Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Design og utvikling av Aptamer-gull nanopartikkel-basert kolo Analyser for In-the-feltet Applications

Published: June 23, 2016 doi: 10.3791/54063
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2
1Department of Science and Mathematics, Alvernia University, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3UES, Inc.

Summary

Utforming og utvikling av en aptamer-gull nanopartikkel kolorimetrisk analyse for påvisning av små molekyler for in-the-feltet applikasjoner ble undersøkt. I tillegg ble en smart-anordning kolorimetrisk applikasjon (app) validert og langtidslagring av analysen ble etablert for bruk i felten.

Abstract

Utforming og utvikling av en aptamer-gull nanopartikkel (AuNP) kolorimetrisk analyse for påvisning av små molekyler for in-the-feltet applikasjoner ble undersøkt. Target selektiv AuNP basert farge analyser har blitt utviklet i kontrollerte laboratorie innstillinger proof-of-concept. Imidlertid har disse ordningene ikke blitt utøvd til et punkt av svikt for å fastslå praktisk bruk utover laboratoriet. Dette arbeidet beskriver en generisk tilnærming til design, utvikle og feilsøke et aptamer-AuNP kolo analyse for små molekyl analytter og bruke analysen for in-the-feltet innstillinger. Analysen er fordelaktig fordi adsorberte aptamerer passivere de nanopartikkel overflatene og gir et middel for å redusere og eliminere falske positive responser til ikke-mål analytter. Overgang dette systemet til praktisk bruk nødvendig å definere ikke bare holdbarheten av aptamer-AuNP analysen, men etablering av metoder og prosedyrer for å forlenge langtidslagring capabilities. Også en av de anerkjente bekymringer med kolo avlesning er belastningen på analytikere til å nøyaktig identifisere ofte subtile endringer i farge. For å minske ansvaret på analytikere i feltet, ble en farge analyse protokoll utviklet for å utføre de fargeidentifikasjons oppgaver uten behov for å utføre denne oppgaven på laboratorie karakter utstyr. Fremgangsmåten for å lage og testing av dataanalyse-protokoll er beskrevet. Men for å forstå og påvirke utformingen av adsorberte aptamer analyser, interaksjoner knyttet til aptamer, mål, og AuNPs krever videre studier. Den kunnskapen kan føre til skreddersøm aptamerer for økt funksjonalitet.

Introduction

Kolorimetri er en av de eldste teknikker som brukes i analytisk kjemi. For denne teknikk blir en kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av analytten gjort basert på fremstilling av en farget forbindelse 1. Vanligvis fargeanalyser bruker reagenser som opplever en fargeforskyvning i nærvær av analytten art, noe som resulterer i en observerbar eller påvisbar fargeendring i det synlige lysspekteret. Kolorimetri har vært brukt i deteksjon av mål som strekker seg fra atomer, ioner og små molekyler til komplekse biologiske molekyler slik som deoksyribonukleinsyrer syrer (DNA), peptider og proteiner 2-4. For de siste to tiårene, har nanomaterialer revolusjonert detekteringsområde analyser, spesielt med farge baserte analyser 5-6. Kombinerer de unike kjemiske og fysiske egenskapene til nanomaterialer med et mål selektiv anerkjennelse element, slik som antistoffer, oligonukleotid aptamerer eller peptid aptamerer, har ført til oppblomstring in design og utvikling av kolorimetriske deteksjon analyser 7.

Metall nanopartikler har en størrelse vist avhengig fargeendring egenskap, som har blitt utnyttet i utformingen av mange kolorimetriske assays. Gull nanopartikler (AuNPs) er av spesiell interesse på grunn av en særegen rød-til-blå fargeskift, da den dispergerte oppløsning av partikler blir indusert til å samle 8, typisk gjennom den presise tilsetning av salt. Evnen til å kontrollere overgangen fra spredt (rød) til de aggregerte (blå) landene har ført til opprettelsen av kolorimetriske sensorer for ionisk, små molekylære, peptid, protein og cellulære mål 2-4,9. Mange av disse sensorene anvende aptamerer som målet gjenkjennelse motiv.

Aptamerer er DNA eller ribonukleinsyre (RNA) molekyler valgt fra en tilfeldig pool av 10 12 -10 15 forskjellige sekvenser 10-11. Utvelgelsesprosessen identifiserer målet rekognisjon elementer med bindingsaffiniteter i lav nanomolar regimet, og den systematiske utviklingen av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) er den mest kjente prosess 12-13. Fordeler med oligonukleotid basert aptamerer for sensing bruksområder er enkel syntese, kontrollerbar kjemisk modifisering, og kjemisk stabilitet 14-15.

En tilnærming til å skape en kolo analysen kombinerer nanomaterialer med anerkjennelse elementer, består av å kombinere disse to artene gjennom fysisk adsorpsjon av DNA-aptamer molekyler til AuNP overflater. Gjennom target-aptamer binding aptamer opplever en strukturell endring som endrer 16-18 samvirkningen mellom aptamer med AuNP overflate, noe som fører til en induserbar rød-til-blå fargerespons 19 med tilsetning av salt. Denne forbløffende trekk ved AuNPs gir en observerbar kolo respons mekanisme for aptamer-baserte enheter som kan brukes til å designere kolorimetriske analyser for ulike analytter.

Farge analyser konstruert ved hjelp av ikke-kovalente, fysisk adsorberte DNA aptamerer på AuNP flater har stigmatisering av å være en svak sensorplattform på grunn av problemer med robusthet, en tilbøyelighet for svikt utenfor kontrollerte laboratorie innstillinger, og mangel på informasjon som er tilgjengelig for bruk i praktisk innstillinger. Men aptamer-AuNP basert kolo analysen var av interesse på grunn av enkelhet av drift og observerbare fargerespons. Målet med dette arbeidet er å gi en protokoll for design, utvikling, drift, reduksjon av overflaterelaterte falsk positiv respons, og langtidslagring av DNA-AuNP basert kolorimetriske analyser ved hjelp av kokain som representant analytten. Videre foreslo vi dette adsorbert aptamer analysen tilnærming (figur 1) som fordelaktig på grunn av enkelhet og brukervennlighet som resulterte i færre trinn enn den konvensjonelle tilnærmingen for disse aptamer-AuNP assays. For denne analysen ble det aptamer først tilsatt til AuNPs, som ble tillatt å adsorbere til overflaten for en lengre periode. En ytterligere fordel med denne fremgangsmåten var reduksjonen av responsen på ikke-målanalytten molekyler relatert til AuNP overflate interaksjoner. Imidlertid er reduksjonen i falsk positiv reaksjon var på bekostning av analysesensitiviteten. Derfor en balanse mellom overflatebeskyttelse og analyse tilgjengelighet er nødvendig for å opprettholde riktig analyse funksjon. Videre er en stor mangel for å analysere fargeanalyser gjennom andre måter enn med instrumentering er at resultatene ofte er subjektiv og åpne for tolkning fra analytiker-til-analytiker, særlig ved forsøk på å skille små forskjeller i farge. Motsatt finnes det en rekke problemer med å gjøre laboratorie basert instrumentering bruk utenfor laboratoriet, for eksempel tilgjengelighet av makt, praktisk med portabilitet, etc. I dette arbeidet ble en fargeanalyse protokoll utviklet for more portabilitet og for å eliminere noen av gjetting vanligvis forbindes med farge basert analysen tolkning 20-21. Sammenlignet med tidligere tilnærminger, dette arbeidet forsøkt å presse disse analysene til sine grenser for applikasjoner utover laboratoriet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese via Citrate Reduksjon av gull nanopartikler (AuNP) og karakterisering

  1. Rense en Erlenmeyer-kolbe (500 ml) og stor rørestav med 5 ml konsentrert salpetersyre og 15 ml konsentrert saltsyre i kjemisk avtrekkshette.
    1. Fukte hele overflaten av kolben med syrevaske, skylle kolben med nuklease fritt vann, og la kolben for å tørke.
  2. Legg 100 ml 1 mM gull (III) klorid; bruker et ark av aluminiumsfolie for å dekke toppen av syren renset Erlenmeyer-kolbe og varme under kontinuerlig omrøring på en varm plate til koking.
  3. Tilsett 10 ml av 38,8 mM natriumsitrat. Fargen endres fra klar / grå, til mørk blå / sort, og endelig mørkerød i løpet av flere minutter. Fortsett omrøring med varmen i 10 min.
  4. Tillat den AuNP suspensjonen avkjøles til romtemperatur og tilsett 110 pl dietylpyrokarbonat (DEPC) under kontinuerlig omrøring.
  5. Dekk hele flasken medaluminiumsfolie og gjør det DEPC behandling for inkubering over natten. Lagre alle AuNPs i mørket, i gult lagercontainere eller dekket med aluminiumsfolie.
  6. Autoklaver AuNP suspensjon, avkjøl til romtemperatur og filtrer gjennom et 0,22 pm pore celluloseacetatmembran. Oppbevar filtrert autoklavert AuNP stamløsning i mørke ved 4 ° C.
    MERK: Behandling med DEPC, sterilisering via autoklav, og lagring ved 4 ° C vil forbedre holdbarheten av aptamer-AuNP analysen. Lagring på denne måten vil gi rom for analysen å være funksjonell i mer enn 2 måneder.
  7. Beregn AuNP konsentrasjonen ved å skaffe Ultra Violet-Synlig absorpsjon ved 520 nm, og bruke ekstinksjonskoeffisient (Ɛ) 2,4 x 10 8 L mol -1 cm -1 med Beer lov ved å beregne konsentrasjon (c). Konsentrasjonen ble bestemt til å være 10 nM med en størrelse på 15 nm bestemt ved dynamisk lysspredning.
    MERK: Konsentrasjoner vil variere from batch-til-batch. Fortynne AuNP aksjer med nuklease fritt vann som er nødvendig for å opprettholde den ønskede 10 nM AuNP suspensjon.

2. DNA-aptamer, buffer, Solution, og analysen Forberedelse

  1. Kjøpe eller syntetisere følgende kokain bindende aptamer sekvenser ved hjelp av standard fosforamidittkjemi 22:
    MN4 19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
    MN6 19: 5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
  2. Rense aptamerer med standard avsalting 23. Rekonstituere oligonukleotider i nukleasefritt vann på enten 100 mikrometer eller 1 mm stamløsninger. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C i flere måneder.
  3. Kjøp eller forberede bestander av steril 1 M 4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre (HEPES), pH 7,4, 100 mM magnesiumklorid (MgCl2) og 1 M natriumklorid (NaCl).
  4. Forbered 50 ml buffer i nukleasefritt vann with konsentrasjoner på 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,4 og oppbevares ved romtemperatur i flere måneder.
  5. Inkuber DNA med lager AuNP-løsning (10 nM) i 3-4 timer ved romtemperatur og beskyttes mot lys. Varier volumet av AuNPs som ønsket å gi nok prøve for testene som skal utføres (2.5-7.5 ml).
    1. Her bruker laste tettheter på 90, 120, 150, og 180 DNA-molekyler / AuNP i dette arbeidet. Varier volum og konsentrasjoner av DNA tilsvarende. Tune DNA dekning for å redusere utilsiktede AuNP overflaterelaterte fargere av non-target analytter.
      MERK: Økning av DNA-dekning vil redusere analysen følsomhet. Laste tettheter blir kalkulert ved å kjenne konsentrasjonen av AuNP lager, og beregning av det totale antall AuNPs stede i den ønskede for bruk i eksperimenter volum. Dersom den faktiske dekningen tettheter er ønskelig, finnes protokoller for å oppnå disse verdiene 7. DNA-dekningen ble bestemt ved anvendelse av en 50 kDa molecular vekt spin cutoff kolonne for å skille AuNP bundet DNA fra den frie DNA. De AuNPs er for store til å passere gjennom spinnkolonne, mens den frie DNA vil passere gjennom lett. Det neste trinnet er å kvantifisere gratis DNA samlet inn ved hjelp absorbansmålinger eller et enkelttrådet DNA fluorescerende fargestoff.
  6. Legge til et likt volum av 20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7,4 buffer og plassere prøven ved 4 ° C i mørket over natten. Den aptamer-AuNP analysen var i en 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,4 (assaybuffer).

3. Salt Titrering og analyseoppsett

  1. Bestem første saltkonsentrasjon for å indusere analysen fargeresponsen av salt titrering med analysen blank. Tilsett 20 ul metanol (blank) til 180 ul aliquoter av aptamer-AuNP analyse i en 96-brønns plate. Titrer prøvene med økende volumer av lager NaCl-løsning (1 M eller 2 M) og bestemme likevektspunktet (Figur 2 MERK: Analysen kan skaleres til mindre volum ved å holde forholdet for metanolblindprøven (eller oppløst analytt) til aptamer-AuNP assay den samme.
    1. Her, bestemme NaCl volumet som trengs for å forårsake den minste fargeendring ved visuell observasjon. Utgangs konsentrasjonen i analysen var 75 mM og 130 mM for MN4 og MN6, henholdsvis ved et 60 DNA-molekyl / AuNP dekning tetthet.
      MERK: For en kvantitativ bestemmelse for den første saltkonsentrasjon, midtpunktet i titreringskurven fungerer som et godt utgangspunkt. Dessuten vil konsentrasjoner brukt varierer basert på aptamer, DNA-dekning tettheter, fra dag til dag ytelse, og batch-til-batch.
  2. Optimalisering av analyseresponsen, tilsett 20 ul analyse molekyler fortynnet i metanol for å 180 ul aliquoter av aptamer-AuNP analyse i en 96-brønns plate ved værelsestemperatur. Umiddelbart tilsett NaCl-konsentrasjonen bestemt i det foregående trinn for å initiere forsøket fargeresponsen.
    NEITE: Bruk en multikanal pipette til å utføre flere eksperimenter samtidig.
  3. Oppnår det høyeste fargeendring mulig ved å øke eller redusere den NaCl-konsentrasjon, og å sammenligne målet responsen til den tomme respons. Bruk NaCl konsentrasjon som gir den største responsen forskjell.
  4. Observere eller måle analysen svar 150 sek etter NaCl tillegg. Analyser absorbans ved 650 nm og 530 nm ved hjelp av et spektrometer eller få et digitalt kamera bilde av analysen respons (se pkt 4 for fotoanalyses protokollen).
    MERK: En mikroplateleser ble brukt i å skaffe målingene for dette arbeidet.
  5. Plotter resultatene som forholdet mellom absorbans oppnådd ved 650 nm og 530 nm (E 650 / E 530) som en funksjon av analyttkonsentrasjon. Normalisere analysen responsen til den tomme signal slik det ble gjort i dette arbeidet.

4. Bilde og Digital Image Color Analysis Protocol Analysis

  1. FORBEREDELSERe analyseprøver som beskrevet (avsnitt 3,2-3,3). Plasser 96-brønns plate på en transilluminator.
    MERK: En standard laboratorium transilluminator er typisk for lyst til å få brukbare digitale bilder for denne analysen. Disse transilluminators føre regelmessig atskilt "mørke striper" skal vises i det digitale bilde på grunn av intensiteten av lyskilden. Å gjøre en transilluminator fra en lysdiode (LED) basert lyskasse og et stykke ugjennomsiktig plast fungerer godt.
  2. Skaff bilder av 96-brønns plate på 150 sekunder etter NaCl tillegg importere bilder til bildeanalyse programvare, og beregne gjennomsnittlig røde, grønne og blå (RGB) verdier, ved hjelp av en trinnvis gjennomsnittsteknikken, som vist i ligning 1 24:
    (1) ligning 1
  3. Konvertere RGB-verdier fra standard RGB (sRGB) fargerom til kromatisitetsdiagram (CIExyY) fargerom, ved hjelp av følgende ligninger 24:
    (2) ligning 2
    (3) ligning 3
    (4) ligning 4
  4. Omdanne den eksponentielle RGB-verdiene til lineær RGB-verdier ved å bruke ligning 2. Matrise som angitt i ligning 3 blir brukt til å beregne X, Y og Z-verdiene av CIE-fargerommet 24.
  5. Beregn x og y kromatisitets verdier ved hjelp av ligning 4 representerer gjennomsnittsfargen av pikslene i området som er valgt for analyse 24.
  6. Utføre analysen i hver brønn og plotte kromatisitets verdier for å generere en kalibreringskurve (figur 4). Skaff standard feil ved å analysere fargen på forskjellige områder av samme brønn.

5. Frysing Aptamer-AuNP analyse for langvarig oppbevaring

  1. Forbered aptamer-AuNP analyse komponenter som beskrevet i kapittel 2.4 og 2.5. Lage separate oppløsninger inneholdende 1 g / ml trehalose og 1 g / ml sukrose i nuklease-fritt vann for å gjøre den cryogen løsning.
    MERK: Høye konsentrasjoner av trehalose og sukrose ble anvendt for å redusere fortynningsfaktoren ved utarbeidelsen av analysen for frysing. Varme sukkeroppløsninger på en varm plate i et beger med vann for å grundig oppløse sukker før bruk.
  2. Lage en løsning som inneholder 19,2 mg / ml trehalose og 4,8 mg / ml sukrose med 60 MN4-DNA / AuNP analysen ved et sluttvolum på 200 ul i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Endelige cryogen oppløsningskonsentrasjoner vil variere med DNA dekning.
    MERK: Prøver å bli frosset bør ikke overstige 300 mL. Større mengder kan ikke fryses ordentlig.
  3. Flash fryse prøvene ved anvendelse av en -146 ° C fryser eller i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene frosset inntil bruk. Lagring kan være i en -80 ° C eller -20 ° C når flash frysing er fullført.
  4. For dette arbeidet, la prøvene i -146 ° C fryser i løpet avnatt og deretter overføre til en -20 ° C fryser for langtidslagring.
    MERK: Flash frysing kan føre til at aptamer-AuNPs å aggregere. Teste integriteten av fryseprosessen ved å overvåke absorbansen profil og sammenligne den med en ikke-frosne prøve. Hvis aggregering er observert, øke mengden av kryogen løsning for å kompensere for dette problemet.
  5. Tine prøvene ved romtemperatur og bruker bare nok prøvene som er nødvendig for eksperimentering. Skaff absorbans spektra av tinte prøver og sammenligne med baseline spektra av en ufrosset kryogen løsning behandlet prøve. Mål absorbansen fra 400 nm til 700 nm.
  6. Utfør salt titrering (avsnitt 3.1), teste analysen (avsnitt 3.2), og plotte resultatene (avsnitt 3.3 og 3.4) som tidligere beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hovedmålet med dette arbeidet var å utvikle og undersøke stabilitet og robusthet aptamer basert AuNP kolorimetriske analyser for bruk i felten. Som fremhevet i en tidligere publikasjon, ble to forskjellige strategier for å skape analysen undersøkte 7. Analysene ble betegnet Free Aptamer-analysen og de adsorberte Aptamer-analysen. Den Absorbert Aptamer analysen var mer attraktivt i forbindelse med en fieldable gjenkjenning analysen (figur 1).

Figur 1
Fig. 1. Skjematisk fremstilling av de adsorberte Aptamer analysen Den aptamer ble blandet med AuNPs og inkubert over natten; analytt-molekyler oppløst i metanol ble tilsatt til den absorberte Aptamer Assay, umiddelbart etterfulgt av tilsetning av natriumklorid (NaCl) for å indusere aggregering AuNP når målet ble tilsatt.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54063/54063fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dette var på grunn av reduksjon i antall falske positive til ikke-targetnukleinsyre analytter, relativ enkelhet og brukervennlighet av Absorbert Aptamer analysen. For å fremstille det adsorberte Aptamer-analysen, ble DNA-aptamer blandet med AuNPs og inkubert over natten i analysebuffer. Dette tillot aptamer til lett adsorberes på AuNP overflaten, noe som reduserte følsomheten av analysen for falske positive reaksjoner på ikke-targetnukleinsyre analyse molekyler som maskering eller kutte agenter. Det er imidlertid bare den på forhånd dannede strukturen av MN4 kokain aptamer var aktiv i nærvær av kokain (mål) i denne analysen utforming. Analysen ble anvendt ved tilsetning av analytt-løsninger, etterfulgt av umiddelbar tilsetning av den egnede konsentrasjon av NaCl. Saltoppløsninger ble brukt for å initiere den observerbare og measurable fargeendring av analysen. Analysen ble utført i løpet av 2-3 min. etter tilsetningen av den analytt-løsningen.

En kritisk virkning på utførelsen av disse fysisk adsorberte DNA-baserte kolorimetriske assays er den induserte fargeresponsen, ved tilsetning av den egnede konsentrasjon av salt. Tilsetningen av salter er kjent for å destabilisere AuNP suspensjoner resulterer i aggregasjon av partiklene ved å maskere de negative ladninger av citratet lag som stabilisere AuNPs, og deretter avtar den interpartikkelelektrostatiske interaksjoner. Resultatet er observerbar rød-til-blå fargeendring. Den samme effekten er observert med DNA behandlet AuNPs. Når det gjelder DNA-aptamerer, analytiker bestemme konsentrasjonen av salt er nødvendig for å forårsake minimal observerbar AuNP destabilisering (blåfarging). Med tillegg av målet, blir stabiliseringen av AuNPs ved DNA-aptamer betydelig redusert som resulterer i en observable, målbare mål dose respons fargeendring. Denne fargeendring kan bare kan oppfattes med tillegg av den egnede forhåndsbestemt mengde av salt.

Like viktig er den fremgangsmåte hvor den passende konsentrasjon av salt ble bestemt. Dette ble oppnådd ved å utføre en titreringskurven ved tilsetning av økende konsentrasjoner av natrium-klorid-løsning til en serie av analyseemner (figur 2).

Figur 2
Figur 2. Salt-indusert titrering kurve. Citrate-stabilisert (rød), MN4 kokain bindende aptamer (grønn), og MN6 kokain bindende aptamer (lilla) behandlet AuNP prøver ble titrert med natriumklorid (NaCl). De første saltkonsentrasjoner som oppnås visuelt ble angitt med tilsvarende fargede pilene for hver kurve. Feilfelt er definert av standardavviket itriplikate målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Her ble den opprinnelige saltkonsentrasjonen som brukes bestemmes ved visuell inspeksjon, og ble tatt for å være den saltkonsentrasjon som forårsaket den minste blåfarging observerbare med analysen blank. Men for en mer kvantitativ tilnærming, forskerne ny på dette området av forskningen kan brukes midtpunktet av titreringen ekvivalenspunktet som utgangssaltkonsentrasjon. Utover dette punktet fargeresponsen begynner å øke raskt. Videre ble saltkonsentrasjonen som blir benyttet i utførelsen av analysen justert for å maksimere fargeforskjellen mellom analyse tomme og kokain responser. Dette ble oppnådd ved å øke og redusere saltkonsentrasjonen til det beløp som bestemt ved titrering. Saltet titrering prosedyren ble utført daglig tilstår for dag-til-dag variasjon med analysen. Den satsvise variasjon i saltkonsentrasjon som er nødvendig for analysen var ikke mer enn 20%. Figur 2 har tre distinkte AuNP prøver, citrat-stabilisert (uten DNA), MN4 (DNA-aptamer stabilisert), og MN6 (DNA-aptamer stabiliserte). DNA dekning for MN4 og MN6 prøvene var 60 DNA-molekyler / AuNP, og hver titreringskurven har en annen titrering likevektspunktet og midtpunktet basert på nivået av stabilitet gitt av overflatebehandlingen. Citrate gitt lite stabilitet, MN4 (dobbelttrådet aktig struktur) gitt mer stabilitet og MN6 (enkelttrådet aktig struktur) gitt den mest stabilitet til AuNPs. De første saltkonsentrasjon som brukes i dette arbeidet var innstilt til å være ~ 50 mM, 90 mM ~ og ~ 130 mM visuelt. Trenden er enig med konvensjonell forståelse av DNA-strukturen og dens stabiliserende effekt på AuNPs 24-25. Når du utfører denne testen visuelt, analysen blank viste en svak blå Colora delse med de saltkonsentrasjoner som er identifisert i figur 2 ved hjelp av piler, som er i nærheten av midtpunktene som omtalt. Saltkonsentrasjoner før teser punkter gir liten eller ingen observerbar fargeendring, og utover disse punktene farge øker raskt. For dette arbeidet ble den første saltkonsentrasjonen bestemmes visuelt og deretter finjustert ved hjelp av mikroplateleser måle sammenligninger av analyse tomme og kokainprøver.

Med Free Aptamer analysen tilnærming, falske positive svar var et problem. Overflate interaksjoner av analyse molekyler er en kilde for dette problemet, som beskrevet i en tidligere publikasjon 7. For å hindre at uønskede farge som skyldes ikkespesifikke AuNP overflate interaksjoner, ble DNA dekning tettheter av målet bindings aptamer kontrollert (figur 3).

jpg "/>
Figur 3. Adsorbed aptamer assay reaksjon med varierende DNA dekning tetthet. Aggregering respons til kokain (rød, mål), EME (grønn, kontroll), og prokain (blå), en AuNP overflate aktivt molekyl, for 90, 120, 150, og 180 DNA / AuNP dekning tettheter ble vist. Alle de analyserte prøvene ble oppløst i metanol ved 1 mg / ml. Feilfelt er definert ved standardavvik i tre eksemplarer målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Generelt ble den falske positive responsrate på ikke-targetnukleinsyre analyse molekyler på grunn av AuNP interaksjoner redusert med økende DNA deknings tettheter. Imidlertid analysesensitiviteten ble redusert som følge av økt DNA-dekning. I dette arbeidet DNA-tettheter på 60, ​​90, 120, 150, 180, og 300 DNA / AuNP var undersokelserted. Tettheter av 60 og 300 ble grundig beskrevet i tidligere arbeid 7. Figur 3 representerer ytterligere DNA tettheter studert. Prokain var en av de mer høyt overflateaktive ikke-targetnukleinsyre analytter i undersøkelsen. For hver av de individuelle DNA-dekning, ble analysen reaksjon maksimeres ved å justere saltkonsentrasjonen som beskrevet. Generelt som DNA-dekning øker, vil responsforskjellen mellom styre (EME) og kokain reaksjon avtar. Tilsvarende analyse reaksjon i nærvær av prokain avtar til bakgrunnsnivåer med økende dekning. 180 DNA / AuNP tetthet eliminert overflaten relatert falsk positiv respons for procaine, og samtidig beholde et høyt mål respons. Denne vurderingen beskriver en prosess for å justere disse farge analyser for å redusere overflaterelaterte falske positive reaksjoner, og samtidig bevare målrespons så mye som mulig. Forbedret følsomhet kan oppnås gjennom reduksjon av DNA-dekning. Men falsk positive responser kan bli et problem, avhengig av programmet.

Kolorimetriske analyser blir ofte brukt for raske og enkle ofte presumptivt kvalitative og selv kvantitative tester. Vanlige problemer med kolorimetriske bestemmelser er den subjektive natur farge dømmekraft, spesielt med subtile og borderfargeforskjeller. De dom samtaler som må gjøres av analytikeren kan føre til feiltolkning av data. Målinger på laboratorieutstyr redusere usikkerhet og ubesluttsomhet knyttet til vurdering av analyseresultatene. Men i dette arbeidet, hensikten var å gi et felt klar analyse som ga umiddelbare resultater analytikeren. Som sådan, var et bilde bildeanalyse teknikk etablert som ga en mer avgjørende farge resultat (figur 4).

Figur 4
Figur 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Med økende konsentrasjoner av kokain, det analyse farge ført til at stadig blå farge. Digitale bilder av kalibreringskurver ble oppnådd ved å bruke to forskjellige smarttelefoner, og importert til en standard bærbar datamaskin for analyse ved hjelp ImageJ programvare. Kromatisitets verdier ble brukt til å plotte calibration kurver som vist i figur 4. Den billedanalyse ga en lineær respons på økende konsentrasjon av kokain med begge sett av smartphone bilder som indikert ved R 2 verdier. Denne metoden ble overført til en Smart-enhet app for å hjelpe analytiker i feltet. En detaljert evaluering av programmet ble utført i en tidligere publikasjon 7. Applikasjonen eliminert mye av usikkerheten og ubesluttsomhet forbundet med subtile fargeendring resultatene av de laveste konsentrasjonene kokain.

Langtidslagring av fysisk adsorberte DNA-analyser av denne typen er ikke undersøkt i stor detalj, og et av målene med dette arbeidet var å finne forhold til å utvide analysen holdbarhet. Behandling av assay-komponentene for lagring ved 4 ° C ble beskrevet i en tidligere publikasjon 6. For dette arbeidet ble frysetørking av de preparerte analysekomponentene vurderes for langvarig bruk og oppbevaring of analysen. Lyofilisere assay-komponentene har den klare fordel av å holde og lagring av prøver ved omgivelsestemperatur, noe som ville eliminere behovet for et kjøleskap eller fryser. Den primære trinn i lyofilisering prosessen er å først fryse prøven. For å sjekke AuNP prøvene overleve fryseprosessen, å utføre en sammenligning av absorbansen spektra av analysen før frysing til den av tint prøven. Skanningene skal samsvare nøyaktig. Hvis prøvene ikke overlever fryseprosessen, vil det tinte prøve spektrum har økt absorbans i området over 525 nm. Dette indikerer at AuNPs samlet under frysing og tint prøven er kompromittert. Levedyktigheten til tinte analysen ble testet med kokain og EME (figur 5).

Figur 5
Figur 5. Absorbert Aptamer analysen svar holdbarhet studie. Quantificasjon av analysen respons til EME (grønn, kontroll), og kokain (rød, target) utført med frosset og deretter tint Absorbert Aptamer analyseprøver i løpet av en periode på fire uker. Feilfelt er definert ved standardavvik i tre eksemplarer målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De tint analyse tomme prøvene holdt seg på samme verdi i løpet av studieperioden som prøver som ble gjort, og brukes umiddelbart (uten lagring). Svarene på kokain og EME prøvene var i samsvar med typiske reaksjoner observert med prøver laget og brukt umiddelbart (ingen lagring). De frosne prøvene ble overvåket for perioden på 4 uker med ingen endring i analyse ytelse i forhold til prøver lagret ved 4 ° C over samme periode 7 eller analyseprøver laget og brukt immediately. Kokain svarene var relativt konstant i løpet av fire uker, noe som også ble observert for de 4 ° C prøver 7. Nedgangen i EME signal fra uke 1 til uke 2 er ofte observert med romtemperatur og 4 ° C lagring også. Et fenomen vi tilskrives modning av analysen i løpet av den første uken. Denne tilnærmingen utvidet de tilgjengelige for langtidslagring av de adsorberte DNA kolorimetriske analyser alternativer, og gitt en inngangsport til flere langsiktige lagringsalternativer, nemlig frysetørking.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løpet av det siste tiåret, har nanopartikkel basert kolorimetriske analyser er utviklet for påvisning av mål inkluderer små molekyler, DNA, proteiner og celler 2-4. Analyser som bruker DNA-aptamerer med nanopartikler har blitt stadig mer interesse. Vanligvis blir disse kolorimetriske analyser utført ved å blande DNA-aptamer med analytt-molekyler, etterfulgt av tilsetning til AuNPs 9-10. Imidlertid har disse analysene er benyttet i proof-of-concept demonstrasjoner med kontrollerte laboratorie innstillinger og med begrensede, utvalgte kontroller. Nylige fremskritt med å overføre denne teknologien inn i feltet har blitt gjort 7. I denne tilnærmingen DNA-aptamer ble adsorbert til AuNP overflater før tilsetning av analytten molekyler som skal testes (figur 1). Utviklingen av enten aptamer-gull nanopartikkel baserte kolorimetriske analyser krever optimalisering på ulike stadier av fabrikasjon / analyseprosessen. Dermed de nye til platenipline må være klar over nyansene i forbindelse med raffinering og feilsøking disse analysene for å være vellykket.

De adsorberte aptamer-gull nanopartikkel-analyser krever forsiktig optimalisering for hvert aptamer / target par. Men å følge trinnene forklart her tilbyr en konsekvent protokoll for å utføre optimalisering av disse kolorimetriske analyser. Bestemmelse og justering av saltkonsentrasjonen som resulterer i maksimal observerbar eller målbar fargeendring mellom målet og analysen blank er en av de mer kritiske optimaliseringstrinn (figur 2 og 3). For noen aptamer / target par, har vi observert at bruk av høye saltkonsentrasjoner nær endepunktet av titreringskurven har resultert i en blå-til-rød farge skift 18. Dette indikerer en stabilisering av AuNPs ved aptamer ved tilsetning av målet og salt.

Andre faktorer som kan påvirke analyse performance omfatte bufferkomponenter og konsentrasjon, mengden av DNA-aptamer dekning, løsemidler som brukes, temperatur, aptamer sekvens og struktur, target-assay inkubasjonstiden (tid når målet er tilsatt til analysen, forut for salttilsetningen), og fargeutviklingstiden ( tiden som er nødvendig for at fargen skal utvikle, etter salttilsetningen). En 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,4-buffer var analysebufferen til valg i mange av de target / aptamer-par som anvendes i vårt arbeid. Dette kan imidlertid buffer ikke være ideelt for alle aptamerer. For å oppnå riktig folding av aptamer, kan analysebufferkomponenter må være skreddersydd, og holdes så nær som mulig til blandingen som anvendes i den aptamer valg buffer. Ved anvendelse av en buffer med AuNPs, må bufferkomponenter og konsentrasjoner vurderes, særlig med ioniske stoffer. Høye konsentrasjoner av ioniske forbindelser kan føre til for tidlig aggregering av AuNPs. DNA / AuNP dekning ble demonstrert i figur 3. Da det DNAdekning øker fra 90 til 180 DNA / AuNP, redusert målanalytten respons forårsaker nedsatt analysefølsomhet. Derfor er en avveining behov som er avhengig av hver enkelt aptamer, på grunn av sin spesielle folding og graden av interaksjoner med AuNP overflate.

I tillegg kan løsningsmidler for å oppløse analytt-molekyler resultere i utilsiktet aggregering av AuNPs. Vann, analysebuffer, og metanol har alle blitt brukt uten problem. Benyttet uten fortynning, acetonitril og dimetylsulfoksyd (DMSO) for å adsorbere den AuNP overflaten forårsaker uønsket aggregering. Acetonitril var problematisk, selv ved fortynninger på mindre enn 1% (sluttvolum). Løsemidler bør testes med AuNPs før bruk med kolorimetrisk analyse. Den temperatur ved hvilken prøven blir utført kan ha en innvirkning på hvorvidt en reaksjon er observert med analysen. Dette har mer å gjøre med aptamer Strukturen og smeltetemperatur, eller stabilitet av det aptamer strukturen ved en gitt temperatur, ennmed nanopartikler. I vårt arbeid har vi fastslått at det er en delikat balanse mellom å ha den aptamer i en forformet struktur med DNA i sammenfoldet form, og heller ikke helt i en enkelt-trådet struktur. Dette er tilfellet for den adsorberte aptamer analysen form av disse kolorimetriske analyser (figur 1). Når man vurderer struktur, må det aptamer-sekvensen også tenkes fordi mye av aptamer struktur er et resultat av de individuelle oligonukleotidsekvenser. Imidlertid er videre etterforskning i dette aspektet nødvendig.

Generelt er den tilnærming vi bruker i å utvikle en aptamer-AuNP basert kolorimetrisk analyse er den samme for alle aptamer / target-par. Først få en aptamer for et mål av interesse. Dette kan oppnås gjennom å søke litteraturen eller valg av en aptamer for et molekyl av interesse. På dette stadium er det ingen måte å vite hvorvidt den aptamer er en god kandidat for å skape en kolorimetriskanalyse. Dette kan bare bestemmes ved eksperimentering. Deretter blir aptamer inkubert med AuNPs natten over for å fremstille den adsorberte aptamer-analysen (figur 1). Standarden tilnærming er å begynne å teste med 60 aptamerer / AuNP; imidlertid flere dekning forberedt for den neste fasen av testing. Når analysene er klar for testing, utføre titreringskurven undersøkelser som beskrevet (figur 2). Midtpunktet av titreringskurven tjener som et pålitelig utgangssaltkonsentrasjon som skal anvendes for målet, analysen blank, og kontrollprøver. Saltkonsentrasjonen er finjustert for å gi en maksimal fargeforskjell mellom mål- og analyse tomme prøver. For å teste responsen er reell og skyldes aptamer-target bindende og ikke på grunn av ikke-spesifikke mål / løsemiddel interaksjoner, utføre analysen med kontroller. Samtidig er analyse farge utvikling ganger undersøkt ved 5 minutters intervaller. Etterfulgt av target-assay inkubasjonstider på 5 min intervals, er i utgangspunktet 15 + min inkubasjonstider brukes før dette trinnet er optimalisert. Avhengig av resultatene, kan ytterligere optimalisering av saltkonsentrasjonen, aptamer dekning, inkubasjonstid og fargefremkalling tid være nødvendig (figur 3). Denne tilnærmingen beskriver en protokoll for design og utvikling av aptamer-AuNP kolorimetriske analyser for et mål / aptamer par. Ytterligere undersøkelser i aptamer sekvens og strukturelle effekter på forbedring av adsorbert aptamer kolorimetriske analyser er av stor interesse. Det er behov for å forstå interaksjoner knyttet til aptamer, mål og AuNPs. Denne kunnskap kunne føre til skreddersy aptamerer for bedre funksjonalitet og til og med å forutsi hvilke aptamerer vil være aktiv i den adsorberte aptamer analyseformatet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold(III) chloride hydrate Sigma 254169 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time
Sodium Citrate Dihydrate Sigma W302600-1KG-K We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time
Synergy Bio-TEK HT Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized Amresco J848 Any sterilized brand will work
Corning, 250 ml Filter System, 0.22 µm cellulose acetate Fisher 430767 Other membranes have been found to remove the AuNPs
UV Spectrophophotometer Varian Cary 300  Any absorbance spectrometer will work
Magnesium Chloride Hexahydrate Fluka 63068 ≥98% any brand will work
DNA IDT Custom DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used
Procaine Hydrochloride ACROS AC20731-1000 99% stocks of 1 mg/ml in methanol were prepared
Hydrochloric Acid Fisher A144S-500 36.5-38.0% w/w other brands will work
Cocaine Hydrochloride Lipomed COC-156-HC-1LM We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays
Nitric Acid Fisher A509-SK212 65% w/w other brands will work
Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade Sigma S5150-1L Sterile solutions made from solid will work
Diethyl Pyrocarbonate Sigma D5758-25 mL ≥97% any brand will work
Ecgoninemethylester Hydrochloride Lipomed COC-205-HC-1LM We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target
Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7 ml VWR 10011-722 We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house
nuclease free water
methanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Housecroft, C., Constable, E. Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , Pearson Education. ISBN: 9780131275676 349-353 (2006).
  2. Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
  3. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  4. Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
  5. Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
  6. Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
  7. Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
  8. Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
  9. Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
  10. Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
  11. Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
  12. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
  13. Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
  14. Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
  15. Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
  16. Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
  17. Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
  18. Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
  19. Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  20. Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
  21. Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
  22. Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
  23. Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
  24. Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
  25. Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).

Tags

Biokjemi kolo analysen gull nanopartikler aptamer kolo app nukleinsyrer nanoteknologi biosensorer optiske sensorer
Design og utvikling av Aptamer-gull nanopartikkel-basert kolo Analyser for In-the-feltet Applications
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, J. E., Chávez, J. L.,… More

Smith, J. E., Chávez, J. L., Hagen, J. A., Kelley-Loughnane, N. Design and Development of Aptamer–Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications. J. Vis. Exp. (112), e54063, doi:10.3791/54063 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter