrofotometer og fortynnet til 200 ng / mL i RNase fritt vann. Kjør TALEN mRNA på en gel for å sikre at det er riktig størrelse og ikke degradert som beskrevet i trinn 1.1.6.
- Utforme et par av PCR-primere for å amplifisere omtrent 100-200 bp omgir TALEN target-sekvensen ved bruk av en primer design verktøyet og mål-DNA-sekvensen 43. Bestille det passende restriksjonsenzym for å teste for lesjoner på målstedet basert på trinn 1.3.1.
- Design og forberede CRISPRs og Cas9 mRNA i henhold til protokoll 38, og ordre aktuelle verifikasjons primere og restriksjonsenzymer som beskrevet i trinn 1.3.4.
2. Forbered Injeksjon Reagenser
- Bruk Borosilicate Kapillærer klargjør Needles som beskrevet nedenfor.
Merk: Disse kapillærer er ikke standard kapillærer som brukes for sebrafisk mikroinjeksjon, og er laget av et tykkere og sterkere glass som er avgjørende for å punktere tøff stingsild chorion.- Bruk alltid nitril eller gummihansker når du trekker nåler, og tillater ikke nåler å kontakte hud eller hud oljer.
- Bestem Mikropipette trekke parametere empirisk ved rampe tester følgende mikropipette avtrekker er produsentens instruksjoner. For eksempel, med en eske filament, ble følgende parametre avskrekkeminelagt for å være optimal: (Heat = 515, Pull = 60, Velocity = 60, Delay = 85, Trykk = 500). Disse innstillingene produsere en nål som smalner bratt ved omtrent 12 ° C i ~ 2 mm og deretter en lang forlengelse som smalner ved omtrent 2 ° i ~ 6 mm (figur 2).
Merk: De riktige parametrene vil variere etter avtrekker og filament, og blindt bruke et program uten å bestemme parametrene først gjennom rampe tester kan permanent ødelegge avtrekker er filament, som er vanskelig og kostbart å erstatte. - Følg produsentens instruksjoner for å trekke minst 4 Mikropipette nåler fra borsilikatglass med innstillingene fastsatt i 2.1.2.
- Oppbevar nåler vertikalt i kapillær lagring krukke med den spisse enden vendt ned.
- Før injisering, plasserer kapillær lagring krukke på is for å kjøle ned nåler. Legg et stykke fuktig papirhåndkle for å glasset for å forhindre fordampning når nålene er fylt.
- Gjødsle Egg (AlleSteps utført ved RT)
- Strip egg clutch fra gravid kvinne stingsild ved å klemme forsiktig magen og stryke i en fremre til bakre retning for å presse eggene ut gjennom Cloaca og inn i en 35 x 10 mm 2 petriskål. Legg et fuktig stykke papirhåndkle på den ene side av petriskålen (ikke berøre eggene) for å skape fuktighetskammeret. Sett lokket på petriskålen slik at eggene bli fuktig.
- Avlive mannlige stingsild i 0,025% Tricaine-S bufret med 0,1% natriumbikarbonat.
- Skjær åpne magen, fjerne testiklene og macerate i 250 mL Hanks oppløsning (se Wester 44 for fullstendig protokoll for Hanks løsning forberedelse).
- Gjødsle på det meste 100 egg med 50 pl sperm løsning og rør forsiktig med pipette for å sikre at alle eggene er befruktet. Dersom clutchen er> 100 egg, gjødsle halvparten av eggene senere for å sikre at alle embryoer er på en en-trinns celle ved injeksjonstidspunktet. Egg kan stå ubefruktetved romtemperatur i opptil en time, og sperm vanligvis varer i 1-7 dager ved 4 ° C i Hanks oppløsning.
- Hold embryoer dekket med petriskål lokket etter befruktning for å hindre uttørking. Tillat 20-25 min for den første cellen å dukke opp og hovne opp (forberede injeksjonsmateriale i løpet av denne tiden).
- Fyll en 150 mm x 15 mm petriskål med stingsild vann. (For å gjøre stingsild vann, først fremstille 10% natriumbikarbonat oppløst i avionisert vann. Deretter legger 3,5 g kunstig sjøvann blanding og 0,217 ml 10% natriumbikarbonat per 1 liter avionisert vann, og rør / rist kraftig for å oppløse salt.)
- Forbered Injeksjon Solution (Mens Egg er gjødsling)
- Forbered injeksjon løsning i henhold til tabell 1 og butikk på is.
Merk: konsentrasjonen av enkelte nukleinsyrer har blitt økt fra det som er publisert for sebrafisk som følge av det økte volumet av stingsild blastomere.
- Forbered injeksjon løsning i henhold til tabell 1 og butikk på is.
| reagens | Tol2 injeksjon | BAC injeksjon | TALEN injeksjon | CRISPR injeksjon |
| Tol2 mRNA | 350 ng | 350 ng | - | - |
| DNA | 150-200 ng plasmid | 200-300 ng BAC | - | - |
| TALEN mRNA | - | - | 200 ng hver | - |
| CRISPR guide RNA | - | - | - | 200 ng |
| Cas9 mRNA | - | - | - | 400 ng |
| 0,5% fenol rødt inDulbecco PBS | 0,5 ul | 0,5 ul | 0,5 ul | 0,5 ul | RNase fritt vann | til 5 pl | til 5 pl | til 5 pl | til 5 pl |
Tabell 1:. Injiserbare reagenser Alle blandinger bør være forberedt til et totalt volum på 5 ul og lagret på is.
- Fyll Needles (On Ice; Tillat i minst 10 min for Needles å fylle).
- Fylling minst tre nåler ved å pipettere 0,5 mL injeksjonsoppløsningen på den butte øverste enden av nålen mens nålene henger vertikalt i kapillær lagring krukke. Vær forsiktig at fallet forblir på toppen og ikke drypper ned på siden og unngå bobler.
- Etter den røde væsken har hovedsakelig dreneres til den spisse tuppen av nålen, legge til et 0,5 mL til den butte enden av nålen og la det renne.
3. Forbered Injiser Rig og Needle for Mikroinjeksjon
Merk: Disse trinnene cen vanligvis gjøres etter gjødsling eggene.
- Slå på lys gjennomlysnings for dissekere mikroskop og sette inn en ~ 13 cm x 13 cm glassplate på mikroskopet lys base med 15 cm plaster sagblad på toppen av glassplaten 7. Orientere sagen vinkelrett på injeksjonsapparat med fordypningene vender mot nåleholderen.
- Slå på lufttilførsel og sikre trykk er satt til ~ 200 kPa fra regulatoren.
- Slå på styreboksen og justere innstillinger. Sett press til ~ 150-175 kPa. Sett injeksjon varighet til 180 ms.
- Løsne nåleholderen, sette inn en fylt nål inn i holderen til motstand av gummiholderen kan føles, og stram til for hånd.
- Juster nålen vinkel til ca 45 °.
- Bruke mikromanipulator kontrollene for å justere nålen slik at slutt er sentrert i synsfeltet. Zoom inn for å ~ 40X forstørrelse og fokus på tuppen av nålen, som ikke bør berøreglasset under.
- Forsiktig bryte nålespissen ved å gripe den med urmakeri tang. Ideelt sett ikke bryter loddrett, men heller på en ~ 60 ° vinkel. Bryt nær spissen (ikke mer enn 2-3 tang bredder bort fra enden, figur 2).
Figur 2. ubrutte og brutte mikroinjeksjon nåler. Den øverste nålen er ubrutt og tuppen av bunnen nålen er brutt med pinsett (pil). Nålene er fylt med en løsning inneholdende 0,05% fenolrødt. Scale bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Trykk injeksjons pedalen flere ganger for å teste om nålen er brutt. Etter noen få trykk, bør små røde dråper begynner å komme ut av than ende. Hvis ikke, kan du prøve å bryte nålen litt høyere.
- Hvis nålen har en luftboble, øke mottrykket enhet og trykk på pedalen flere ganger raskt å jobbe boblen ut.
- Juster mottrykk:
- Bruk engangs overføringspipetten å plassere noen dråper stingsild vann på glassplaten.
- Senk nålen ned i vannet.
- Øke mottrykket inntil en svak strøm av rosa væske kommer ut fra nålen (som indikerer positivt trykk).
Merk: Hvis det ikke er tilstrekkelig mottrykk, vil nålen trekke opp cytoplasma ved kapillærvirkning. Dersom det er for mye mottrykk, kan injeksjonsvolum være utilsiktet for stor. - Trekke nålen tilbake så langt som mulig, slik at det ikke vil bli skadet ved utarbeidelsen av embryoene (se nedenfor).
- Alternativt kan justere mottrykket til et høyere trykkinnstilling, slik at en konstant sterk strøm av væske kommer ut av nålen whøne det er nedsenket i vann. Deretter trykker pedalen å injisere blir unødvendig; imidlertid, må injeksjonen utføres raskt for å unngå over-injisering.
Merk: Ikke prøv denne teknikken når først lære å injisere.
4. Mikroinjeksjon
- Om 25 min etter befruktning, bruke to 10 mL pipette tips for å fjerne 5-10 embryoer fra clutchen og overføring til glassplaten.
- Fortsatt bruker pipette tips, forsiktig skille embryoene i individuelle innrykk av sagbladet. Vær forsiktig for ikke å punktere embryoer.
- Ved hjelp av en overføring pipette med slutten kuttet så stingsild embryo vil passe inn, legger nok stingsild vann til å dekke embryoene, la vannet på i 3-5 sekunder, og deretter fjerne overflødig vann med pipette, og etterlater en liten mengde vann belegg hvert embryo.
Merk: For mye vann vil føre til at chorions å herde og bryte nålen, men en liten mengde vann er nødvendig for å løfte chorion bort fra cellen og eggeplomme (figur 3A - B). - Fra og med embryo lengst unna, skyv glassplaten og zoome inn slik at den første embryoet fyller ca 25% av synsfeltet.
- Senk nålen inn i synsfeltet, og deretter bruke 10 mL pipette tips å forsiktig rotere embryo for å identifisere blastomere, et kornete, litt gul hevet bump av cytoplasma på toppen av eggeplomme (figur 3B), og deretter rotere slik at den blastomere er direkte vinkelrett på enden av nålen (samtidig beholde fosteret i innrykket av sagbladet, figur 3C).
Merk: eggeplomme dråper kan flytte så embryoet roteres, så ikke bruk dem som en referanseramme for plasseringen av blastomere. - Senk nålen inn i cytoplasma, men ikke presse gjennom til den underliggende eggeplomme. Påfør press sakte og jevnt når piercing chorion å unngå å bryte nålen. Dersomnålen svinger sterkt, trekke tilbake og prøve igjen på en litt annen plassering.
- Trå pedal 3-4 ganger for å injisere slik at en rød bolus med noe diffus kanter fyller omtrent ~ 1/8: diameteren til cytoplasma (se figur 3D).
- Unngå å få en rød bolus med skarpe kanter som ikke begynner å spre, noe som indikerer injeksjon i eggeplomme under cytoplasma (Figur 3E).
- Hvis en lys rosa-rød flekk diffunderer raskt, stikk nålen ytterligere å punktere blastomere.
- Hvis injeksjonen bolus blir gul umiddelbart, rotere embryo for å sikre blastomere har vært målrettet og injisere igjen (Figur 3F).
Figur 3. Utseende av stingsild embryoer før og etter injeksjon. Alle embryoer er hentet fra the perspektiv ser ned gjennom mikroskop (med unntak av C 'og G). (A) Før du legger til vann, befruktede embryoer har et ensartet utseende med oljedråper flyter nær toppen av eggeplomme. (B) Etter å legge vann, chorion sveller, avslører en blastomere som stikker fra plomme og er synlig i profilen. (C) Rotasjon av embryoet, slik at nålen kommer inn vinkelrett på chorion og blastomere. (C ') sideriss av en nål som har punktert chorion med spissen i cytoplasma. (D) Injeksjon inn i cytoplasma resulterer i en rød flekk med diffuse kanter som falmer over tid. (E) Injeksjon inn i eggeplomme underliggende cytoplasma resulterer i en rød flekk med definerte kanter. (F) Injeksjon inn i eggeplomme motsatt cytoplasma resulterer i en pH-indusert farge skiftet fra rød til gul. (G) Lateralvisning av injeksjon utfall, med Xs enn sub-ideelle injeksjonssteder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bruk mikromanipluatoren kontroller for å trekke nålen, med 10 mL pipette tips for å holde nede fosteret hvis det holder seg til nålen.
- Etter trekke nålen, skyv glassplate for å justere neste embryo med nålen.
- Etter injisering alle embryoer, bruker overføring pipette for å legge vann til embryoene, og samle dem i overføringspipetten og plasser i 150 mm petriskål full av stingsild vann.
- Tørk av glassplaten med et papirhåndkle for å unngå ansamlinger av for mye vann.
- Fordel ferske embryoer på sagen og gjenta trinn 4.4 gjennom 4.10.
- Hold ~ 10% av embryoer som uninjected kontroller for å sikre at uninjected embryoer utvikle seg normalt og bruke som vill-type kontroller for than molekylære analyser beskrevet nedenfor.
5. Post Injeksjon Care
- Inkuber embryoer i petriskåler ved 18 ° C etter injeksjon før klekking 10. Etter klekking, bak larver i akvarier som beskrevet 10.
- Forsiktig helle av stingsild vann en dag etter injeksjon og erstatte med frisk stingsild vann. Bytt ut med fersk stingsild vann minst annenhver dag etter det.
- Se etter døde eller misdannede fostre daglig. Fjerne slike embryoer for å forhindre forråtnelse forurenser vannet.
6. Analyse av Injection resultater
- For injeksjon av fluorescerende reportere, overvåke embryoer daglig i et mørkt rom ved hjelp av et fluorescerende dissekere mikroskop med en GFP eller RFP filter (avhengig av fluorescerende transgenet). Rekord anatomiske genekspresjonsmønster med digitale bilder og / eller skriftlige beskrivelser og tabulation av antall fisk med forskjellige expressjons domener (figur 4 og 5).
Merk: Sticklebacks har autofluorescent, stelpigmentceller som er synlig under GFP filtre begynner på 4 dager etter befruktning (DPF).- For å generere stabile linjer, lagre embryoer med målbart fluorescens og vokse til voksen alder som beskrevet 10.
- Utkrysning injisert voksen fisk til vill-type fisk ved hjelp av in vitro fertilisering fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2.2 og skjerm avkom for fluorescens som beskrevet i trinn 6.1 til å lete etter fluorescerende avkom, noe som indikerer vellykket transgenet overføring.
- For å visualisere fluorescens i klekket, frittsvømmende larver, tilsett 500 mL 0,8% Tricaine til 150 mm petriskål til bedøver fisken og vente til fisken stopper flytting til bilde. Skyll straks flere ganger med fersk stingsild vann følgende observasjon og bildebehandling.
- Eventuelt å bevare fluorescens for videre bildebehandling, avlive larver i0,025% (250 mg / l) Tricaine bufret med 0,1% natrium-bikarbonat og feste i 4 timer i 4% paraformaldehyd i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C. Oppbevar i 1x PBS i opptil to uker.
Merk: bakgrunn auto-fluorescens øker over tid.
- Diagnostic PCR / fordøyelse Genotyping for Mutation Induksjon med CRISPRs eller Talens - Best Spilt på 2 dager Post befruktning.
- Bruk en overføring pipette for å plassere 10 injisert embryo (2 DPF, fortsatt i chorions) i de første 10 brønnene i en 12-brønns PCR stripe tube. Plasser-injiserte kontroll fisk i de to siste brønnene.
- Fjern overflødig stingsild vann.
- Tilsett 50 ul lyseringsbuffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% Tween-20, og 0,3% NP-40) til hver brønn.
- Plasser caps på rørene og inkuber ved 95 ° C i 20 min i en termosykler.
Merk: eggeplomme vil bli hvit og gummiaktig etter koketrinnet. - Fjern lokk og bruke en annen cleen 1000 mL pipette tips til macerate embryoet i hvert rør.
Merk: Hvitt smuss vil samle seg på bunnen av røret. - Legg 2,5 ul av 10 mg / ml proteinase K til hver brønn.
- Erstatte lokk og inkuberes ved 55 ° C i 1 time for å fordøye protein, etterfulgt av 95 ° C i 20 min for å inaktivere proteinase K. Oppbevar ved -20 ° C for å unngå muggvekst.
- Utfør PCR ved hjelp av en high-fidelity polymerase følge produsentens instruksjoner. Bruk embryo lysat som DNA-templat.
Merk: Vær forsiktig med å fjerne væske fra toppen av røret for DNA mal, og dermed unngå synlig chorion eller eggeplomme rusk på bunnen av røret. - Bland PCR-produktet i like stort volum med et restriksjonsenzym konsentrat-blanding inneholdende 1 x enzymspesifikk buffer og 0,25 pl enzym per prøve. lagre alltid halvparten av det uslipte PCR-produktet for å analysere på en gel for å bekrefte PCR-produkter er den forutsagte størrelse. Inkuber PCR blandet med enzym ved de aktuelle forhold forrestriksjonsenzymet.
Merk: Noen enzymer kan kreve andre forhold av enzymet buffer til PCR produkt; justere buffer konsentrasjonen hvis uninjected kontrollene ikke viser komplett fordøyelsen. - Etter fordøyelse, for å kjøre produkter på en 1% agarose-gel ved siden av et DNA-størrelse stige bekrefte forventede produktstørrelser.
Merk: Uncut band i injiserte embryoer indikerer tilstedeværelse av molekylære lesjoner (figur 6) og uninjected kontroller må være fullstendig fordøyd å tolke resultatene. - For å bekrefte lesjoner, kuttet ut uncut band fra agarosegeler og rense DNA med en gel utvinning kit. Bruk Sanger-sekvensering, ideelt sett med en sekvense primer interne til PCR primere, for å bekrefte lesjoner. I F 0 injiserte embryoer, vil en blanding av lesjoner sannsynligvis være til stede, slik at kvaliteten av Sanger les for å nedbryte nær målstedet.
- For å produsere en stabil linje, lagre alle injiserte embryoer fra klørne som skjermen positivt for molekylær lesjoner. Grad opp fisk, kryssinger, og deretter screene et delsett av F-1 embryoer for molekyl lesjoner som beskrevet i trinn 6.2.1 gjennom 6.2.11. Hvis heterozygote bærere er identifisert, blir de resterende F 1 embryoer til voksen alder og identifisere heterozygote individer som bruker DNA ekstrahert fra en halefinnen klipp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For reportergen transgener som har enhancer aktivitet, vil vellykket injeksjon resultere i spesifikk, cellulær ekspresjon av transgenet (figur 4A, 4C). Injiserte fisk kan deretter outcrossed for å fremstille stabile linjer (eksempel på en BAC stabil linje vist i figur 4B). Injisering DNA inn stingsild embryoer vanligvis resulterer i langt høyere dødelighet enn RNA alene. Det er vanlig å se opp til 50% (noen ganger enda mer) letalitet eller misdannelse (se figur 4D - F, 4I) etter injisering av Tol2 reporter-konstruksjonene (i likhet med den tidligere beskrevne metode meganuclease 21). Imidlertid varierer resultatene mye basert på den spesifikke konstruksjonen, embryoet morfologi, og ferdighetsnivå. For en aktiv forsterker, 40-50% av embryoene vanligvis vil vise vev-spesifikk ekspresjon transgenet, for eksempel i de midlere og brystfinnene (Figur 5). Graden av bakgrunn og ikke-spesifikk fluorescens (Figur 4G - I) varierer mye basert på arrangøren som brukes; sebrafisk hsp70l promoteren har en tendens til å være utett, særlig i muskel og nervevev, og BACS tendens til å ha høy bakgrunn ekspresjon i eggeplomme (tilsvarende figur 4G). Karpene beta aktin 41 promoter er mindre lekk, men driver også betydelig svakere GFP uttrykk. Overføring av Tol2 plasmid transgener kan være høy, med opp til 100% av GFP + F 0 fisk fremstilling av transgent avkom (tabell 2). Imidlertid prosent av avkom som bærer transgenet varierer mye, fra <1% til 72% (tabell 2). Lagrer bare GFP + injiserte embryoer generelt øker transmisjonseffektivitet. BACS tendens til å ha langt lavere transgenesis priser, med bare opp til 10% av F 0 injisert stingsild embryoer som viser fluorescens i forventede vev. den transmisjonshastighet på BACS er lavere enn den til plasmidkonstruksjoner, med bare opp til 14% av siktet stingsild overføring av BAC (tabell 2), som er lik den rapporterte overføringshastighet på 15% i 32 sebrafisk.
I motsetning til den relativt lave effektivitet av BAC transgenesis, typisk 70-100% av screenet fisk injisert med Talens har mosaikk lesjoner (i n = 10 injisert clutcher som ble screenet for lesjoner). Dette tallet kan være lavere med en mindre effektiv TALEN par, og kan variere med injeksjon kvalitet. Figur 6 viser en PCR / begrensning fordøyelsen i 10 embryoer fra en enkelt clutch injisert med Talens rettet mot en PvuII kutt område innenfor Tfap2a. En uskåret amplikon i hver av de injiserte embryoer (sporene 1-10) indikerer at en del av cellene i hvert embryo bære lesjoner på målet locus, skjønt hvert embryo er meget mosaikk med en betydelig vill-type snitt band. the fragment fra uninjected embryoer i baner 11-12 er helt fordøyd med PvuII. TALEN-induserte mutasjoner er lett overføres til den neste generasjon. Med to forskjellige TALEN setter, 50% og 90% av skjermede F 0 s overføres lesjoner til avkom, med 20-90% av avkom bærer lesjoner i positive klørne (Tabell 3). Mens CRISPR / Cas9 effektivitet ikke er optimalisert i stingsild, med en CRISPR guide målretting Pitx2, en av tre injiserte embryoer hadde lesjoner basert på Sanger-sekvensering av PCR produkt av CRISPR mål (det uslipte bandet ble sekvensert følgende begrensning fordøyelsen, figur 7). Tapet av sekvensen kvalitet ved den anslåtte snitt området indikerer en blanding av molekylære lesjoner er til stede. Fin klipping voksen F 0 fisk og screening for lesjoner ved hjelp av en PCR og begrensning fordøyelse analysen fant 10/22 fisk med somatiske lesjoner i finnen. En representativ delmengde av disse dyrene er vist i figur 8 </ Strong>; individ # 3 har en høy andel av DNA med lesjoner, mens individ # 2 har en lav prosentandel av DNA med lesjoner.
Figur 4. Eksempler på injiserte embryoer. (A) Mosaic embryo injisert med en forsterker som driver GFP uttrykk i pectoral (stjerne) og median finnene (pilspiss) på 5 dager etter befruktning (DPF). Scale bar = 500 mikrometer. (B) Stabil linje av en reporter BAC som driver GFP uttrykk i embryonale hjertet ved 4 dpf. (C) Mosaic embryo injisert med en Col2a1a enhancer som driver mCherry uttrykk i ryggstreng på 4 dpf. Den col2 A1A Enhancer ble klonet fra stingsild DNA med primere 5'-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 'og 5'-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3 "som forsterker den konserverte ortologe Enhancer rapportert i Dale og Topczewski2011 45. (D) Eksempel på en normalt utvikle injisert embryo. (E - F) Eksempler på misdannede fostre med injeksjon traume; E mangler venstre øye og F har nekrotisk vev langs høyre side (pilspisser). (G) Eksempel på diffus GFP-ekspresjon i eggeplomme, sannsynlig et resultat av injeksjon i eggeplomme i stedet for den blastomere. (H) Eksempel på ikke-spesifikk GFP-ekspresjon i epidermis (pilspiss). (I) Bright, uspesifikke, detalj GFP uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Effektivitet av reporter konstruere injeksjon. Ti klør ble injisert med en 190 bp stingsild Bmp6 Enhancer constrduktet som driver brystfinnen og median fin uttrykk ved 5 dpf 20. Fra hver clutch, ble minst 20 embryoer kanten for å ha vev-spesifikk (bryst og / eller median fin) og / eller ikke-spesifikk (alle andre vev) GFP uttrykk. Prosentandelen av alle overlevende injiserte embryoer som har ikke-spesifikk og vev-spesifikk ekspresjon er vist som en boksplott. Horisontale linjer indikerer første kvartil, median og tredje kvartil; Linjene utvides til datum innenfor 1,5 IQR (interkvartilt område) av den første og tredje kvartil. Data er tilpasset fra Erickson et al. 2015 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. PCR og begrensning fordøyelsen å screene for TALEN-induserte lesjoner. En TALEN par målretting Tfap2a Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Sanger-sekvensering fra mosaikk F 0 CRISPR / Cas9 injisert embryo. En CRISPR guide RNA (5'-GTGGACCAACCTCACGG-3 ') mot Pitx2 (vist øverst) var ko-injisert med mRNA Cas9 (transkribert fra pCS2-nCas9n plasmid som beskrevet 38) og embryoene ble undersøkt for lesjoner ved hjelp av et restriksjonsenzym-analyse. Den uncut Bandet var gel trukket ut og sekvensert av Sanger-sekvensering. Sekvensen kvalitet forringer på spådd kuttesete (pil nedenfor) på grunn av mosaikk blanding av lesjoner stede i den injiserte embryo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Analyse av CRISPR F 0 halefinneklipp. DNA ble fremstilt av fin klipp fra F 0 yngel hevet fra embryoer injisert med CRISPRs mot Pitx2. Den CRISPR / Cas9-mål ble amplifisert med primerne 5'-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 'og 5'-GGCCCAAATTACCCACATTT-3', og produktet ble spaltet med EcoRI. Fire personer er vist; er en uncut PCR produkt på venstre side og er på høyre side for hver nummererte enkelte fordøyd PCR produkt. Produkt størrelsen av det uslipte båndet (~ 230 bp) i den spaltet kjørefelt indikerer tilstedeværelsen av en lesjon. Personer 2, 3 og 4 viser alle tegn på et molekylært lesjon, indikert med stjerner, med varierende mosaicism mellom individer. Relevante stige Størrelsene er angitt på venstre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Konstruer | GFP avkom / totalt F0 screenet fisk (%) | % F1 avkom positiv | notat |
| BAC A | 6/46 (13%) | 4-19% | |
| BAC B | 1/41 (2%) | 4% | |
| BAC C | 5/42 (12%) | 3-40% | |
| BAC D | 3/22 (14%) | 5-15% | |
| plasmid A | 2/38 (5%) | 2-5% | alle F0 embryoer skjermet, ikke bare GFP + |
| plasmid B | 3/16 (19%) | <1-8% | alle F0 embryoer skjermet, ikke bare GFP + |
| plasmid C | 1/11 (9%) | 10% | |
| plasmid D | 2/11 (18%) | 1-45% | plasmid D sprøytet inn2 genetiske bakgrunn |
| plasmid D | 5/5 (100%) | 16-72% | |
| plasmid E | 2/3 (67%) | 2-22% | |
| plasmidet F | 2/6 (33%) | <1-65% | |
| plasmid G | 3/8 (38%) | 2-56% | |
| plasmid H | 3/18 (17%) | ikke scoret | |
| plasmid jeg | 5/24 (21%) | ikke scoret |
Tabell 2:. Transgen overføringseffektivitet for BACS og forsterkerkonstruksjoner F 0 injisert embryoene ble hevet til voksen alder, og deretter outcrossed til vill-type fisk og F 1 avkom scoret for GFP fluorescens. Antallet F 0 individer som overføres transgenet er expressed som en prosentandel av alle vist F 0 fisk. Utvalget av prosentandeler av F 1 avkom som bærer transgenet er også vist for de clutcher som hadde GFP positiv fisk.
| TALEN | % F0 overføring lesjoner | % F1 avkom positiv |
| EN | 9/10 (90%) | 20-90% |
| B | 4/8 (50%) | 20-72% |
Tabell 3:. Transmisjon effektivitet for to Talen par F 0 injisert embryoene ble hevet til voksen alder, og deretter outcrossed til vill-type fisk og F 1 avkom screenet for Talen lesjoner. Prosentandelen av injiserte personer som overfører lesjoner er vist, så vel som omfanget av prosentandeler av avkom med lesjoner i disse clutcherat overfør lesjoner. TALEN En målrettet en Bmp6 Enhancer 20, TALEN B målrettet Tfap2a (upublisert).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Injisere en celle stingsild embryoer for transgenesis eller genom redigering presenterer tre hovedutfordringer. Først i forhold til sebrafisk embryoer, er stingsild embryonale chorion tøff og vil ofte bryte nåler. Dette problem kan delvis løses ved å anvende tykkere og sterkere glass mikropipetter og injisere vinkelrett på chorion (se protokoll, figur 2). Å sikre at så lite vann som mulig tilsettes til embryoene (akkurat nok til å bevirke at chorion til å svelle og løfte vekk fra celle) bidrar til å redusere chorion hardhet. Chorion herder over tid, så jobber raskt etter fukting embryoene er viktig. Å holde embryoene i et fuktighetskammer før injeksjon, slik at de ikke tørker ut er også kritisk. Noen koblinger og selv enkelte embryoer rett og slett har mye tykkere og tøffere chorions; noen ganger går videre til neste embryo eller prøver med en ny clutch er den enkleste løsningen. Det er mye lettere å hoppe over en d ifficult embryo enn å erstatte en ødelagt nål. Å ha backup nåler klar vil tillate injeksjoner for å fortsette i tilfelle av nålen brekker. Ved injeksjon BACS, er det vanlig for nålen å tette. Nålen kan unclogged ved å forsiktig skrape eller re-bryte tuppen med pinsett, eller ved å bruke konstant lufttrykk bryteren for å rense tette.
For det andre, som identifiserer den første cellen i embryoet er utfordrende; det er ofte ganske flat og vanskelig for nybegynnere å se, og er spesielt usynlig når man ser direkte på den. Ofte blastomere kan bare bli sett på som en litt hevet bump i profil. Derfor er det best å identifisere cellen i profilen (figur 3B) og deretter forsiktig rotere embryo forover og til siden, slik at cellen vil stå overfor enden av den vinklede nålen (selv om cellen vil ofte være usynlig fra denne vinkelen, og den mørkere farge på blastomere i figur 3 er overdrevet for klarhets skyld).
e_content "> For det tredje, rettet mot cytoplasma er også vanskelig, spesielt hvis den første celle er spesielt flatt. Sikter for feiteste delen av blastomere (vanligvis midten) forbedrer muligheten av å injisere inn i cytoplasma. Mens å injisere inn i eggeplomme nær cytoplasma kan lykkes produsere transgen fisk, synes effektiviteten økes og dødelighet reduseres når cytoplasma er målrettet med en enkelt nål punktering. Noen ganger vil enkelte clutcher har spesielt tynne blastomeres, slik at du unngår plommen er nesten umulig. venter lenger enn 25 min til å begynne injeksjoner kan hjelpe (noen clutcher danner ikke en full størrelse blastomere til ~ 45 min etter befruktning), men hvis de blastomeres aldri øke i størrelse, er det ofte lettere å få en ny clutch av egg enn å prøve å injisere flate celler .For høye dødelighet etter injeksjoner kan oppstå av flere grunner. Sløve nåler og / eller for stor en nål boringsstørrelse kan føre til too mye skade på cellen og / eller forårsake cytoplasma å lekke ut. Noen DNA-konstruksjoner synes å være spesielt dødelig; senke konsentrasjonen av DNA kan forbedre overlevelse, men lavere transgenesis priser. Rydder opp plasmider først med en midiprep kit som inneholder en endotoksin skylling etterfulgt av en andre PCR opprydding kit reduserer konstruere toksisitet. Endelig kan genom redigering frembringe et tap av funksjon mutasjon som er dødelig for utvikling av embryo. Redusere konsentrasjonen av den CRISPR eller TALEN mRNAer kan øke mosaicism av embryoet for å forhindre dødelighet, men kan redusere mutant allel virkningsgrad.
En tidligere utgitt protokoll for å generere transgene stingsild ved hjelp av en meganuclease metode 21 rapporterte en 4-7% transgen kimcellelinje overføringshastigheten fra F 0 grunnleggeren fisk. Den Tol2 metoden rapportert her resulterte i opp til en 72% transgen kimcellelinje overføringshastigheten fra F 0 grunnleggeren fisk (som indikerer flere genomisk integrationer). Den tidligere studie ved hjelp av en meganuclease metode rapporterte 40% av injisert embryo som viser spesifikk GFP uttrykk, lik den som er rapportert her. Dermed mens tilsvarende priser av transgene F 0 gründerne er observert for transgen fisk generert av både meganuclease og Tol2 metoder, vises kimcellelinje overføringshastigheten mye høyere for Tol2 mediert transgene.
Som genom redigering teknologier fortsetter å avansere, vil enda mer spesifikke genetiske manipulasjoner bli mulig i stingsild og andre fiskearter. For eksempel vil rettes reparasjon 46 og homolog rekombinasjon tillate allel bytteavtaler mellom marin og ferskvann stingsild genomer, og modifiserte CRISPRs kan brukes til å spesifikt aktivere eller hemme genekspresjon 47. Disse spennende teknologier for genom redigering og analyse vil føre til ny innsikt om genetiske grunnlaget for mange interessante morfologiske, fysiologiske og atferdsmessige fenotyper i sticklebacks og andre fiskearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert delvis av NIH R01 # DE021475 (CTM), en NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE), og en NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Vi takker Kevin Schwalbach for å utføre BAC recombineering og injeksjoner, Nick Donde for generering CRISPR Sanger-sekvensering av data, og Katherine Lipari for nyttig tilbakemelding på injeksjons protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | - | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm Petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 mm x 10 mm Petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50x Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10 Kb RNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10x PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1 kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
References
- Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
