Summary
인 - 필드 응용을위한 작은 분자 검출하는 앱 타머 - 금 나노 입자의 비색 분석의 디자인 및 개발 평가 하였다. 또한, 스마트 디바이스 측색 프로그램 (APP)이 유효하고, 분석의 장기 보존이 분야에 사용하기 위해 설립되었다.
Abstract
인 - 필드 응용을위한 작은 분자 검출하는 앱 타머 - 금 나노 입자 (AuNP) 비색 분석의 디자인 및 개발 평가 하였다. 대상 선택 AuNP 기반 컬러 세이 제어 개념 증명 실험 설정에서 개발되었다. 그러나 이러한 방식들은 실험실 설정 이후 실용화를 결정하는 고장 지점으로 작용하지 않았다. 이 작품은 작은 분자 분석 및 인 - 더 - 필드 설정에 대한 분석을 사용하는 앱 타머-AuNP 비색 분석을 설계, 개발 및 문제를 해결하는 일반적인 방법을 설명합니다. 흡착 된 압 타머의 나노 입자 표면에 패시베이션 및 줄이고 비 표적 분석을 거짓 양성 반응을 제거하기위한 수단을 제공하기 때문에 분석은 이점이있다. 실질적인 사용이 시스템은 앱 타머-AuNP 에세이뿐만 아니라 유통 기한을 한정해야 천이하지만 장기 저장 capabil를 확장하기위한 방법 및 절차를 확립ities. 또한, 측색 판독으로 인식 된 문제들 중 하나를 정확하게 컬러의 미묘한 변화를 자주 확인하는 분석의 부담이다. 필드 분석에 대한 부담을 완화하기 위해, 컬러 분석 프로토콜은 실험실 수준의 장비에 이러한 작업을 수행 할 필요없이 컬러 식별 임무를 수행하도록 설계되었다. 데이터 분석 프로토콜을 작성하고 테스트하는 방법을 설명한다. 그러나 이해 흡착 앱 타머 세이의 설계에 영향을, 상호 작용은 앱 타머 대상과 연관 AuNPs 더욱 연구를 필요로한다. 얻은 지식은 개선 된 기능을 앱 타머를 맞게 발생할 수 있습니다.
Introduction
색채는 분석 화학에서 사용되는 가장 오래된 기술 중 하나입니다. 이 기술의 경우, 분석 물의 정 성적 또는 정량적 판정 착색 화합물 1의 제조에 기초하여 이루어진다. 통상적으로, 컬러 분석은 가시광 스펙트럼에서 관찰 또는 검출 가능한 색상 변화를 초래 분석 종의 존재하에, 컬러 시프트가 발생 시약을 사용한다. 측색 그러한 디옥시리보 산 (DNA), 펩타이드 및 단백질 2-4 복잡한 생물학적 분자 원자, 이온 및 소분자 이르기 타겟의 검출에 사용되었다. 지난 수십 년 동안, 나노 물질, 특히 색상 기반 분석 5-6으로 검출 분석의 분야에 혁명을했다. 항체, 올리고 뉴클레오티드 앱 타머 또는 펩티드 앱 타머 등의 표적 선택적 인식 요소와 나노 물질의 독특한 화학적, 물리적 특성을 결합하여 부활하게되었다 난설계 및 발색 검출법 (7)의 발전 N.
금속 나노 입자는 다수의 비색 분석의 설계에 이용 된 증명 사이즈 - 의존 색 변화 특성을 갖는다. 금 나노 입자 (AuNPs)이 때문에 입자의 분산 솔루션은 일반적으로 소금의 정확한 추가하여, 8 집계 유도하는 특유의 붉은 - 투 - 파랑 색상 변화에 특히 관심이다. 응집 된 (청색) 상태로 분산 된 (적색)의 전환을 제어하는 기능은 이온, 작은 분자, 펩티드, 단백질 발색 센서, 세포 표적 2-4,9 생성하게되었다. 이러한 센서의 대부분은 대상 인식 모티브로 앱 타머를 사용합니다.
압타 머는 10 (12) -10 (15) 다른 시퀀스 10-11의 임의의 풀에서 선택 DNA 또는 리보 핵산 (RNA) 분자이다. 상기 선택 프로세스는 타겟 재를 식별인지의 낮은 나노 몰 정권에 결합 친 화성을 가진 요소, 지수 농축 (SELEX)에 의해 리간드의 체계적인 발전은 가장 일반적으로 알려진 과정 12 ~ 13입니다. 센싱 애플리케이션을위한 올리고 뉴클레오티드를 기반으로 앱 타머의 장점은 합성의 용이성, 제어 화학 수정 및 화학적 안정성 14-15을 포함한다.
비색 분석을 만드는 한 가지 방법은, 인식 요소 나노 결합 AuNP 표면에 DNA-앱 타머 분자의 물리적 흡착을 통해 두 종과 함께 구성된다. 목표 압 타머 바인딩을 통해, 앱 타머은 염의 첨가 유도 적색 대 청색 반응 (19)에 이르는 AuNP 표면 앱 타머와의 상호 작용을 변화시키는 구조 변화가 발생 16-18. AuNPs 이러한 놀라운 특징은 해제하는 데 사용할 수있는 앱 타머 기반 장치에 대한 관찰 비색 반응 메커니즘을 제공한다다른 분석을위한 비색 분석에 서명.
AuNP 표면에 비 - 공유, 물리적으로 흡착 된 DNA 앱 타머를 사용하여 디자인 색상 분석으로 인해 안정성, 제어 실험실 설정 이외의 실패에 대한 성향 및 실제에 사용 가능한 정보의 부족 문제에 약한 센서 플랫폼이라는 오명을 설정. 그러나, 압 타머 AuNP - 기반 비색 분석법 때문에 운전 및 관찰 색 반응의 간략화 관심이었다. 이 연구의 목적은 분석 물로 대표 코카인하여 DNA-AuNP 기반 비색 분석법의 설계, 개발, 조작면의 환원과 관련된 거짓 양성 반응 및 장기간 저장을위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 또한, 우리는 때문에이 앱 타머-AuNP 엉덩이에 대한 기존의 접근 방식보다 적은 단계의 결과 사용의 간편성과 용이성에 유리한 것으로이 흡착 된 앱 타머 분석 방법 (그림 1) 제안AYS. 이 분석의 경우, 앱 타머 먼저 장시간 표면에 흡착 할 수 있었다 AuNPs에 첨가 하였다. 이 방법의 추가 장점은 AuNP 표면의 상호 작용에 관련된 비 표적 분석 물 분자에 응답하여 감소되었다. 그러나, 거짓 양성 반응의 감소 분석 민감도의 희생되었다. 따라서 표면 보호 분석 접근성 간의 균형은 적절한 분석 기능을 유지하는 것이 필요하다. 또한, 통해 컬러 분석을 분석의 주요 결함은 색상의 미묘한 차이를 구별하기 위해 노력하고 특히 계측 결과는 종종 주관적이고 분석 - 투 - 애널리스트의 해석에 열려있는 것입니다보다 다른 것을 의미한다. 반대로, 그러한 작품 등에 전력 가용성, 이동성과 실용성으로 실험실 외부 가능한 실험 계측 계를 만드는 문제의 개수가, 컬러 분석 프로토콜을 위해 개발 된 MOR전자 이동성과 일반적으로 색상 기반 분석 해석 20 ~ 21과 관련된 추측의 일부를 제거하기. 이전 방식에 비해, 이러한 노력은 실험실 설정 이외의 응용 프로그램에 대한 자신의 한계에 이러한 분석을 밀어 노력.
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Protocol
구연산 금 나노 입자의 감소 (AuNP) 및 특성화를 통해 1. 합성
- 5 ml의 삼각 플라스크 (500 mL) 및 큰 교반 막대를 청소 질산을 농축시키고 15 ml의 화학적 안전성 후드에서 진한 염산.
- 산 세척과 플라스크의 전체 표면을 젖은, 뉴 클레아 무료 물 플라스크를 씻어하고, 플라스크를 건조 할 수 있습니다.
- 1 mM의 금 (III) 클로라이드 100 ml의 추가; 비등까지 핫 플레이트에서 연속 교반하면서 산 세정 삼각 플라스크 가열의 상단을 덮는 알루미늄 호일 시트를 사용한다.
- 38.8 mM의 시트르산 나트륨의 10 ML을 추가합니다. 색상은 몇 분에 걸쳐 어두운 / 블루 블랙, 그리고 마지막으로 어두운 빨간색으로 취소 / 회색으로 변경됩니다. 10 분 동안 더위와 오프 교반을 계속합니다.
- AuNP 현탁액을 실온으로 냉각 연속 교반하면서 디 에틸 피로 카보 (DEPC)의 110 μl를 추가 할 수 있습니다.
- 와 전체 플라스크를 커버알루미늄 호일은 DEPC 처리 하룻밤 배양 할 수 있습니다. 황색 저장 용기에서 어두운 AuNPs 모두를 저장하거나 알루미늄 호일로 덮여있다.
- 실온까지 냉각 될 AuNP 현탁액을 오토 클레이브하고, 0.22 ㎛의 세공 셀룰로스 아세테이트 멤브레인 필터를 통해. 4 ℃에서 어둠 속에서 여과 멸균 AuNP 원액을 저장합니다.
참고 : DEPC로 처리, 4 ° C에서 오토 클레이브를 통해 살균 및 저장은 압 타머 - AuNP 분석의 저장 수명을 향상시킬 수 있습니다. 이와 같이 스토리지 2 개월 이상에 대한 기능 유지 분석을 허용 할 것이다. - 520 nm의 자외선 - 가시 흡수를 획득하여 AuNP 농도를 계산하고, 농도 (C)를 계산하여 흡광 계수 (ɛ) 2.4 × 10 8 L 몰 -1 cm -1 맥주의 법칙을 사용합니다. 농도는 동적 광 산란에 의해 결정 15 nm의 크기가 10 nm 인 것으로 측정되었다.
참고 : 농도는 FR 달라집니다톰 배치 별. 원하는 10 nM의 AuNP 서스펜션을 유지하기 위해 필요에 따라 클레아 무료로 물을 AuNP의 주식을 희석.
2. DNA-앱 타머, 버퍼, 솔루션 및 분석 준비
- 구입 또는 표준 포스 화학 (22)를 사용하여 앱 타머 서열을 결합 다음과 코카인의 합성 :
MN4 19 : 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
MN6 19 : 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 ' - 표준 탈염 (23)를 사용하여 앱 타머를 정화. 100 μM 또는 1 mM의 재고 솔루션 중 하나에 뉴 클레아없는 물에 올리고 뉴클레오티드를 복원합니다. 몇 개월 동안 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
- 구매 또는 멸균 1 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) pH가 7.4 주식 제조, 100 mM의 염화 마그네슘 (의 MgCl 2), 1 M 염화나트륨.
- 클레아없는 물 위스콘신에서 버퍼의 50 ㎖를 준비개월간 실온 번째하는 20 mM HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, pH 7.4의 농도 및 저장.
- 실온에서 3 ~ 4 시간에 대한 재고 AuNP 용액 (10 ㎚)으로 DNA를 품어와 빛으로부터 보호합니다. 테스트가 (2.5-7.5 ml)로 수행 할 수있는 충분한 샘플을 제공하기 위해 원하는대로 AuNPs의 용적을 변화한다.
- 여기,이 연구에서 90, 120, 150, 180 DNA 분자 / AuNP의 적재 밀도를 사용합니다. 볼륨 이에 따라 DNA의 농도를 변화한다. 조정 비 표적 분석의 의도 AuNP 표면 관련된 색 반응을 줄이기 위해 DNA 커버리지.
참고 : DNA의 범위를 증가 시키면 분석 감도를 줄일 수 있습니다. 로딩 밀도는 AuNP 스톡의 농도를 알고있는 실험에서 사용하기 위해 요구되는 양으로 존재 AuNPs의 총 수를 계산하는 단계에서 계산된다. 실제 적용 밀도가 요구되는 경우, 프로토콜은 이러한 값 7을 얻었다 존재한다. DNA의 범위가 50 kDa의 m을 사용하여 측정 하였다olecular 무게 차단 스핀 열은 무료 DNA에서 AuNP 결합 된 DNA를 분리합니다. 무료 DNA 쉽게 통과 할 동안 AuNPs는, 스핀 컬럼을 통과하기에 너무 큽니다. 다음 단계는 흡광도 측정 또는 단일 가닥 DNA의 형광 염료를 사용하여 수집 자유 DNA를 정량화하는 것이다.
- 여기,이 연구에서 90, 120, 150, 180 DNA 분자 / AuNP의 적재 밀도를 사용합니다. 볼륨 이에 따라 DNA의 농도를 변화한다. 조정 비 표적 분석의 의도 AuNP 표면 관련된 색 반응을 줄이기 위해 DNA 커버리지.
- 20 mM의 HEPES, 2 밀리미터의 MgCl 2, pH 7.4의 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 어두운 하룻밤에 4 ° C에서 샘플을 배치합니다. 앱타 머는-AuNP 분석은 10 mM의 HEPES, 1 ㎜의 MgCl 2, pH가 7.4 (분석 완충액)에 있었다.
3. 소금 적정 및 분석 설정
- 상기 분석 빈 염 적정에 의해 분석 색 반응을 유도하는 데 필요한 초기 염 농도를 결정한다. 96 웰 플레이트에 앱 타머-AuNP 분석 180 ㎕를 분취 액에 메탄올 (빈)의 20 μl를 추가합니다. 당량점 재고 NaCl 용액 (1 M 2 M)의 부피가 증가함에 따라 샘플을 적정하고 결정 (도 2 참고 : 분석이 동일한 앱 타머-AuNP 분석에 빈 메탄올 (또는 용해 분석)의 비율을 유지하여 작은 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
- 여기서, 육안으로 조금 색 변화를 야기하는데 필요한 염화나트륨 볼륨을 결정한다. 분석의 시작 농도는 60 DNA 분자 / AuNP 범위의 밀도로 각각 밀리미터 및 MN4 130 밀리미터 및 MN6 (75)이었다.
주 : 초기 염 농도에 대한 정량 결정, 적정 곡선의 중간 점은 좋은 출발점으로 기능한다. 또한, 사용 농도는 매일 매일의 성능 및 배치 별에서 앱 타머, DNA 범위의 밀도에 따라 달라집니다.
- 여기서, 육안으로 조금 색 변화를 야기하는데 필요한 염화나트륨 볼륨을 결정한다. 분석의 시작 농도는 60 DNA 분자 / AuNP 범위의 밀도로 각각 밀리미터 및 MN4 130 밀리미터 및 MN6 (75)이었다.
- 분석 반응을 최적화 상온에서 96 웰 플레이트에 앱 타머-AuNP 분석을 180 ㎕의 분취 액을 메탄올로 희석하여 분석 물 분자의 20 μL를 추가한다. 즉시 분석 색 반응을 개시하기 이전 단계에서 결정된 염화나트륨 농도를 추가한다.
아니TE는 : 동시에 여러 실험을 수행하는 멀티 채널 피펫을 활용합니다. - 증가 또는 염화나트륨 농도를 감소 블랭크 응답 타겟 응답을 비교하여 가능한 한 최대의 색 변화를 얻었다. 가장 큰 응답의 차이를 제공하는 염화나트륨 농도를 사용합니다.
- 관찰 또는 염화나트륨 또한 다음과 같은 분석 응답 150 초를 측정한다. 분광 광도계를 사용하여 650 nm 내지 530 nm에서의 흡광도를 분석하거나 분석 응답 (사진 분석 프로토콜의 섹션 4 참조)의 디지털 카메라의 사진을 얻었다.
주 : 마이크로 플레이트 판독기 작품에 대한 측정치를 획득 하였다. - 분석 물 농도의 함수로서 650 nm 내지 530 nm의 (E 650 / E (530))에서 얻어진 흡광도의 비율로 결과를 플롯. 이 연구에서 수행 된 같은 빈 신호 분석 응답을 정상화.
4. 사진과 디지털 이미지 색 분석 프로토콜 분석
- 위해 준비 할설명 (섹션 3.2-3.3)로 분석 샘플을 전자. transilluminator가의 96 웰 플레이트를 놓습니다.
주 : 표준 실험실 transilluminator가 일반적이 분석을 위해 사용할 수있는 디지털 이미지를 얻을 너무 밝습니다. 이 transilluminators 정기적으로 인해 광원의 세기에 디지털 이미지에 표시 "어두운 라인"간격의 원인이됩니다. 발광 다이오드 (LED) 기반 광 박스에서 transilluminator가 제작 불투명 플라스틱 조각이 잘 작동한다. - 수학 식 1 내지 24에 도시 된 바와 같이, 증분 평균화 기술을 사용하여, NaCl을 첨가 한 후 150 초에서 96 웰 플레이트의 사진을 구하는 영상 분석 소프트웨어로 이미지를 반입하고, 보통, 적색, 녹색 및 청색 (RGB) 값을 계산한다 :
(1)
- 하기 식 (24)을 사용하여 표준 RGB (의 sRGB) 색 공간에서 색도도 (CIExyY) 색 공간을 RGB 값으로 변환 :
(2)
(삼)
(4)
- 수학 식 2 수학 식 3에 규정 된 행렬을 이용하여 선형 RGB 값을 지수 RGB 값을 변환하는 CIE 색 공간 (24)의 X, Y 및 Z 값을 계산하기 위해 사용된다.
- 분석 (24)에 대해 선택된 영역의 화소의 평균 색을 나타내는 수학 식 4를 이용하여 x 및 y 색도 값을 계산한다.
- 모든 웰에서 분석을 수행하고, 검정 곡선 (도 4)을 생성하기 위해 색도 값을 플롯. 동일한 웰의 다른 영역의 색을 분석하여 표준 오차를 구합니다.
장기 저장을위한 앱 타머-AuNP 분석 냉동 (5)
- 섹션 2.4 및 2.5에 설명 된 앱 타머-AuNP 분석 성분을 준비. 한제 솔루션을 만들기 위해 클레아없는 물 1 g / ㎖ 트레 할로 오스 1 g / ml의 자당을 포함하는 별도의 솔루션을합니다.
주 : 트레 할로 오스 수크로오스 고농도의 동결에 대한 분석을 준비 할 때, 희석 비율을 감소시키기 위해 사용되었다. 철저하게 사용하기 전에 설탕을 용해 물을 비이커에 뜨거운 접시에 설탕 솔루션을 가열. - 19.2 ㎎ / ㎖ 트레 할로 오스 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 200 μL의 최종 부피의 60 MN4-DNA / AuNP 분석으로 4.8 ㎎ / ㎖ 자당을 포함하는 솔루션을합니다. 최종 한제 솔루션 농도는 DNA 범위에 따라 달라집니다.
참고 : 샘플 300 μl를 초과 할 수 없습니다 냉동한다. 큰 볼륨이 제대로 고정되지 않을 수 있습니다. - 플래시는 -146 ° C의 냉동고 나 액체 질소를 이용하여 샘플을 동결. 사용할 때까지 냉동 샘플을 저장합니다. 스토리지는 -80 ° C에있을 수 있습니다 또는 -20 ° 동결이 완료되면 깜박 한 번 C.
- 이 작업을 위해, 이상 -146 ° C 형 냉장고에 샘플을두고박하고 장기 저장에 대해 -20 ℃ 냉동고에 옮긴다.
참고 : 플래시 동결은 압 타머 - AuNPs 집계 될 수 있습니다. 흡광도 프로파일을 모니터링하고, 고정 된 샘플과 비교하여 냉동 프로세스의 무결성을 테스트. 응집이 관찰되는 경우,이 문제를 보상하기 위해 냉각제 용액의 양을 증가시킨다. - 실온에서 샘플을 해동하고 실험에 대해서만 충분한 샘플을 필요를 사용한다. 해동 샘플의 흡광도 스펙트럼을 구하는와 고정 된 한제 솔루션 처리 샘플의 기준 스펙트럼을 비교합니다. 400 nm 내지 700 nm의 흡광도를 측정한다.
- 분석 (3.2)을 테스트, 소금 적정 (3.1)을 수행하고, 이전에 설명 된대로 결과 (섹션 3.3 및 3.4) 플롯.
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Representative Results
이 연구의 주요 목적은 개발 분야에 사용하기 위해 AuNP 비색 분석을 기반으로 안정성과 앱 타머의 견고성을 알아보고자 하였다. 이전 책에서 강조 표시된 바와 같이, 분석을 만들기위한 두 가지 전략 (7)을 조사 하였다. 분석법은 무료 앱 타머 분석 및 흡착 앱 타머 분석을 명명했다. 흡착 압 타머 분석은 fieldable 검출법 (도 1)의 목적을 위해 더 매력적이다.
. 앱 타머 흡착 분석법도 1 개략도 앱타 머는는 AuNPs와 혼합하고, 밤새 인큐베이션 하였다; 메탄올에 용해 된 분석 물 분자는 즉시 대상 추가시 AuNP 응집을 유도하기 위해 염화나트륨을 첨가 한 후, 흡수 된 앱 타머 분석법에 첨가 하였다.EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이는 비 표적 분석 상대적인 단순성 및 흡착 앱 타머 분석의 사용의 용이성을 탐지율 감소 하였다. 앱 타머 흡착 분석법을 제조하기 위해, DNA 앱 타머를-AuNPs과 혼합하고 분석 완충액에서 하룻밤 동안 배양 하였다. 이 앱 타머 쉽게 이러한 마스킹 또는 에이전트를 절단 등의 비 표적 분석 분자 거짓 긍정적 인 반응에 대한 분석의 감수성을 감소 AuNP 표면에 흡착하는 것을 허용했다. 그러나, MN4 코카인 앱 타머의 구조는 미리 형성된 상기 분석 설계 코카인 (대상)의 존재 하에서 활성화 하였다. 분석 염화나트륨 적절한 농도를 즉시 첨가하여 분석 용액을 첨가하여 사용 하였다. 염 용액은 관측 및 MEA를 개시하는 데 사용 된분석의 surable 색상 변경합니다. 분석은 2 ~ 3 분 이내에 실행했다. 검체 용액의 첨가 후.
이러한 물리적으로 흡착 DNA 기반 비색 분석법의 실행에서 중요한 조치 염의 적절한 농도의 첨가를 통해 유도 된 색 반응이다. 염의 첨가는 AuNPs 안정하고 입자 간 정전 기적 상호 작용을 감소 시트 레이트 층의 음전하를 마스킹함으로써, 입자의 응집의 결과로 AuNP 현탁액을 불안정하게하는 것으로 알려져있다. 결과는 관찰 적색 대 청색 변화이다. 동일한 효과는 DNA AuNPs 처리로 관찰된다. - DNA 앱 타머의 경우, 분석은 최소 관찰 AuNP 불안정화 (청색 착색)를 야기 할 필요는 염의 농도를 결정한다. 타겟 트의 첨가에 의해, DNA 앱 타머-하여 AuNPs 안정화 크게 obse 결과 감소rvable, 측정 대상 복용량 응답 색상 변경합니다. 이 변색은 염의 적절한 소정 양의 물을 첨가하여 감지 할 수있다.
마찬가지로 중요한 염의 적절한 농도를 측정 하였다하는 과정이다. 이 분석 블랭크의 시리즈 (도 2) 염화나트륨 용액 농도의 증가를 추가하여 적정 곡선을 수행함으로써 달성되었다.
도 2 솔트 유도 적정 곡선. 구연산염 안정화 (적색), MN4 코카인 결합 앱 타머 (초록), MN6 코카인 결합 앱 타머 (보라색) 처리 AuNP 샘플 염화나트륨으로 적정 하였다. 시각적으로 얻어진 초기 소금 농도는 각각의 곡선 색 화살표를 해당로 표시 하였다. 오차 막대는 표준 편차에 의해 정의된다측정 세중. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
여기서, 사용 초기 염 농도는 육안으로 판정하고, 상기 분석 빈 관찰 사소한 청색 착색의 원인이되는 염 농도로했다. 그러나보다 양적 접근, 연구진은 시작 소금 농도가 적정 당량점의 중간 지점을 사용할 수 있습니다 연구의이 지역에 처음. 이 점을 넘어 색상 응답이 빠르게 증가하기 시작한다. 또한, 상기 분석의 실행에 사용 된 염 농도가 분석 빈 코카인 반응 사이의 컬러 차이를 최대화하도록 조정 하였다. 이는 증가하고 적정에 의해 결정되는 양의 염 농도를 감소시킴으로써 달성되었다. 염 적정 절차는 매일 수행 하였다분석과 일상적인 변화를 차지한다. 상기 분석에 필요한 염 농도의 배치 변동은 20 %를 초과하지 않았다.도 2는 세 가지 AuNP 샘플 시트르산 안정화 (NO DNA), MN4 (DNA-앱 타머 안정화), 및 MN6은 (DNA-앱 타머 안정화)를 갖는다. MN4 MN6 및 샘플 DNA의 커버리지 / AuNP 60 DNA 분자이었고, 각각 적정 곡선은 표면 처리에 의해 제공되는 안정성의 레벨에 따라 다른 적정 당량점과 중간 점을 가진다. 구연산은 (단일 구조처럼 좌초)보다 안정성과 MN6를 제공 (이중 구조처럼 가닥) 작은 안정성, MN4를 제공 AuNPs에 가장 안정성을 제공했다. 이 연구에서 사용 된 최초의 소금 농도는 ~ 50 밀리미터 ~ 90 밀리미터, 시각적 ~ 130 밀리미터로 결정했다. 경향은 DNA 구조의 기존의 이해와 AuNPs 24 ~ 25에 해당 안정화 효과에 동의합니다. 시각적으로이 테스트를 수행 할 때 분석 빈은 약간 파란색의 원주를 보였다 한 바와 같이 중간 점에 가까운 화살표 그림 2에서 식별 된 소금 농도와 기. 선행 논문 포인트 염 농도는 거의 또는 전혀 관찰 가능한 색상 변화를 제공하고,이 지점 이후 컬러 급상승. 이 작업을 위해, 초기 염 농도를 육안 판정하고, 다음 분석 빈 코카인 시료를 마이크로 플레이트 리더 측정 비교하여 미세 조정.
무료 앱 타머 분석 방법으로, 거짓 긍정적 인 반응이 문제가 있었다. 이전 간행물 (7)에 기술 된 바와 같이 분석 분자의 표면 상호 작용은이 문제에 대한 하나의 소스입니다. 인한 비특이적 AuNP 표면의 상호 작용에 대한 의도하지 않은 색 반응을 방지하기 위해, 결합 대상의 DNA 앱 타머 적용 밀도 (도 3)를 제어 하였다.
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다양한 DNA 범위 밀도 그림 3. 흡착 앱 타머 분석 응답. 코카인에 집계 응답 (빨강, 대상), EME (녹색, 제어), 및 프로 카인 (파란색)와, AuNP 표면 활성 분자는 90, 120, 150, 180 DNA / AuNP 범위 밀도가 표시되었다. 분석 된 모든 샘플을 1 ㎎ / ㎖로 메탄올에 용해시켰다. 오차 막대는 세중의 측정의 표준 편차에 의해 정의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
일반적 AuNP 상호 작용으로 인한 비 표적 피 분석 물 분자의 거짓 양성 반응 속도는 DNA 커버리지 밀도가 증가함에 따라 감소 하였다. 그러나, 분석 감도를 증가 DNA 커버리지의 결과로 감소되었다. 이 연구에서, 60, 90, 120, 150, 180, 300 DNA / AuNP했다 investiga의 DNA 밀도테드. (60) 및 (300)의 밀도는 광범위하게 이전 작품 7에 설명 하였다. (3)이 연구 추가 DNA의 밀도를 나타내는 그림. 프로 카인은 조사 더 높은 표면 활성 비 표적 분석 중 하나였다. 각 DNA 커버리지의 각각에 대한 분석 반응은 기술 된 바와 같이 염 농도를 조정함으로써 최대화 하였다. DNA의 범위가 증가함에 따라 일반적으로, 제어 (EME)와 코카인 응답 사이의 응답 차이는 감소한다. 마찬가지로, 프로 카인의 존재 하에서 분석 반응은 커버리지 증가 배경 수준으로 감소한다. 높은 목표 응답을 유지하면서 180 DNA / AuNP 밀도 제거 표면은, 프로 카인에 대한 거짓 긍정적 인 반응을 관련. 이 평가는 가능한 한 많이 응답 목표를 유지하면서, 표면 관련된 거짓 양성 반응을 감소시키기위한 이러한 색상 분석을 조정하는 방법을 설명한다. 향상된 민감도 DNA 커버리지의 감소를 통해 달성 될 수있다. 그러나, 거짓 포지적인 응답은 애플리케이션에 따라 문제가 될 수있다.
비색 분석은 일반적으로 빠르고 간단한 자주 추정 질적 심지어 정량 시험에 사용됩니다. 비색 결정과 일반적인 문제는 특히 미묘한 경계선 색상 차이, 색상 분별의 주관적인 성격이다. 분석가에 의해 이루어져야 판단 통화는 데이터의 잘못된 해석 될 수 있습니다. 실험실 장비에 대한 측정 분석 결과를 평가와 관련된 불확실성과 우유 부단을 줄일 수 있습니다. 그러나이 연구에서, 의도는 분석에 즉각적인 결과를 제공 필드 준비 분석을 제공하는 것이 었습니다. 이와 같이, 사진 영상 분석 기술은보다 결정적인 색상 결과 (도 4) 단 설립되었다.
그림 4.
코카인의 증가 농도, 분석 색상은 증가 파란색 결과. 검량선의 디지털 사진은 두 서로 다른 스마트 폰을 사용하여 수득 한 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 분석을위한 표준 노트북 컴퓨터에 반입 하였다. 색도 값이 C를 플롯 하였다같은 alibration 곡선은도 4에 도시. 화상 분석은 R이 값으로 표시된 바와 같이 폰 이미지의 두 세트 코카인 농도를 증가시키는 선형 응답을 제공 하였다. 이 방법은 필드에 분석을 돕기 위해 스마트 디바이스 앱으로 전환되었다. 응용 프로그램에 대한 자세한 평가는 이전 발행 (7)에서 수행 하였다. 응용 프로그램은 가장 낮은 코카인 농도의 미묘한 색상 변화 결과와 관련된 불확실성과 우유 부단의 대부분을 제거.
이 유형의 물리적 흡착 DNA 분석의 장기 저장 큰 상세히 연구되지 않았으며,이 연구의 목표 중 하나는 검정 유효 기간을 연장하는 조건을 찾는 것이었다. 4 ℃에서 저장 분석 성분의 처리는 이전에 발행 6에 설명 하였다. 이 작업을 위해 준비된 분석 성분의 동결은 장기간 사용 및 저장에 대한 O 여겨졌다분석 바. 분석 성분을 동결 보관하면, 냉장고 나 냉동고의 필요성을 제거하는 것, 주위 온도에서 샘플을 저장하는 뚜렷한 장점을 갖는다. 동결 건조 프로세스의 기본 단계는 먼저 샘플을 고정한다. AuNP 샘플은 냉동 처리를 생존 확인하기 전에 해동 된 샘플의 것과 냉동실에 분석의 흡수 스펙트럼의 비교를 수행한다. 스캔 정확히 일치해야합니다. 샘플은 냉동 처리를 생존하지 않으면, 해동 된 샘플 스펙트럼은 525 nm의 상기 영역에서 흡광도가 증가 할 것이다. 이 AuNPs가 동결 동안 집계하고 해동 샘플이 손상되어 있음을 나타냅니다. 해동 분석의 가능성은 코카인과 EME (그림 5)에서 테스트되었다.
그림 5. 흡착 앱 타머 분석 응답 유효 기간 연구. Quantifica의 기 EME (녹색, 제어), 코카인 (빨강, 대상) 분석 반응은 냉동 수행 한 후 4 주주기 동안 흡착 된 앱 타머 분석 샘플을 해동. 오차 막대는 세중의 측정의 표준 편차에 의해 정의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
해동 분석 빈 샘플은 이루어지지와 사용 즉시 (더 저장) 된 샘플로 연구 기간 동안 동일한 값으로 남아 있었다. 코카인과 EME 샘플의 반응은 즉시 만들어 사용하는 샘플 (아무 저장)으로 관찰 전형적인 반응과 일치했다. 분석 샘플을 만들어 immediatel를 사용하거나에 시간 (7)의 같은 기간 동안 4 ° C에 저장된 샘플에 비해 냉동 샘플 분석 성능 변화없이 4 주 기간 동안 관찰 하였다와이. 코카인 응답도 4 ° C 샘플 7 관찰되었다 4 주 기간 동안 비교적 일정했다. 주 2 주 1 EME 신호의 감소는 종종뿐만 실온, 4 ° C에서 저장 관찰된다. 현상 우리는 첫 주 분석의 성숙에 기인. 이 방법은 흡착 DNA 비색 분석법 장기 보존 가능한 옵션 증대, 추가 장기 저장 옵션, 즉 동결 건조에 대한 게이트웨이를 제공 하였다.
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Discussion
지난 10 년간, 나노 입자 기반 비색 분석법은 표적의 검출을 위해 개발 된 소형 분자, DNA, 단백질, 세포 2-4을 포함한다. 나노 입자와 DNA-앱 타머를 사용하여 분석은 관심을 얻고있다. 일반적으로 이러한 비색 분석법 AuNPs 9-10에 첨가하여 분석 물 분자와 DNA 앱 타머 - 혼합함으로써 수행된다. 그러나 이러한 분석은 제어 실험실 설정 개념 증명 시연과 제한된 선택 컨트롤과 함께 사용되어왔다. 최근 발전은 필드에이 기술이 7되었습니다 전환합니다. 이 방식에서, AuNP에 흡착 된 DNA 앱 타머-는 분석 분자의 첨가에 앞서 (도 1)를 시험 할 표면. 어느 앱 타머 - 금 나노 입자 기반 비색 분석법의 개발 제조 / 분석 프로세스의 다양한 단계에서의 최적화를 필요로한다. 디스크에 따라서, 그 새로운ipline는 정제 및 분석 방법의 문제를 해결하는 것은 성공하기와 관련된 미묘한 차이를 알고 있어야합니다.
흡착 압 타머 - 금 나노 입자의 분석은 각 앱 타머 / 대상 쌍에 대한주의 최적화를 필요로한다. 그러나, 단계는 여기에서 설명 다음은 이러한 색채 분석의 최적화를 수행하는 일관된 프로토콜을 제공합니다. 타겟과 분석 블랭크 사이의 최대 관찰 또는 측정 가능한 색상 변화를 초래 염 농도의 결정 및 조정은 더욱 중요한 최적화 단계 (도 2 및 3) 중 하나이다. 일부 앱 타머 / 타겟 쌍을 위해, 우리는 적정 곡선의 종점 근처의 높은 염 농도를 사용하는 것은 청색에 적색 편이 18 이어질 것을 관찰 하였다. 이것은 대상 및 염의 첨가시 앱 타머에 의해 AuNPs의 안정화를 나타낸다.
분석의 체육에 영향을 미칠 수있는 다른 요인rformance (완충액 성분 및 농도, DNA-앱 타머 범위의 양, 사용 용매, 온도, 앱 타머 서열 및 구조 타깃 분석 배양 시간 (목표 전에 염 첨가에 분석에 첨가되는 시간) 및 발색 시간을 포함 시간 색 개발하기위한 염 첨가 후, 필요). 10 mM의 HEPES, 1 ㎜의 MgCl 2 pH는 7.4 버퍼는 우리의 작업에 사용되는 대상 / 앱 타머 쌍의 많은 선택의 분석 버퍼이었다. 그러나,이 버퍼는 모든 앱 타머에 적합하지 않을 수 있습니다. 앱타 머는 적절한 폴딩을 얻기 위해, 분석 완충액 성분 맞출 필요하고, 앱 타머 선택 버퍼에서 사용되는 조성물에 가능한 한 가깝게 유지된다. AuNPs와 버퍼를 사용하는 경우, 완충액 성분 및 농도, 특히 이온 성 물질과 함께 고려되어야한다. 이온 성 화합물의 높은 농도는 AuNPs의 조기 통합의 원인이 될 수 있습니다. DNA / AuNP 범위는 그림 3에서 설명 하였다. DNA를 같이90-180 DNA / AuNP로부터 따르면 증가, 표적 피검 응답 감소 분석 감도 저하를 일으키는. 따라서, 트레이드 오프 인해 특정 폴딩 및 AuNP 표면과의 상호 작용의 정도, 각 앱 타머에 의존한다는 것을 필요로한다.
또한, 분석 분자를 분해하는 데 필요한 용매는 AuNPs의 의도하지 않은 집계 될 수 있습니다. 물, 검정 완충액, 메탄올 모든 문제없이 사용되었다. 희석, 아세토 니트릴 및 디메틸없이 사용 (DMSO)는 의도하지 않은 응집을 일으키는 AuNP 표면에 흡착. 아세토 니트릴도 1 % 이하 (최종 부피)의 희석에 문제가 있었다. 용제는 비색 분석에 사용하기 전에 AuNPs으로 테스트해야합니다. 상기 분석이 수행되는 온도는 응답 분석으로 관찰되는지 여부에 영향을 미칠 수있다. 이것보다, 소정의 온도에서 앱 타머의 구조와 융점 또는 앱 타머 구조의 안정성과 더 갖는다나노 입자와. 우리의 연구에서, 우리는 접힌 형태로 DNA와 미리 형성된 구조의 앱 타머를 갖는 사이의 정교한 균형이있는 것으로 판정하고, 또한 완전하지 않은 단일 가닥 구조이다. 이것은 다음 비색 분석법 흡착 앱 타머 분석 형태 (도 1)의 경우이다. 구조를 고려할 때, 앱 타머의 구조의 대부분은 각각의 올리고 뉴클레오티드 서열의 결과이기 때문에, 압 타머 서열도 고려되어야한다. 그러나,이 형태로 더 많은 연구가 필요하다.
일반적으로, 우리는 앱 타머 AuNP - 기반 비색 분석법 개발에 사용하는 방법은 모든 앱 타머 / 타겟 쌍에 대해 동일하다. 첫째, 관심의 대상에 대한 앱 타머를 얻을 수 있습니다. 이 문헌 또는 관심 분자 앱 타머의 선택을 통해 검색을 달성 할 수있다. 이 단계에서, 앱타 비색 작성을위한 좋은 후보인지를 알 수 없다시험. 이것은 실험을 통해 결정될 수있다. 다음으로, 압 타머은 앱 타머 흡착 분석 (도 1)를 제조하는 AuNPs 밤새 배양한다. 표준 접근 방식은 60 앱 타머 / AuNP로 테스트를 시작하는 것입니다; 그러나, 다수의 커버리지는 테스트의 다음 단계를 위해 준비된다. 분석법은 테스트를위한 준비가되면, 설명 (그림 2)와 적정 곡선 조사를 수행합니다. 적정 곡선의 중간 점은 신뢰할 시작하는 대상에 사용되는 염 농도 분석 빈, 및 제어 검사로서 기능한다. 염 농도가 분석 대상 및 빈 샘플 간의 최대 색차를 제공하도록 미세 조정된다. 응답이 실제와 결합 앱 타머 - 목표에 의한 비 특정 대상 / 용매의 상호 작용에 기인하지 테스트하려면, 컨트롤 분석을 수행합니다. 동시에 분석 발색 시간은 5 분 간격으로 조사되어있다. 5 분 INTE에서 목표 분석 배양 시간 뒤에이 단계가 최적화 될 때까지 rvals, 처음 15+ 분 배양 시간이 사용됩니다. 결과에 따라, 염 농도, 앱 타머에 따르면, 배양 시간 및 발색 시간의 추가 최적화가 필요 (도 3) 일 수있다. 이 방법은 타겟 / 앱 타머 쌍에 대한 설계 및 앱 타머-AuNP 비색 분석법의 개발에 대한 프로토콜을 설명한다. 흡착 된 앱 타머 비색 분석의 개선에 앱 타머 서열 및 구조 효과에 대한 추가 연구가 큰 관심이다. 앱타 머는, 대상 및 AuNPs과 관련된 상호 작용을 이해하는데 필요하다. 이 지식은 더 나은 기능을 앱 타머를 재봉 및도 압 타머가 흡착 된 앱 타머 분석 형식으로 활성화되는 예측 발생할 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
References
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