A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
实时聚合酶链反应也称为定量PCR(Q-PCR)是在微生物生态学一种广泛使用的工具来量化环境样品中的分类和官能团的基因的丰度。组合使用逆转录酶反应(RT-Q-PCR),它也可以被用于量化基因转录。 Q-PCR利用高度敏感的荧光检测化学,允许在反应指数阶段的PCR扩增子的定量。因此,在PCR反应的平台期检测与'终点'的PCR关联的偏差被避免。的协议通过提供PCR实时定量沿海沉积物中的细菌16S rRNA基因和成绩单。首先,用于从海岸沉积物,包括不含DNA的RNA的制备所需的附加步骤的DNA和RNA的共提取的方法,概述。二,一步一步的指导,为16S rRNA基因和TR量化从通过Q-PCR和RT-Q-PCR提取核酸anscripts概述。这包括DNA和RNA标准曲线的构造细节。在微生物生态学采用RT-Q-PCR检测的主要考虑因素包括在内。
微生物是生物圈的驾驶生态系统功能的基石。大多数微生物仍然未培养1。因此,基于分子的方法是从根本上促进我们的环境中微生物的多样性和功能的理解。中央这些方法是核酸从环境样品提取和使用聚合酶链反应(PCR)的靶基因的随后的扩增。
的DNA / RNA提取的第一步骤的目的是裂解微生物群落本的细胞壁,除去不需要的非核酸分子( 例如 ,有机和无机物质),并在进一步的下游分析溶液保留的DNA / RNA。在文献2,3,4,5提供多种选择,包括各种商业提取试剂盒后,格里菲斯方法6,广泛采用7,8,9。它是具有成本效益和巴rticularly非常适合于沉积物,因为它使用珠跳动步骤以裂解细胞,并结合步骤以最小化PCR抑制剂,如腐殖酸这样的共同提取,而同时回收DNA和RNA。
第二步骤利用聚合酶链式反应(PCR)扩增靶基因,如16S rRNA的分类标记,从所提取的核酸。这种方法有,并继续推动未鉴定微生物黑匣子10,11的探索。然而,终点,基于PCR的方法从各种限制的影响,可以偏置微生物群落12的表征。准确量化基因/转录丰度,实时PCR,也称为定量PCR(qPCR的)必须被使用。定量PCR利用了PCR的每个循环之后跟踪扩增子积累荧光报道染料系统。这是显著因为它意味着可以在早期指数阶段发生的量化,而比终点,将PCR反应的阶段中,当扩增子产量仍然是成正比的靶基因的初始丰盈。
两个报告系统是常用的:一个嵌入核酸染色13和DNA聚合酶14的5'3'外切酶活性。因为前者报告系统不显结合到所有双链DNA,它可能会导致与靶序列的过高估计,如果不想要的非特异性扩增或通过产物引物二聚体发生。为了规避这一点,可能需要扩增的广泛的优化。在后者的系统中,模板的扩增是使用Taq聚合酶劈开从内部探针的荧光团的5'核酸酶活性的组合跟踪。此特征增加了测定的特异性由于荧光探针的利用,只有结合于互补的靶特异性sequenc引物对两地电子。与两个化学定量是通过确定交叉点(CP),其中的PCR扩增子作为通过增加荧光测量的积累,是显著高于背景荧光来实现。
的qPCR已在微生物生态学被广泛用来确定在不同的环境中15基因的丰度。此外,为cDNA RNA的逆转录用的qPCR和RT-qPCR的组合来量化基因的表达。因此,定量PCR和RT-qPCR的代表基因和/或转录的数字环境样品中的量化快速,有效的方法。
在海岸沉积物微生物驱动各种生态系统过程,包括有机物矿化,污染物的降解和大量营养素如氮16,17,18的生物地球化学循环。这些转换的详尽的了解需要一个全面有分起作用的微生物种群,包括基因及成绩单丰度的定量数据吨。在这里,我们推出一系列全面测试,简化和标准化的协议细菌16S rRNA基因及成绩单丰度在海岸沉积物进行量化。的协议概括了样品的采集,同时DNA和RNA提取,不含DNA的RNA制备的提取的核酸的质量检查,生成的16S rRNA-DNA和-RNA标准和环境样品的定量。从这里介绍的方法得出量化的数据需要微生物群落驾驶沿海生态系统揭示。
DNA / RNA提取用定量PCR的组合提供了一种快速,准确,比较合算的基因和转录物丰度的从一系列环境样品,如海岸沉积物的敏感定量方法。
初始核酸提取是确保微生物群落本的代表性视图达到22的关键步骤。需要被考虑为提取协议的一些限制:一)总细胞裂解的成就,二)的抑制性化合物( 例如 ,腐殖酸或多酚的共萃取),c)在该RNA部分污染DNA,四)储存时的提取核酸的快速降解。必须采取预防措施,以规避这些限制。例如,特别注意,必须注意确保核酸提取的样品类型( 例如 ,沉淀物,土壤,废水等优化)。在核酸的产量和质量为DNA和RNA显著改进可以通过进行初步实验23来实现。为了最大限度地减少抑制化合物的对基于PCR的应用程序24中的效果,测试的范围内所提取的DNA和RNA稀释液。规避从多个冻融提取的DNA / RNA的快速降解,避免在-80℃的遗传信息可能丢失,存储多个小体积等分试样。
当精心设计,定量PCR 是一个强大的,高度重复性和敏感的方法。值得注意的是,在此协议中概述用于扩增和标准曲线结构的方法可以适用于任何感兴趣的基因靶标,包括其他的系统发育标记物( 即 ,古细菌的16S rRNA,真菌18S rRNA基因)或涉及在环境中的重要功能的基因。在利用定量PCR的已知限制是:a)可重放高质量的S中的代为绝对定量TANDARD曲线,二)引物/探针的选择的Q-PCR测定条件的优化,c)使用低质量/剪切核酸,四)的DNA / RNA的工作稀释度的选择,以避免抑制。此外,它必须被认为是定量PCR技术提供了基因/转录丰度可能不等同于细胞计数:这是特别当16S和18S rRNA基因被定位的情况下,如微生物在它们的基因组具有核糖体基因的不同拷贝数25。
质量差的标准曲线将导致感兴趣的基因的不准确的定量。它是存储高浓度标准小等份从新鲜标准曲线可以由库存好的做法。不要储存标准曲线,总是从每一次最集中的股票做出新的稀释液。环境样品的准确定量保证斯坦的浓度范围准曲线跨越未知样品的预期的Cp值。当量化成绩单,构建从RNA不双链DNA的标准曲线。当可能时,样品可以直接进行比较的量化应单一测定内完成,以避免测定间变异20。这可能不总是可能的。因此,为了比较测定之间产生基因的丰度,最好是具有随机子集测定之间复制样品。的引物和探针集的多种选择目前可用于定量PCR针对微生物类群和官能团选择这些的时候,以确保这两个最大的覆盖面和特异性的目标群体是需要15.仔细考虑。如果一个qPCR分析的反应效率不令人满意的,解决始于测试不同的热循环条件(如退火时间和/或温度)和/或反应条件, 例如 ,不同的引物-探针的浓度。 ØNCE的Q-PCR测定法和反应条件进行了优化,始终进行一系列的DNA / cDNA的稀释物的初始测试以确定适当的模板浓度。选择产生最高拷贝数作为最优模板稀释用于进一步分析的稀释范围。
目前,新一代测序技术,有效地环境26,27,28过多阐明微生物群落结构和功能的光。然而,这些数据集通常是基于终点PCR扩增子库,因此只提供丰特定类群的半定量评估。因此,实时基于PCR的技术的能力,以针对特定分类标记(从高域到应变水平)允许通过新一代测序得到的结果的有效验证。此外,定量PCR已被成功地用于与其它微生物生态学分子的方法,例如稳定异TOPE探测(SIP)或亲缘/功能芯片。与前者的工具相结合,定量PCR可用于定量代谢活性社区29,30。当与微阵列分析相结合,定量PCR提供环境31,32进化标记为基础的功能基因调查的关键定量解释。
因此,无论是单独使用或与生态系统功能的其他(通常基于过程的)评估相结合,定量PCR是在微生物群落和生态系统功能之间的联系难以捉摸的探索微生物生态学家的重要工具。
The authors have nothing to disclose.
本出版物已经从与自然环境研究委员会(NERC)的资助下,授权号NERC NE / JO11959 / 1和爱尔兰科学基金会及以下授权号11 / SIRG / B2159awarded的玛丽 – 居里行动COFUND到CJS进行的研究散发出和东方学术研究联合会(ARC东部)。
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |