Design og Udvikling af aptamer-Gold Nanopartikel kolorimetrisk Analyser for In-the-field Applications

Summary

Designet og udviklingen af ​​en aptamer-guld nanopartikel kolorimetrisk assay til påvisning af små molekyler for in-the-field ansøgninger blev undersøgt. Endvidere blev en smart-enhed kolorimetrisk applikation (app) valideret og langtidsopbevaring af assayet blev etableret til anvendelse i marken.

Abstract

Design og udvikling af en aptamer-guld nanopartikler (AUNP) kolorimetrisk analyse til påvisning af små molekyler for in-the-field applikationer blev undersøgt. Target selektiv AUNP baseret farve assays er blevet udviklet i kontrollerede proof-of-concept laboratoriet indstillinger. Men disse ordninger ikke er blevet udøvet, til et punkt for fiasko til at bestemme deres praktiske anvendelse ud over laboratoriet indstillinger. Dette arbejde beskriver en generisk tilgang til design, udvikling og fejlfinding en aptamer-AUNP kolorimetrisk analyse for små molekyler analytter og bruge analysen for in-the-field-indstillinger. Analysen er fordelagtig, fordi adsorberede aptamerer passivere nanopartikler overflader og giver et middel til at reducere og eliminere falsk positive reaktioner på uden for målgruppen analytter. Overgang dette system til praktiske anvendelser kræves definerer ikke kun holdbarheden af ​​aptamer-AUNP assay, men oprettelse metoder og procedurer for at udvide langtidsopbevaring capabilteter. Også en af ​​de anerkendte bekymringer med kolorimetrisk udlæsning er byrden placeret på analytikere til at præcist at identificere ofte subtile ændringer i farve. For at mindske den ansvar analytikere på området, blev en farve analyse protokol designet til at udføre de identifikationsnumre farve opgaver uden behov for at udføre denne opgave på laboratoriekvalitet udstyr. Fremgangsmåden til at skabe og afprøve dataanalysen protokol er beskrevet. Men for at forstå og påvirke udformningen af ​​adsorberede aptamer analyser, samspillet associeret med aptamer, mål, og AuNPs kræver yderligere undersøgelse. Den opnåede viden kan føre til skræddersy aptamerer for forbedret funktionalitet.

Introduction

Kolorimetri er en af ​​de ældste teknikker, der anvendes i analytisk kemi. Til denne teknik, er en kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af analysanden gjort baseret på produktion af en farvet forbindelse ^en. Typisk farve analyser anvender reagenser, der oplever en farveskift i nærværelse af analyt arter, hvilket resulterer i en observerbar eller detekterbar farveændring i det synlige lysspektrum. Kolorimetri er blevet anvendt i påvisningen af mål spænder fra atomer, ioner og små molekyler til komplekse biologiske molekyler, såsom deoxyribonukleinsyrer (DNA), peptider og proteiner ^2-4. I de sidste to årtier har nanomaterialer revolutioneret området påvisningsassays, især med farve baserede assays ^5-6. Ved at kombinere de unikke kemiske og fysiske egenskaber af nanomaterialer med et mål selektiv anerkendelse element, såsom antistoffer, oligonukleotid aptamerer eller peptidaptamerer, har ført til genopblussen in design og udvikling af kolorimetriske detektionsassays ^7.

Metalnanopartikler har en påvist størrelse-afhængig farveændring ejendom, som er blevet udnyttet i designet af mange kolorimetriske assays. Guld nanopartikler (AuNPs) er af særlig interesse på grund af en karakteristisk rød-til-blå farveskift, når den dispergerede opløsning af partikler induceres til at aggregere ^8, typisk gennem den præcise tilsætning af salt. Evnen til at styre overgangen fra den spredte (rød) til de aggregerede (blå) stater har ført til oprettelsen af kolorimetriske sensorer til ioniske, små molekylære, peptid, protein og cellulære mål ^2-4,9. Mange af disse sensorer anvender aptamerer som mål genkendelsesmotiv.

Aptamerer er DNA eller ribonukleinsyre (RNA) -molekyler valgt blandt en tilfældig pulje på 10 ¹² -10 ¹⁵ forskellige sekvenser ^10-11. Udvælgelsesprocessen identificerer mål rekognition elementer med bindingsaffiniteter i det lave nanomolære styre og systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX) er den mest almindeligt kendte fremgangsmåde ^12-13. Fordele ved oligonucleotid baserede aptamerer til sensing applikationer omfatter nem syntese, kontrollerbar kemisk modifikation, og kemisk stabilitet ^14-15.

En metode til at skabe en kolorimetrisk assay kombinerer nanomaterialer med elementer anerkendelse, består af at kombinere disse to arter gennem den fysiske adsorption af DNA-aptamer molekyler til AUNP overflader. Gennem target-aptamer binding, aptameren oplever en strukturel ændring ^16-18, der ændrer interaktionen af aptameren med AUNP overflade, hvilket fører til en inducerbar rød-til-blå farve respons ¹⁹ med tilføjelse af salt. Denne overraskende træk ved AuNPs giver en observerbar kolorimetrisk reaktion mekanisme til aptamer-baserede enheder, der kan bruges til at delog kolorimetriske assays for forskellige analytter.

Color analyser udformet ved hjælp af ikke-kovalente, fysisk adsorberede DNA aptamerer på AUNP overflader har den stigmatisering af at være en svag sensor platform på grund af problemer med robusthed, en tilbøjelighed til fiasko uden for kontrollerede laboratorieforhold indstillinger, og de manglende oplysninger til rådighed til brug i det praktiske indstillinger. Men aptamer-AUNP baseret kolorimetrisk analyse var, af interesse på grund af enkelheden i drift og observerbar farve respons. Målet med dette arbejde er at give en protokol for design, udvikling, drift, reduktion af overfladen relateret falsk positivt svar, og langtidsopbevaring af DNA-AUNP baserede kolorimetriske assays bruger kokain som repræsentant analyt. Desuden foreslog vi denne adsorberet aptamer assay tilgang (figur 1) som værende en fordel på grund af enkelhed og brugervenlighed, der resulterede i færre trin end den konventionelle tilgang til disse aptamer-AUNP røvays. Til dette assay blev aptameren først tilsat til AuNPs, der fik lov til at adsorbere til overfladen i en længere periode. En yderligere fordel ved denne fremgangsmåde var reduktionen af ​​respons på ikke-target analytmolekyler relateret til AUNP overfladeinteraktioner. Men reduktionen i falsk positiv reaktion var på bekostning af analysesensitivitet. Derfor en balance mellem beskyttelse overflade og analyt tilgængelighed er nødvendig for at opretholde en ordentlig analyse funktion. Desuden er en stor mangel, at analysere farve analyser på anden måde end med instrumentering er, at resultaterne ofte er subjektive og åbne for fortolkning fra analytiker-til-analytiker, især når de forsøger at skelne subtile forskelle i farve. Omvendt er der en række problemer med at gøre laboratorium baseret instrumentering anvendelig uden for laboratoriet, såsom tilgængelighed af el, funktionalitet med portabilitet, etc. I dette arbejde blev en farve analyse protokol udviklet til more portabilitet og at eliminere nogle af de gætterier ofte forbundet med farve baseret assay fortolkning ^20-21. I forhold til tidligere metoder, denne indsats bestræbt sig på at skubbe disse analyser til deres grænser for applikationer uden laboratoriet indstillinger.

Protocol

1. Syntese via citrat Reduktion af guld nanopartikler (AUNP) og karakterisering

1. Rengør en Erlenmeyerkolbe (500 ml) og store omrører med 5 ml koncentreret salpetersyre og 15 ml koncentreret saltsyre i kemisk sikkerhed hætte.
   1. Væde hele kolbens overflade med syren vask, skyl kolben med nukleasefrit vand, og kolben tørre.
2. Der tilsættes 100 ml 1 mM guld (III) chlorid; Brugen af ​​en aluminiumfolie for at dække toppen af ​​syren renses Erlenmeyer-kolbe og varme under kontinuerlig omrøring på en varm plade indtil kogning.
3. Der tilsættes 10 ml 38,8 mM natriumcitrat. Farven skifter fra klar / grå, til mørkeblå / sort, og endelig mørkerød over flere minutter. Fortsæt omrøring med varmen fra for 10 min.
4. Tillad AUNP suspensionen afkøle til stuetemperatur, og der tilsættes 110 pi diethylpyrocarbonat (DEPC) under kontinuerlig omrøring.
5. Dæk hele kolben medaluminiumsfolie og lade DEPC behandling inkubere natten over. Opbevar alle AuNPs i mørke, i ravfarvede opbevaringsbeholdere eller dækket med alufolie.
6. Autoklaver AUNP suspension, afkøles til stuetemperatur, og filtreres gennem et 0,22 um pore celluloseacetat membran. den filtrerede, autoklaveret AUNP stamopløsning i mørke ved 4 ° C opbevares.
   BEMÆRK: Behandling med DEPC, sterilisation via autoklave, og opbevaring ved 4 ° C vil forbedre holdbarheden af ​​aptamer-AUNP analysen. Opbevaring på denne måde vil give mulighed for assayet til at forblive funktionelle i mere end 2 måneder.
7. Beregn AUNP koncentrationen ved at indhente Ultra Violet-Visible absorption ved 520 nm, og bruge ekstinktionskoefficienten (Ɛ) 2,4 x 10 ⁸ L mol ^{-1 cm-1} med Beers lov ved at beregne koncentrationen (c). Koncentrationen blev bestemt til at være 10 nM med en størrelse på 15 nm bestemt ved dynamisk lysspredning.
   BEMÆRK: Koncentrationer vil variere from batch-til-batch. Fortynde AUNP lagre med nuklease frit vand efter behov for at opretholde det ønskede 10 nM AUNP suspension.

2. DNA-aptamer, Buffer, Solution, og Assay Forberedelse

1. Køb eller syntetisere følgende kokain bindende aptamer sekvenser ved hjælp af standard phosphoramiditkemi ^22:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT FTT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT FTT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Oprens aptamererne under anvendelse standard afsaltning ^23. Rekonstituer oligonukleotider i nuklease-frit vand ved enten 100 pM eller 1 mM stamopløsninger. Alikvot og opbevares ved -20 ° C i flere måneder.
3. Køb eller forberede bestande af sterilt 1 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) pH 7,4, 100 mM magnesiumchlorid _(MgCl2), og 1 M natriumchlorid (NaCl).
4. Forbered 50 ml buffer i nuklease-frit vand with koncentrationer på 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 og opbevares ved stuetemperatur for måned.
5. Inkuber DNA'et med bestanden AUNP opløsning (10 nM) i 3-4 timer ved stuetemperatur og beskyttes mod lys. Varier mængden af ​​AuNPs som ønsket at give nok prøve til de test, der skal udføres (blive 2,5-7,5 ml).
   1. Her, brug lastetæthed på 90, 120, 150, og 180 DNA-molekyler / AUNP i dette arbejde. Varier mængden og koncentrationen af ​​DNA i overensstemmelse hermed. Tune DNA dækning for at reducere utilsigtede AUNP overflade relateret farve svarene fra uden for målgruppen analytter.
      BEMÆRK: Forøgelse af DNA-dækningen vil reducere analysen følsomhed. De lastetætheden er beregnet ud fra at kende koncentrationen af ​​AUNP bestand, og beregningen af ​​det samlede antal AuNPs til stede i den ønskede til brug i forsøg volumen. Hvis der ønskes den faktiske dækning tætheder findes protokoller for at opnå disse værdier ^7. DNA dækning blev bestemt ved anvendelse af en 50 kDa molecular vægtudelukkelsesgrænse spinkolonne at separere AUNP bundet DNA fra frit DNA. De AuNPs er for store til at passere gennem spinkolonne medens frit DNA passerer gennem let. Det næste trin er at kvantificere frit DNA indsamlet ved hjælp absorbansmålinger eller et enkeltstrenget DNA fluorescerende farvestof.
6. Tilsættes samme mængde af 20 mM HEPES, 2 mM _MgCl2, pH 7,4 puffer og placere prøven ved 4 ° C i mørke natten over. Den aptamer-AUNP assay var i en 10 mM HEPES, 1 mM _MgCl2, pH 7,4 (assaybuffer).

3. Salt Titrering og Assay Setup

1. Bestem den initiale saltkoncentration nødvendig for at fremkalde analysen farve svar fra salt titrering med analysen tom. Tilsæt 20 pi methanol (blank) til 180 pi alikvoter af aptamer-AUNP assay i en 96-brønds plade. Prøverne titreres med stigende mængder af lager NaCl opløsning (1 M eller 2 M) og bestemme ækvivalenspunktet (figur 2 BEMÆRK: Analysen kan skaleres til mindre mængder ved at holde forholdet mellem methanol blank (eller opløst analyt) til aptamer-AUNP assay det samme.
   1. Her, fastlægge NaCl volumen nødvendig for at fremkalde den mindste farveændring ved visuel observation. Udgangspunktet koncentration for analysen var 75 mM og 130 mM for MN4 og MN6, henholdsvis en 60 DNA-molekyle / AUNP dækning tæthed.
      BEMÆRK: For en kvantitativ bestemmelse for den initiale saltkoncentration midtpunktet af titreringskurven tjener som et godt udgangspunkt. Desuden vil anvendte koncentrationer variere baseret på aptamer, DNA dækning tætheder, fra dag til dag ydeevne, og batch-til-batch.
2. Optimering analysesvaret, tilsættes 20 pi analytmolekyler fortyndet i methanol til 180 pi alikvoter af aptamer-AUNP assay i en 96-brønds plade ved stuetemperatur. Tilføj straks NaCl-koncentrationen bestemt i det foregående trin for at initiere assayet farvereaktion.
   INGENTE: Udnyt en multikanal pipette til at udføre flere eksperimenter samtidig.
3. Opnå den største farveændring muligt ved at øge eller mindske NaCl-koncentrationen og sammenligning af målet reaktion på den tomme respons. Brug NaCI-koncentrationen, der giver den største respons forskel.
4. Overhold eller måle analysen svar 150 sek efter NaCl tilføjelse. Analyser absorbansen ved 650 nm og 530 nm ved hjælp af et spektrometer eller få et digitalt kamera foto af analysen respons (se afsnit 4 for foto analyse protokol).
   BEMÆRK: En mikropladelæser blev anvendt til at opnå målingerne for dette arbejde.
5. Plot resultaterne som forholdet mellem absorbans opnået ved 650 nm og 530 nm (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ som en funktion af analytkoncentrationen. Normalisere analysesvaret til den tomme signal som det blev gjort i dette arbejde.

4. Foto og Digital Image Color Analysis Protocol Analysis

1. prepare analysens prøver som beskrevet (afsnit 3.2-3.3). Placer 96-brønds plade på en transilluminator.
   BEMÆRK: En standard laboratorium transilluminator er typisk for lyst til at opnå brugbare digitale billeder til denne analyse. Disse transilluminators forårsage regelmæssige mellemrum "mørke linjer" vises i det digitale billede på grund af intensiteten af ​​lyskilden. Realiseringen af ​​et transilluminator fra en lysemitterende diode (LED) baseret lyskasse og et stykke uigennemsigtigt plast fungerer godt.
2. Opnå billeder af 96-brønds plade ved 150 sek efter NaCl Desuden importere billeder til billedanalyse-software, og beregne de gennemsnitlige røde, grønne og blå (RGB) værdier under anvendelse af en trinvis gennemsnitsberegning teknik, som vist i ligning 1 ^24:
   (1)
3. Konverter RGB-værdierne fra standard RGB (sRGB) farverum til det colorimetriske diagram (CIExyY) farve rum ved hjælp af følgende ligninger ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Konvertere de eksponentielle RGB-værdier til lineære RGB værdier ved hjælp ligning 2. Matrixen er angivet i ligning 3 anvendes til at beregne X, Y og Z-værdier med CIE farverum ^24.
5. Beregn x og y Kromaticitetskoordinaterne værdier ved hjælp ligning 4 repræsenterer den gennemsnitlige farve af pixel i området udvalgt til analyse ^24.
6. Foretage analysen i hvert godt og plot chromaticitetskoordinaterne værdier for at generere en kalibreringskurve (figur 4). Opnå standardfejlen ved at analysere farven på forskellige områder af den samme brønd.

5. Nedfrysning aptamer-AUNP Assay for Langsigtet opbevaring

1. Forbered aptameren-AUNP assay komponenter, som beskrevet i afsnit 2.4 og 2.5. Foretage separate opløsninger indeholdende 1 g / ml trehalose og 1 g / ml saccharose i nuklease-frit vand til at gøre kryogenet Solution.
   BEMÆRK: Høje koncentrationer af trehalose og sucrose blev anvendt til at reducere fortyndingsfaktoren ved klargøring af assayet til frysning. Varm sukkeropløsninger på en varm plade i et bægerglas med vand til grundigt opløse sukkerarter inden brug.
2. Fremstilling af en opløsning, der indeholder 19,2 mg / ml trehalose og 4,8 mg / ml saccharose med 60 MN4-DNA / AUNP assay ved et endeligt volumen på 200 pi i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Endelige kryogene opløsningskoncentrationer vil variere med DNA dækning.
   BEMÆRK: Prøver skal fryses bør ikke overstige 300 pi. Større mængder kan ikke fryse ordentligt.
3. Flash fryse prøverne ved anvendelse af en -146 ° C fryser eller i flydende nitrogen. Opbevar prøverne nedfrosset indtil brug. Opbevaring kan være i en -80 ° C eller -20 ° C en gang blinke frysning er færdig.
4. For dette arbejde, lade prøverne i -146 ° C fryser i løbet afnat og derefter overføre til en -20 ° C fryser for langtidsopbevaring.
   BEMÆRK: Flash frysning kan forårsage aptamer-AuNPs til at aggregere. Teste integriteten af ​​fryseprocessen ved at overvåge absorbansen profil og sammenligne den med en ikke-frossen prøve. Hvis der observeres aggregering, øge mængden af ​​kryogen opløsning for at kompensere for dette problem.
5. Optø prøverne ved stuetemperatur og bruger kun nok prøver som nødvendigt til eksperimenter. Få absorbans spektre af optøede prøver og sammenlign baseline spektre af en ikke-frossen kryogene løsning behandlet prøve. Mål absorbansen fra 400 nm til 700 nm.
6. Udfør salt titrering (afsnit 3.1), teste assay (afsnit 3.2), og plot resultaterne (afsnit 3.3 og 3.4) som tidligere beskrevet.

Representative Results

Det primære formål med dette arbejde var at udvikle og undersøge stabilitet og robusthed aptamer baserede AUNP kolorimetriske analyser til brug i marken. Som fremhævet i en tidligere publikation, blev to forskellige strategier for at skabe analysen undersøgt ^7. Analyserne blev betegnet Free aptameren Assay og det adsorberede aptameren Assay. Det adsorberede aptamer Assay var mere tiltalende med henblik på en fieldable påvisningsassay (figur 1).

. Figur 1. Skematisk repræsentation af de adsorberede aptamer assay aptamer blev blandet med AuNPs og inkuberet natten over; analytmolekyler opløst i methanol blev tilsat til Absorberet aptamer Assay, umiddelbart efterfulgt af tilsætning af natriumchlorid (NaCl) for at inducere AUNP aggregering ved målet blev tilsat.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Dette skyldtes reduktionen i falsk positive satser på non-mål analytter, relative enkelhed og brugervenlighed af de adsorberede aptameren analysen. Til fremstilling af adsorberet aptamer Assay blev DNA-aptamer blandet med AuNPs og inkuberet natten over i assaypuffer. Dette gav aptamer til let adsorberes på AUNP overflade, hvilket har reduceret modtagelighed analysen for falske positive reaktioner på non-mål analytmolekyler såsom maskering eller skære agenter. Det er imidlertid kun den præformede struktur MN4 kokain aptamer var aktiv i nærvær af kokain (mål) i dette assay design. Assayet blev anvendt ved tilsætning af analyt løsninger efterfulgt af umiddelbar tilsætning af den passende koncentration af NaCl. Saltopløsninger blev anvendt til at initiere den observerbare og measurable farveændring af assayet. Analysen blev udført inden for 2-3 min. efter tilsætningen af ​​analytopløsningen.

En kritisk handling i udførelsen af ​​disse fysisk adsorberede DNA baserede kolorimetriske assays er den inducerede farve reaktion, ved tilsætning af den passende koncentration af salt. Tilsætningen af ​​salte er kendt at destabilisere AUNP suspensioner resulterer i aggregering af partiklerne ved at maskere de negative ladninger af citrat lag, der stabiliserer AuNPs, og derefter mindsker interpartikelkræfter elektrostatiske interaktioner. Resultatet er den observerbare rød-til-blå farveændring. Den samme effekt er observeret med DNA behandlet AuNPs. I tilfælde af DNA-aptamerer, analytiker bestemme koncentrationen af ​​salt er nødvendigt for at forårsage minimal observerbar AUNP destabilisering (blåfarvning). Med tilføjelsen af ​​målet, er stabiliseringen af ​​de AuNPs ved DNA-aptamer betydeligt reduceret hvilket resulterer i en observable, målbare mål dosis respons farveskift. Denne farveændring kan kun opfattes med tilsætning af den passende forudbestemte mængde salt.

Lige så betydningsfuldt er den proces, hvor den passende koncentration af salt blev bestemt. Dette blev opnået ved at udføre en titreringskurve ved at tilsætte stigende koncentrationer af natriumchloridopløsning til en række assay emner (figur 2).

Figur 2. Salt-induceret titreringskurve. Citrat-stabiliseret (rød), MN4 kokain bindende aptamer (grøn), og MN6- kokain bindende aptamer (lilla) behandlede AUNP prøver blev titreret med natriumchlorid (NaCl). De indledende saltkoncentrationer opnået visuelt blev angivet med tilsvarende farvede pile for hver kurve. Fejlsøjler defineres ved standardafvigelsen itredobbelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Her blev den initiale saltkoncentration anvendt bestemt ved visuel inspektion, og blev anset for at være saltkoncentration, der forårsagede den mindste blåfarvning iagttages med assayet tomt. Men for en mere kvantitativ tilgang, forskerne nye til dette forskningsområde kan bruge midtpunktet af titreringen ækvivalens punkt som en start saltkoncentration. Ud over dette punkt farven reaktion begynder at stige hurtigt. Endvidere blev saltkoncentration anvendt i udførelsen af ​​assayet justeres til at maksimere farveforskellen mellem analysens datoer og kokain responser. Dette blev opnået ved stigende og faldende saltkoncentration fra det beløb bestemt ved titrering. Proceduren Saltet titrering blev udført dagligt tiludgør dag-til-dag-variation med assayet. Portionen variabilitet i saltkoncentration nødvendig til assayet var ikke mere end 20%. Figur 2 har tre forskellige AUNP prøver, citrat-stabiliseret (ingen DNA), MN4 (DNA-aptamer stabiliseret), og MN6 (DNA-aptamer stabiliserede). DNA-dækning for de MN4 og MN6 prøver var 60 DNA-molekyler / AUNP, og hver titreringskurven har en anden titrering ækvivalenspunktet og midtpunktet baseret på niveauet af stabilitet, som overfladebehandlingen. Citrat forudsat lidt stabilitet, MN4 (dobbeltstrenget lignende struktur), forudsat mere stabilitet og MN6 (enkeltstrenget lignende struktur), forudsat de mest stabilitet til AuNPs. De indledende saltkoncentrationer anvendt i dette arbejde var bestemt til at være ~ 50 mM, ~ 90 mM, og ~ 130 mM visuelt. Tendensen er enig med konventionel forståelse af DNA struktur og dens stabiliserende virkning på AuNPs ^24-25. Når du udfører denne test visuelt, viste analysen blank en lille blå Colora tion med saltkoncentrationer som identificeret i figur 2 med pile, der ligger tæt på de midtpunkter som diskuteret. De saltkoncentrationer før disputatser punkter giver lidt eller ingen observerbar farveændring, og ud over disse punkter farven stiger hurtigt. For dette arbejde, blev den oprindelige koncentration salt bestemt visuelt og derefter finjusteret ved hjælp mikropladelæser måling sammenligninger af assay tomme og kokain prøver.

Med Free aptameren Assay tilgang, falske positive svar var et problem. Surface interaktioner af analytmolekyler er en kilde til dette problem, som beskrevet i en tidligere publikation ^7. At forhindre utilsigtede farve reaktioner på grund af ikke-specifikke AUNP overfladeinteraktioner blev DNA dækning tætheder af målbindingsmedlemmet aptamer kontrolleret (figur 3).

jpg "/>
Figur 3. Adsorberet aptamer assay respons med varierende DNA dækning densitet. Aggregering respons på kokain (rød, mål), EME (grøn, kontrol) og procain (blå), en AUNP overfladeaktivt molekyle, for 90, 120, 150, og 180 DNA / AUNP dækning densiteter blev vist. Alle de analyserede prøver blev opløst i methanol ved 1 mg / ml. Fejllinjer er defineret af standardafvigelsen i tredobbelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Generelt blev det falske positive svarprocent på non-mål analytmolekyler grundet AUNP interaktioner reduceret med stigende DNA dækning tætheder. Imidlertid blev assayfølsomhed reduceret som følge af øget DNA dækning. I dette arbejde, DNA densiteter på 60, ​​90, 120, 150, 180, og 300 DNA / AUNP var UNDERSØGELSEted. Tætheder af 60 og 300 blev udførligt beskrevet i tidligere arbejde ^7. Figur 3 repræsenterer yderligere DNA tætheder undersøgt. Procain var en af ​​de mere højt overfladeaktive non-mål analytter adspurgte. For hver af de enkelte DNA dækningsområder blev assayet respons maksimeres ved at justere saltkoncentrationen som beskrevet. Generelt som DNA dækning forøges, svaret forskellen mellem kontrol (EME) og kokain respons reduceres. Tilsvarende analysesvaret i nærvær af procain falder til baggrundsniveauer med stigende dækninger. De 180 DNA / AUNP tæthed elimineret overflade relateret falsk positiv respons for procain, og samtidig bevare en høj målsætning respons. Denne vurdering beskrives en fremgangsmåde til tuning Disse farve assays for at reducere overflade- relateret falsk positive reaktioner, samtidig bevare target respons så meget som muligt. Forbedrede følsomheder kan opnås gennem reduktion af DNA-dækning. Imidlertid falsk positive reaktioner kan blive et problem afhængigt af programmet.

Kolorimetriske assays er almindeligt anvendt til hurtige, enkle ofte formodede kvalitative og endda kvantitative test. Almindelige problemer med kolorimetriske bestemmelser er subjektive karakter af farven dømmekraft, især med subtile og borderline farveforskelle. De dom opkald, der skal foretages af analytikeren kan resultere i misfortolkning af data. Målinger på laboratorieudstyr reducere usikkerheden og ubeslutsomhed forbundet med vurdering af analyseresultater. Men i dette arbejde, hensigten var at give et felt klar analyse, som leveres umiddelbare resultater for laboranten. Som sådan blev et foto billedanalyse teknik fastslået, at forudsat en mere afgørende farve resultat (figur 4).

Figur 4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Med stigende koncentrationer af kokain, analysen farve resulterede i en stigende blå farve. Digitale billeder af kalibreringskurver blev opnået ved hjælp af to forskellige smartphones, og importeret til en standard bærbar computer til analyse ved hjælp ImageJ software. Kromaticiteten værdier blev anvendt til at plotte calibration kurver som vist i figur 4. Billedanalyse billede et lineært respons på stigende koncentration kokain med begge sæt smartphone billeder som angivet ved R ² værdier. Denne metode blev skiftet til en smart-enhed app til at hjælpe analytikeren i marken. En detaljeret evaluering af den app blev udført i en tidligere publikation ^7. Den app fjernet meget af den usikkerhed og ubeslutsomhed forbundet med subtile farveskift resultater af de laveste koncentrationer kokain.

Langsigtet opbevaring af fysisk adsorberede DNA-analyser af denne type er ikke blevet undersøgt i stor detalje og et af målene for dette arbejde var at finde betingelser for at udvide analysen holdbarhed. Behandling af analysens komponenter til opbevaring ved 4 ° C blev beskrevet i en tidligere publikation ^6. For dette arbejde blev lyofilisering af de fremstillede assaykomponenterne betragtning til langtidsbrug og opbevaring of assayet. Lyofilisering assaykomponenterne har den klare fordel af at holde og opbevare prøverne ved omgivelsernes temperatur, hvilket ville eliminere behovet for et køleskab eller fryser. Den primære trin i lyofilisering processen er først at fryse prøven. For at kontrollere de AUNP prøverne overleve fryseprocessen, udføre en sammenligning af absorbansen spektre af assayet inden frysning med den for den optøede prøve. Scanningerne skal matche nøjagtigt. Hvis prøverne ikke overlever fryseprocessen, vil den optøede prøve spektrum har øget absorbans i området over 525 nm. Dette indikerer, at de AuNPs aggregeres under frysning og den optøede prøve er kompromitteret. Levedygtigheden af den optøede assayet blev testet med kokain og EME (figur 5).

Figur 5. Absorberet aptamer Assay respons holdbarhed undersøgelse. Quantificaning af analysen respons på EME (grøn, kontrol), og kokain (rød, mål) udføres med frosne og derefter optøet Adsorberede aptamer Assay prøver i løbet af en periode på fire uger. Fejllinjer er defineret af standardafvigelsen i tredobbelte målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.

De optøede assay blindprøver forblev på samme værdi i løbet af undersøgelsen periode som prøver, der blev foretaget og anvendes straks (ingen opbevaring). Svarene fra de kokain og EME prøver var i overensstemmelse med typiske reaktioner observeret med prøver fremstillet og anvendes straks (ingen opbevaring). De frosne prøver blev overvåget i en periode på 4 uger uden ændring til assayet ydeevne sammenlignet med prøver opbevaret ved 4 ° C i løbet af den samme periode eller ^{7 for} at assay-prøver fremstillet og brugte immediately. Kokain svar var relativt konstant i perioden 4 uger, som også blev observeret for de 4 ° C prøverne ^7. Faldet i EME signal fra uge 1 til uge 2 er ofte observeret med stuetemperatur og 4 ° C opbevaring samt. Et fænomen vi tilskrives modning af assayet i den første uge. Denne tilgang augmented de tilgængelige muligheder for langtidsopbevaring af de adsorberede DNA kolorimetriske assays, og forudsat en gateway til yderligere langsigtede lagringsmuligheder, nemlig frysetørring.

Discussion

I det seneste årti har nanopartikler baseret kolorimetriske assays blevet udviklet til påvisning af mål indbefatter små molekyler, DNA, proteiner og celler ^2-4. Analyser, der bruger DNA-aptamere med nanopartikler har vundet interesse. Typisk er disse kolorimetriske assays udføres ved at blande DNA-aptamer med analytmolekyler efterfulgt af tilsætning til AuNPs ^9-10. Disse analyser er blevet brugt i proof-of-concept demonstrationer med kontrollerede laboratoriet indstillinger og med begrænsede, udvalgte kontroller,. Nylige fremskridt at overføre denne teknologi i marken er foretaget ^7. I denne fremgangsmåde, DNA-aptamer blev adsorberet til AUNP overflader før tilsætning af analysandmolekylerne, der skal testes (figur 1). Udviklingen af ​​enten aptamer-guld nanopartikel baserede kolorimetriske assays kræver optimering på forskellige stadier i fremstillingen / analyseprocessen. Således de nye til diskenipline skal være opmærksom på nuancerne i forbindelse med raffinering og fejlfinding disse assays at være vellykket.

De adsorberede aptamer-guld nanopartikel analyser kræver omhyggelig optimering for hver aptamer / målpar. Men følge trinene forklaret her tilbyder, en konsekvent protokol til at udføre optimering af disse kolorimetriske assays. Bestemmelsen og justering af saltet koncentration, der medfører den maksimale observerbare eller målelig farveændring mellem målet og assay blank er en af de mere kritiske optimering trin (figur 2 og 3). For nogle aptamer / mål-par, har vi observeret, at anvendelse af høje saltkoncentrationer nær endepunktet af titreringskurven have resulteret i en blå-til-rød farve skift ^18. Dette tyder på en stabilisering af de AuNPs af aptamer ved tilsætningen af ​​målet og salt.

Andre faktorer, der kan påvirke analysens performance omfatter pufferkomponenter og koncentrationer, mængden af ​​DNA-aptamer dækning, anvendte opløsningsmidler, temperatur, aptamer sekvens og struktur, target-assay inkubationstiden (tid, hvor målet tilsættes til assayet, før salt tilsætning), og farveudvikling tid ( nødvendige tid for farven udvikles, efter salt tilsætning). En 10 mM HEPES, 1 mM _MgCl2, pH 7,4 puffer var assaybufferen valg i mange af de target / aptamer-parrene, der anvendes i vores arbejde. Dog kan denne buffer ikke være ideel for alle aptamerer. At opnå korrekt foldning af aptameren kan assaybuffer komponenter skal tilpasses og holdes så tæt som muligt på præparatet anvendes i aptamer udvælgelse buffer. Når der anvendes en puffer med AuNPs skal bufferkomponenterne og koncentrationer overvejes, specielt med ioniske substanser. Høje koncentrationer af ioniske forbindelser kunne forårsage for tidlig aggregering af AuNPs. DNA / AUNP dækning blev demonstreret i figur 3. Som DNAdækning stiger fra 90-180 DNA / AUNP, målanalytten respons faldt forårsager reduceret assay følsomhed. Derfor er der behov en afvejning, der afhænger af hver aptamer, på grund af sin særlige foldning og graden af ​​interaktioner med AUNP overflade.

Derudover kan opløsningsmidler er nødvendige for at opløse analytmolekyler resultere i utilsigtet aggregering af AuNPs. Vand, assaybuffer, og methanol er blevet benyttet uden problem. Anvendes uden fortynding, acetonitril og dimethylsulfoxid (DMSO) adsorbere til AUNP overflade forårsager utilsigtet sammenlægning. Acetonitril var problematisk selv ved fortyndinger på under 1% (slutvolumen). Opløsningsmidler bør testes med AuNPs før brug med kolorimetrisk analyse. Den temperatur, ved hvilken assayet udføres, kan have en indvirkning på, om en reaktion observeres med assayet. Dette har mere at gøre med aptamer struktur og smeltetemperaturen, eller stabiliteten af ​​aptamer struktur ved en given temperatur, endmed nanopartiklerne. I vores arbejde har vi fastslået, at der er en hårfin balance mellem at have aptameren i en præformet struktur med DNA'et i en foldet form og heller ikke helt i en enkeltstrenget struktur. Dette er tilfældet for den adsorberede aptamer assay form af disse kolorimetriske assays (figur 1). Når man overvejer struktur skal aptamer sekvensen også blive overvejet, fordi meget af aptamer struktur er resultatet af de enkelte oligonukleotidsekvenser. Imidlertid er behov for yderligere undersøgelser af dette aspekt.

I Generelt er fremgangsmåden vi ved udvikling af en aptamer-AUNP baseret kolorimetrisk analyse er den samme for alle aptamer / mål-par. Først få en aptamer for et mål af interesse. Dette kan opnås ved at søge litteraturen eller udvælgelse af en aptamer for et molekyle af interesse. På nuværende tidspunkt er der ingen mulighed for at vide, om aptamer er en god kandidat til at skabe et kolorimetriskassay. Dette kan kun afgøres gennem eksperimenter. Dernæst aptamer inkuberet med AuNPs natten over for at fremstille det adsorberede aptamer assayet (figur 1). Standarden tilgang er at begynde at teste med 60 aptamerer / AUNP; imidlertid flere dækningsområder forberedt til den næste fase af test. Når assays er klar til afprøvning, udføre titreringskurven undersøgelser som beskrevet (figur 2). Midtpunktet af titreringskurven tjener som en pålidelig start saltkoncentration, der skal anvendes for målet, assay blank, og kontrol. saltkoncentrationen er finjusteret til at levere en maksimal farve forskel mellem målet og assay blindprøver. For at teste responsen er reel og skyldes aptamer-target bindende og ikke på grund af ikke-specifikke mål / opløsningsmiddel interaktioner, udføre analysen med kontroller. Samtidig er assay farve udviklingstiden undersøgt ved 5 min intervaller. Efterfulgt af target-assay inkubationstider på 5 min intervals, er i første omgang 15+ min inkubationstider benyttes indtil dette trin er optimeret. Afhængigt af resultaterne, kan yderligere optimering af saltkoncentration, aptamer dækning, inkubationstid og farveudviklingen tid være nødvendig (figur 3). Denne fremgangsmåde beskriver en protokol for design og udvikling af aptamer-AUNP kolorimetriske assays for et mål / aptamer par. Yderligere undersøgelser af aptamer sekvens og strukturelle virkninger på forbedring af adsorberet aptamer kolorimetriske assays er af stor interesse. Der er behov for at forstå de interaktioner forbundet med aptameren, mål og AuNPs. Denne viden kan føre til skræddersy aptamerer for bedre funktionalitet og endda forudsige hvilke aptamerer vil være aktiv i den adsorberede aptamer assay-format.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold(III) chloride hydrate	Sigma	254169	99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate	Sigma	W302600-1KG-K	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy	Bio-TEK	HT	Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized	Amresco	J848	Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate	Fisher	430767	Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer	Varian	Cary 300	Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fluka	63068	≥98% any brand will work
DNA	IDT	Custom	DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride	ACROS	AC20731-1000	99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid	Fisher	A144S-500	36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride	Lipomed	COC-156-HC-1LM	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid	Fisher	A509-SK212	65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade	Sigma	S5150-1L	Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758-25 mL	≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride	Lipomed	COC-205-HC-1LM	We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml	VWR	10011-722	We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol