Abstract
ПЦР в реальном времени, также известный как количественной ПЦР (Q-PCR) является широко используемым инструментом в микробной экологии для количественного определения генов обилиями таксономических и функциональных групп в пробах окружающей среды. При использовании в сочетании с реакцией обратной транскриптазы (ОТ-Q-ПЦР), он также может быть использован для количественного определения генных транскриптов. Q-ПЦР использует высокочувствительных флуоресцентных обнаружения химических, которые позволяют количественно оценить ПЦР-ампликонов во время экспоненциальной фазы реакции. Таким образом, систематические ошибки, связанные с "конечной точки" PCR обнаруживались в фазе плато ПЦР-реакции можно избежать. Протокол для количественного определения бактериальных генов 16S рРНК и распечаток из прибрежных отложений с помощью в режиме реального времени обеспечивается ПЦР. Во-первых, способ совместного извлечения ДНК и РНК из прибрежных отложений, в том числе дополнительных шагов, необходимых для получения ДНК-РНК, свободной, изложена. Во-вторых, руководство шаг за шагом для количественного определения генов 16S рРНК и трanscripts из извлеченного нуклеиновых кислот с помощью д-PCR и RT-Q-ПЦР изложена. Это включает в себя данные для построения кривых ДНК и РНК стандартных. Основные соображения по использованию анализов RT-Q-ПЦР в микробной экологии включены.
Introduction
Микроорганизмы являются краеугольным камнем функции биосферного вождения экосистем. Большинство микроорганизмов остаются некультурная 1. Поэтому молекулярные подходы, основанные имеют основополагающее значение для улучшения нашего понимания разнообразия и функции микроорганизмов в окружающей среде. Центральное место в этих подходах является извлечение нуклеиновых кислот из образцов окружающей среды и последующее усиление генов-мишеней с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Первая стадия экстракции ДНК / РНК стремится лизировать клеточные стенки микробного сообщества, удалите нежелательные не являющиеся нуклеиновых кислот молекулы (например, органические и неорганические вещества) и сохраняют ДНК / РНК в растворе для дальнейшего анализа вниз по течению. Среди нескольких вариантов , имеющихся в литературе 2,3,4,5, в том числе целый ряд коммерческих наборов экстракции, метод Гриффитс 6 широко используется 7,8,9. Он является экономически эффективным и раrticularly хорошо подходит для отложений, как он использует шаг шарик бьющие лизировать клетки, и включает в себя шаги, чтобы свести к минимуму взаимодействие экстракции ингибиторов ПЦР, таких как гуминовые кислоты, в то время как одновременно восстанавливается ДНК и РНК.
На втором этапе используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации генов-мишеней, таких как таксономического маркера 16S рРНК, из извлеченных нуклеиновых кислот. Такой подход имеет и продолжает содействовать исследованию неохарактеризованной микробного черного ящика 10,11. Тем не менее, конечной точки ПЦР методы , основанные страдают от различных ограничений , которые может оказывать влияние на характеристику микробных сообществ 12. Для того, чтобы точно определить их ген / транскриптов содержаний, ПЦР в реальном времени, также известный как количественной ПЦР (КПЦР) должен быть использован. КПЦР использует флуоресцентные системы репортерного красителя, которые позволяют отслеживать накопление ампликона после каждого цикла ПЦР. Это имеет большое значение, поскольку это означает, что количественное определение может происходить во время ранней фазы экспоненциального, ачем конечной точки, фазы ПЦР-реакции, когда выход ампликонов по-прежнему прямо пропорциональна начальной обилию гена-мишени.
Обычно используются две системы репортер: интеркалирования пятно нуклеиновой кислоты , 13 и 5 '3' экзонуклеазной активности ДНК - полимеразы 14. Поскольку прежняя система репортер связывает indistinctively всем двухцепочечной ДНК, это может привести к завышению целевой последовательности в случае возникновения нежелательных неспецифических ампликонов или праймера димеры по продукции. Для того чтобы обойти это ограничение, может потребоваться обширная оптимизация усиления. В последней системе шаблон амплификации отслеживается с использованием комбинации 5 'нуклеазной активности Taq - полимеразы , которая расщепляет флуорофором с внутреннего зондом. Эта особенность повышает специфичность анализа за счет использования флюорогенного зонда, который связывается только с комплементарной целевой конкретных sequencе между парой праймеров. С тенистом Количественное достигается путем определения пункта пересечения (Cp) где накопление ПЦР-ампликонов, как измерено увеличению флуоресценции, что значительно выше фоновой флуоресценции.
КПЦР широко используется в микробной экологии для определения генов содержаний в различных средах 15. Кроме того, обратной транскрипции РНК в кДНК сочетается с кПЦР и RT-КПЦР для количественного определения экспрессии гена. Таким образом, КПЦР и RT-КПЦР представляют собой быстрые, эффективные методы для количественного определения числа генов и / или транскриптов в пробах окружающей среды.
Микроорганизмы в прибрежных отложениях привода различных процессов экосистем, в том числе минерализации органического вещества, деградации загрязняющих веществ и биогеохимического круговорота макроэлементов , таких как 16,17,18 азота. Исчерпывающий понимание этих преобразований требует комплексного accounт способствующих микробных популяций, включая количественные данные о генных и транскриптов содержаний. Здесь мы вводим ряд тщательно проверенных, упорядоченных и стандартизированных протоколов для количественного определения бактериальных генов и транскриптов содержаний 16S рРНК в прибрежных отложениях. Протокол описывает сбор образцов, одновременно ДНК и экстракции РНК, ДНК-препараты без РНК, проверка качества добываемых нуклеиновых кислот, образование 16S рРНК-ДНК и стандартов -РНК и количественной оценки проб окружающей среды. Количественные данные, полученные из методов, описанных здесь необходимы, чтобы пролить свет на микробные сообщества вождения прибрежных экосистем.
Protocol
1. ДНК и РНК Извлечение из морских прибрежных донных отложениях
- Получение рибонуклеазы (РНКазы) -Free материала и рабочее пространство
- Подготовьте РНКазы дистиллированную воду (Dh 2 O) путем обработки 0,1% диэтилпирокарбоната (DEPC) и инкубировать при 37 ° CO / N. Удалите остатки DEPC автоклавированием дН 2 O при температуре 121 ° С в течение 15 мин. Использование DEPC лечение дН 2 O , чтобы все решения.
- Запекать все изделия из стекла при 180 ° CO / N. Удалите пластиковые крышки и обода, замочить их в растворе 2 М NaOH O / N, и промойте их с DEPC обработанной дН 2 O перед использованием.
- Подготовить СТАВ-фосфатный буферный раствор в соответствии с таблицей 1.
- Приготовьте раствор осаждения PEG-NaCl согласно Таблице 2.
- Очистите все рабочие поверхности (т.е., скамейка, микроцентрифужных, вытяжного шкафа) и микропипетки с использованием РНКазы-обеззараживании решение перед началом работы . Надевайте перчатки во время всей процедуры. Используйте РНКазы из пластмассы наряду с советами микропипетка фильтра, чтобы избежать образца перекрестного загрязнения.
- Сбор проб окружающей среды и хранение
- Собрать прибрежные отложения во время отлива, используя стерильный 50 мл трубки сокола из верхних 2,5 см. Собрать примерно 15-20 г осадков. Осторожно закройте крышку после взятия пробы. Транспорт сразу в лабораторию в холодильнике при температуре 4 ° С для немедленной обработки.
- Однородный образец путем смешивания со стерильным шпателем и аликвоты 0,5 г сырого веса осадка в 2 мл шарик бьющегося трубки. Алиготе дополнительные дублирующие, флэш-замораживания путем размещения в жидком азоте. Хранить аликвот при -80 ° С. Внимание: Надевать защитные перчатки и защитные очки при работе с жидким азотом.
Примечание: Если сайт поле не находится близко к лаборатории, аликвоты 0,5 г осадка в 2 мл стерильной микропробирок на участке поля. Флэш-замерзают трубы, помещая их немедленно в LiQuid азота и транспортировки в лабораторию. Образцы хранить при температуре -80 ° С до обработки.
- Co-экстракция ДНК и РНК из осадка
Примечание: Следующий протокол представляет собой модифицированный вариант метода Griffiths 6.- Добавить 500 мкл СТАВ-фосфатного буфера и 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) в 2 мл лизирующего шарик-пробирку, содержащую 0,5 г осадка и Переверните пробирку 5-10 раз для гомогенизации образца.
Внимание: Выполните этот шаг в вытяжном капота носить соответствующую защитную одежду (например, лабораторный халат, перчатки и защитные очки) во все времена. - Vortex на полной скорости в течение 2,5 мин. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- В вытяжном колпаком извлечь верхний водный слой и переносят в новый 1,5 мл стерильной микроцентрифужных трубки. Хранение образцов на льду, добавляют 500 мкл охлажденного на льду смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24: 1).
- Инверсия несколько раз, пока эмульсия не visibле. Центрифуга в течение 10 мин при 16000 х г при 4 ° С.
- В вытяжном колпаком извлечь верхний водный слой и поместите его в новый 1,5 мл стерильной пробирке. Осадить нуклеиновые кислоты путем добавления двух объемов 30% -ного раствора NaCl ПЕГ и хорошо перемешать.
- Инкубируют на льду в течение 2 ч или оставить образцы при температуре 4 ° CO / N.
- В конце инкубации образцов центрифуге при 16,000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
Примечание: Гранула может быть виден в нижней части трубы. - Осторожно удалите супернатант с помощью микропипетки, убедитесь, чтобы не мешать гранул. Оставьте около 10 мкл раствора ПЭГ в пробирку и добавляют 1 мл охлажденного льдом 70% этанола.
- Центрифуга в течение 20 мин при 16000 х г при 4 ° С. Медленно удаления этанола с микропипетка, стараясь не прикасаться к гранулу.
- Центрифуга в течение 5 секунд и удаления остатков этанола с помощью микропипетки. Оставьте осадок высохнуть на воздухе в течение приблизительно 5 мин.
- Повторное приостановить осадок в 50 мкл DEPC обработанныхH 2 O. Изучить качество и выход ДНК / РНК с помощью электрофореза в агарозном геле с управлением по 5 мкл на агарозном геле 1% 19. Разделите нуклеиновых кислот в две аликвоты 15 мкл для ДНК и 30 мкл для РНК.
- Хранить ДНК при температуре -80 ° С до тех пор, пока это необходимо. Изолировать РНК, как описано в следующем разделе.
- Добавить 500 мкл СТАВ-фосфатного буфера и 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) в 2 мл лизирующего шарик-пробирку, содержащую 0,5 г осадка и Переверните пробирку 5-10 раз для гомогенизации образца.
2. Получение РНК и проверка качества ДНК-РНК бесплатно
- Переваривание ДНК
- Добавить 3 мкл ДНКазы I буфера и 1,5 мкл ДНКазы I 30 мкл объем нуклеиновых кислот, инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
- Смешать реагент ДНКазы Инактивация встряхиванием в течение 30 сек. Добавить 4,8 мкл раствора к образцу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин, время от времени нажмите на нижнюю часть трубы, чтобы перемешать раствор.
- Центрифуга при 10000 мкг в течение 90 сек при комнатной температуре, передавать супернатант (РНК) в новую пробирку, следя за тем, чтобы не переносить осадок, который может ингибировать вниз по течению реакции.
- контроль качества РНК
- Добавьте 2 мкл РНК в 18 мкл стерильной РНКазы дН 2 O для разбавления в соотношении 1:10.
- В отдельных ПЦР-реакций, добавить 1 мкл в чистом виде или разведении 1:10 РНК в стерильный 0,5 мл ПЦР-пробирку. Добавление компонентов реакции ПЦР для амплификации гена 16S рРНК в соответствии с таблицей 3. Включите "позитивный" (например., ДНК , извлеченной из чистой бактериальной культуры), а "ингибитор ПЦР" контроль (т.е. 1 мкл положительной ДНК чистой культуры и 1 мкл аккуратным извлеченном РНК) и "отрицательный" контроль стерильной РНКазы дН 2 O.
- Установите Термоциклер со следующими параметрами Усиление: 95 ° C 5 мин, (95 ° С 30 сек, 57 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин) х 35 циклов, 72 ° С 10 мин.
- Выполнить 10% продукта ПЦР на 1% агарозном геле при 85 В в течение 40 мин. Повторить лечение ДНКазы I, если ПЦР-продукт образуется в окружающей среде RNА образцы.
- Добавьте 2 мкл РНК в 18 мкл стерильной РНКазы дН 2 O для разбавления в соотношении 1:10.
3. Генерация первой цепи кДНК из РНК
- Добавьте реагенты в соответствии с таблицей 4 к РНКазы / ДНКазы 0,2 мл ПЦР трубки.
- Инкубируйте образца при температуре 65 ° С в 5 мин. Место на льду в течение по крайней мере 1 мин, а затем инкубируют при 25 ° С в течение 10 мин.
- К той же трубке добавляют реагенты , перечисленные в таблице 5.
- Инкубируйте образца при температуре 55 ° С в течение 50 мин. Инактивировать реакции при 72 ° С в течение 10 мин.
- кДНК Хранить при -20 ° С до использования.
4. Количественная ПЦР
- Формирование стандартов ДНК для кПЦР
- Amplify бактериальную последовательность 16S рРНК 20 (или любой другой последовательности интереса) из геномной ДНК , выделенной из чистой культуры с Q-ПЦР - праймеров (1369F и 1492R 21).
- Очищают продукт ПЦР с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Клон очищенного ПЦРПродукт в 3'-T свеса клонирующий вектор системы в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Преобразовать вектор , содержащий PCR вставки в кишечной палочки JM109 компетентных клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Пластина 50 мкл трансформации на ампициллин (100 мкг / мл), Х-Gal (20 мкг / мл) и IPTG (0,5 мМ) Лурии Бертани чашки с агаром (Триптон 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л, NaCl 10 г / л, Агар 15 г / л). Выдержите O / N при 37 ° С.
- Выберите один положительный белый трансформанта от пластины. Инокуляции положительное трансформанта в 50 мл LB-бульона, содержащего 100 мкг / мл ампициллина и инкубировать O / N качалке при 250 оборотах в минуту при 37 ° С.
- Из O / N культуры, выделения и очистки плазмиды с использованием коммерческого набора в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Линеаризации плазмиды с помощью соответствующего фермента рестрикции, способный резать плазмиды один раз (например, EcoRI).
- Определить концентрацию плазмидной ДНК по оптической плотности при 260 нм с использованием спектрофотометра 19.
Примечание: В качестве альтернативы, точность количественной оценки может быть улучшена путем использования флуоресцентного красителя ДНК-связывающим, используемой в сочетании с флуорометре. - Последовательность вставки плазмиды, чтобы подтвердить размер мишени в базах. Подсчитайте количество (т.е. процент) вставки ДНК в плазмиды (например, в векторе 3000 п.о., фрагмент ДНК длиной 123 пар оснований составляет 3,9% от общей ДНК) и умножить его концентрации , полученной в 4.1.10, чтобы определить концентрация ДНК мишени (вставка).
- Используйте следующее уравнение для расчета копий мишени на мкл:
нагрузка / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Вычисления целевого молекулярная масса (TMW) путем умножения количества пар оснований ДНК-мишени с помощью средней молекулярной массой двойной цепи ДНК (дцДНК, 660 Дальтон за пару оснований).
- Развести ДНК - мишени в диапазоне от 10 10 до 10 2 копий с помощью 2 мкл ДНК и 18 мкл стерильной дН 2 O. Смешайте каждого разведения хорошо и со спином вниз кратко, прежде чем сделать следующий разведение.
- Генерация стандартной кривой РНК для КПЦР
- На шаге 4.1.5, экран ряд белых колоний (приблизительно 5) ПЦР колоний 19 с использованием обратного праймера мишени (т.е. R1492) и прямой вектор плазмиды праймера M13F.
Примечание: Эта комбинация праймеров будет амплифицировать вставок клонированные в правильной смысловой ориентации с промотором Т7 сайт вверх по течению. - Очищают продукт ПЦР с использованием коммерческого набора следующей инструкцией изготовителя. Количественно очищенный PCR рRoduct при 260 нм с использованием спектрофотометра.
- Добавить 200 нг ПЦР - продукта в конечном объеме 20 мкл с 7,5 мМ каждого из рибонуклеотид, реакционного буфера 1 Т7 и 1 Т7 полимеразой для экстракорпорального реакции транскрипции в.
- Инкубируют реакционную смесь в течение 4 ч при 37 ° С. Добавить 1 единица РНКазы ДНКазы I по отношению к реакции, инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С для удаления ДНК-матрицы.
- Восстановление транскрибированная РНК в пробирке путем осаждения этанолом 19 и количественной оценки урожайности РНК с использованием флуориметра или по оптической плотности при длине волны 260 нм.
- Подсчитайте количество транскриптов на мкл РНК. Добавьте число пар оснований в РНК - мишени (например, 123 оснований) к длине промотора Т7 (153 оснований) и умножить на среднюю молекулярную массу РНК, 340 дальтон на основании.
- Добавить 500 нг РНК-мишени квантифицированного к реакции обратной транскриптазы (RT), как описано в разделе 3. Серийно разбавить кДНК, как описано в 4.1.13 для использованияв качестве стандартной кривой.
- На шаге 4.1.5, экран ряд белых колоний (приблизительно 5) ПЦР колоний 19 с использованием обратного праймера мишени (т.е. R1492) и прямой вектор плазмиды праймера M13F.
- ПЦР в реальном времени
- Оттепель окружающей среды ДНК / кДНК образцы, стандарты и КПЦР реагенты на льду. Защита флуорогенный зонда от света.
- Развести стандарты для стандартной кривой, как указано в 4.1.14. Сделать 1:10 разведений экологической ДНК / кДНК из аккуратным до 10 -3 путем добавления 2 мкл образца до 18 мкл стерильной дН 2 O.
- Делают реакции мастер смесь для общего количества реакций плюс 10% согласно таблице 6 (праймеры и зонд) и таблице 7 (Реакционная смесь). Хорошо перемешать и кратко центрифуге.
- Добавьте 19 мкл основной смеси и 1 мкл матрицы (стандартные, проб окружающей среды или воды для отрицательного контроля) в каждую лунку в 96-луночного оптической пластины КПЦР. Выполнение каждой реакции (стандарты, отбор проб окружающей среды и отрицательного контроля) в трех экземплярах.
- Накройте 96-луночный планшет с Рассеиватель Q-PCR. Центрифуга пластину на короткое время. Загрузитепластины в нагревательный блок машины КПЦР и закройте крышку.
- Откройте менеджер программного обеспечения КПЦР. Нажмите на вкладку "Протокол", нажмите кнопку "создать новый", добавьте следующие условия амплификации: 3 мин при 95 ° С, (10 сек 95 ° C, 30 сек 60 ° C) х 40 циклов. Установить объем образца 20 мкл, нажмите кнопку "OK" и сохраните протокол.
- Перейдите на вкладку "Plate". В разделе "Редактирование выбранных" нажмите кнопку "выберите флуорофор", добавьте краситель отчета для соответствующего зонда, например, флуоресцеина. Нажмите кнопку "OK".
- Выделите лунки, содержащие стандарты, выберите "стандарт" из меню "типа образца". Нажмите кнопку "повторить серию" изменить "реплицировать размер" до 3, нажмите кнопку "Применить". Нажмите кнопку "разбавления серии", чтобы добавить расчетную начальную концентрацию для стандарта 1, указывают на коэффициент разбавления (10), выберите "убывающий" или "увеличение" в зависимости от того, была добавлена стандартная криваяк пластине. Нажмите кнопку "Применить".
- Выделите также позиции, содержащие неизвестные образцы, выберите "неизвестный" из "типа образца" в раскрывающемся меню. Нажмите кнопку "повторить серию", а также изменить "реплицировать размер" до 3. Нажмите кнопку "Применить". Редактирование образцов имен под названием "образец". Повторите процедуру для шаблона не контролирует (NTC) скважин.
- Нажмите кнопку "OK" на редактора окне пластинчатой и сохраните файл. Нажмите кнопку "Пуск Выполнить".
- По окончании прогона, окно анализа данных откроется. Нажмите на вкладку "квантификации" для отображения стандартной кривой, стандартная кривая дескрипторы (таблица 8) и амплификации участков.
- Нажмите на вкладку "Количественное данных" для значений Cp и соответствующее количество исходного гена (SQ) неизвестных образцов. Экспорт таблицы в таблицу программного обеспечения в случае необходимости.
- Умножить ген содержаний от неизвестных образцов на коэффициент разбавления, количество осадка ExtracTed от и общего объема, нуклеиновые кислоты элюировали в получение копий гена на грамм сырого веса осадка.
Примечание: элюирования ДНК из 0,5 г осадка в 50 мкл, разбавленные 1/10, добавить 1 мкл в качестве матрицы в реакции ПЦР-Q; расчета копий гена г -1 осадка путем умножения: копий гена мкл ДНК х разведения объема фактор х элюирования х 2.
Representative Results
Извлечение хорошего качества ДНК и РНК из отложений является первым шагом в количественной оценке генов и транскриптов содержаний. Успешное выходы экстракции четкие ДНК и РНК полосы , как показано на рисунке 1 для образца AC, где резкие полосы 23S и 16S рРНК видны в дополнение к высокой весовой геномной группы молекулярной ДНК.
Рисунок 1. ДНК / РНК экстракции. Типичные результаты экстракции ДНК / РНК из трех экземплярах (ABC) 0,5 г прибрежные отложения. 5 мкл ДНК / РНК подвергали электрофорезу на 1,4% агарозном геле в 85 В в течение 40 мин. Был использован молекулярный маркер в диапазоне 10,037-200 пар оснований . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Протокол реакция КПЦР очерчено ориентации 16S рРНК ДНК. Для 16S рРНК транскрипты заменить стандартный кубRVE и шаблон с кДНК. Поскольку неизвестные образцы количественно против стандартной кривой, необходимо , чтобы гарантировать , что стандартная кривая хорошего качества. На рисунке 2 показано получение (а), стандартные кривые и их разбавленные окружающей среды ДНК, (B), усиление стандартной кривой и отбор проб окружающей среды (с) превращение стандартной кривой к линейной регрессии и расчета чисел копий гена. Когда 10-кратное разбавление правильно подготовлен и усиливается разность между 3,3 цикла каждого стандартного разведения видно (это занимает 3,3 циклов в течение десяти-кратное увеличение в шаблоне при 100% эффективности амплификации) (Рисунок 2BI). Стандартные кривые дескрипторы, включая значения по R 2 0,99 и эффективности ПЦР в диапазоне от 90 до 110% (фиг.2с) желательны. Важно сообщить значения Cp из без контроля шаблона (NTC), если присутствует. В этом случае СР обрезания для стандартов и неизвестных образцов 3.3 циклов (<EM> то есть бревно раза) выше , чем значение Кц ПНС наложено 20 (рис 2Cii). Неизвестный шаблон извлекается из осадка ДНК количественно с аккуратным, 10 -1, 10 -2 и 10 -3 разведений (B). Аккуратный образец не усиливать, значения Cp от 10 -1 до 10 -3 разведений были 24.12, 26.02 и 28.40 соответственно. NTC Cp был 30,5, был наложено НКГ обрезания 27,2. Преобразование гена содержаний в г -1 сырого веса осадка приводит к 2,5 х 10 7 и 7,1 х 10 7 для 10 -1 и 10 -2 соответственно для диапазона разбавления. 10 -3 разбавления Cp был ниже среза NTC, и поэтому не используется. В этом случае 10 -2 был выбран в качестве оптимального шаблона разбавления.
Рисунок 2. 16S рРНК гена QPCR усиление стандартов и экологической ДНК , извлеченные из прибрежных отложений. Получение (A) I) стандартной ДНК - кривой и II) разбавление окружающей среды ДНК для амплификации КПЦР, (B) КПЦР амплификация I) стандартной ДНК - кривой и II) проб окружающей среды, Cp для каждого образца показаны. (С) я) линейной регрессии стандартной кривой со стандартной кривой дескрипторами; б) вычисление гена содержаний из проб окружающей среды. NTC:. Отрицательный контроль Шаблон Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| реактив | Количество |
| СТАВ | 5 г |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 г |
| KH 2 PO 4 | 0,1 г |
| NaCl | 2,05 г |
| дН 2 O | до 100 мл |
Таблица 1. Приготовление СТАВ-фосфатного буфера.
| реактив | Количество |
| ПЭГ 6000 | 30 г |
| NaCl | 9,35 г |
| дН 2 O | до 100 мл |
| Примечание: добавление ПЭГ 6000 медленно при умеренном нагревании и перемешивании в 50 мл дН 2 O. | |
Таблица 2. Приготовление раствора осаждения ПЭГ-NaCl.
| реактив | Количество |
| Неразведенный РНК / РНК разводили 1:10 | 1,0 мкл |
| 10x ПЦР буфер | 5,0 мкл |
| дНТФ 10 мМ | 1,0 мкл |
| 63F прямого праймера | 1,0 мкл |
| CAG GCC ТАА CAC ATG CAA GTC | |
| 518R обратного праймера | 1,0 мкл |
| ATT ACC GCG GCT GCT Г.Г. | |
| Taq полимеразы | 0,4 мкл |
| РНКазы дН 2 O | 40,6 мкл |
Таблица 3. ДНК-РНК свободный качество мастер проверки ПЦР смесь.
| реактив | Количество |
| РНК | 0,5-5 мкг |
| дНТФ 10 мМ | 1 мкл |
| Обратный праймер 10 мкМ / Random гексамерах 50 мкМ | 1 мкл |
| ДЭФЦ-H 2 O | До 13 мкл |
Таблица 4. кДНК реакции синтеза смеси А.
| реактив | Количество |
| Буфер 5x | 4 мкл |
| DTT | 1 мкл |
| РНКазы Ингибитор | 1 мкл |
| обратной транскриптазы | 1 мкл |
Таблица 5. кДНК реакции синтеза смеси B.
| цель | Грунтовка имя | Последовательность | Отжиг Т (° С) | Справка |
| 16S рРНК бактерии | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT CGG TCY | 56 | Suzuki и др. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC СТТ GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (зонд) | СТТ GTA CAC ACC НКУ ВКТ C |
| реактив | Количество |
| 2x Master Mix | 10 мкл |
| Прямой праймер (10 мкМ) | 0,8 мкл |
| Обратный праймер (10 мкМ) | 0,8 мкл |
| Зонд (10 мкМ) | 0,4 мкл |
| вода | 7,0 мкл |
| Конечный объем | 19 мкл |
Таблица 7. В реальном масштабе времени реакции ПЦР смесь.
| дескриптор | Значение |
| Коэффициент корреляции (R 2) | Мера линейности стандартной кривой. В идеале это должно быть R 2 = 1. Значение R 2 = 0.98-0.99 являются приемлемыми. |
| Склон (α) | Мерой эффективности реакции. В идеале это должно быть эквивалентно -3.32. Значение в диапазоне между -3.58 и -3.1. |
| Эффективность (= 10 (-1 / наклон) -1) | Если это 100%, шаблоны удваивается после каждого термического цикла во время экспоненциальной амплификации. Хороший диапазон КПД составляет от 90 до 110%. |
| Y Intercept (β) | Теоретический предел обнаружения реакции. Хотя это и не используется для количественной оценки чувствительности реакции, важно при сравнении различных стандартных кривых и той же цели. |
Таблица 8. QPCРеакционные дескрипторы R.
Discussion
Сочетание экстракции ДНК / РНК с кПЦР обеспечивает быстрый, точный относительно экономически эффективный метод для чувствительного количественного гена и транскриптов содержаний из ряда проб окружающей среды, таких как прибрежные отложения.
Первоначальной экстракции нуклеиновой кислоты является важным шагом , чтобы обеспечить репрезентативное представление о микробного сообщества настоящее время достигается 22. Ряд ограничений необходимо учитывать для протокола экстракции: а) достижение полного лизиса клеток, б) совместное извлечение ингибирующих соединений (например, гуминовых кислот или полифенолов), с) загрязняющей ДНК в РНК фракции, d) быстрое разложение выделенных нуклеиновых кислот при хранении. Должны быть приняты меры для того, чтобы обойти эти ограничения. Например, особое внимание должно быть принято , чтобы гарантировать , что извлечение нуклеиновых кислот оптимизирована для данного типа образца (например, осадки, почвы, сточных вод и т.д.). Значительное улучшение урожайности нуклеиновых кислот и качества как ДНК и РНК , может быть достигнуто путем проведения предварительных экспериментов 23. Для того, чтобы свести к минимуму влияние ингибирующих соединений на 24 приложений на основе ПЦР, тестирование ряда разведений из извлеченной ДНК и РНК. Чтобы обойти быстрой деградации извлеченной ДНК / РНК из нескольких циклов замораживания-оттаивания и избежать возможной потери генетической информации, хранить несколько небольших аликвот объема при температуре -80 ° C.
Когда тщательно разработан, КПЦР является надежной, хорошо воспроизводимым и чувствительным методом. Следует отметить, что методы амплификации и стандартного построения кривой , описанные в данном протоколе могут быть адаптированы для любого гена - мишени , представляющей интерес, в том числе других филогенетических маркеров (т.е. архейных 16S рРНК, грибковые 18S рРНК) или генов , участвующих в важных функций в окружающей среде. Известные ограничения в использовании кПЦР являются: а) генерирование воспроизводимым высокого качества сtandard кривая для абсолютной количественной оценки, б) выбор праймеров / зондов и оптимизация условий анализа Q-ПЦР, с) использование низкого качества / срезанные нуклеиновых кислот, д) выбор рабочего разведения ДНК / РНК, чтобы избежать ингибирования , Кроме того, необходимо учитывать, что метод КПЦР обеспечивает ген / транскриптов содержаний, которые не могут приравнять к Цитоз: это особенно тот случай, когда гены 16S и 18S рРНК ориентированы, как и микроорганизмы имеют разные числа копий гена рибосомного в их геноме 25.
Плохое качество стандартных кривых приведет к неточной квантификации представляющего интерес гена. Это хорошая практика, чтобы сохранить запас высоких стандартов концентрации в виде небольших аликвот, из которых могут быть сделаны свежие стандартные кривые. Не хранить стандартные кривые, всегда делают свежие разведений из запаса самой высокой концентрации каждый раз. Для точной количественной оценки проб окружающей среды обеспечивают диапазон концентраций СтанКривая дарт охватывает ожидаемые значения Компартия неизвестных образцов. При количественной оценке транскриптов, построить стандартную кривую из РНК не двухцепочечной ДНК. Когда это возможно, количественное определение образцов следует сравнивать непосредственно должны быть завершены в течение одного анализа , чтобы избежать изменения между анализами 20. Это не всегда возможно. Поэтому для сравнения содержаний гена, сгенерированные между анализами, желательно иметь случайное подмножество выборок тиражируемых между анализами. Широкий выбор праймеров и зондов наборов в настоящее время доступны для КПЦР ориентации микробной таксонов и функциональные группы 15. Особое внимание требуется при выборе их для обеспечения как максимальный охват и специфичность для целевой группы. Если эффективность реакция анализа КПЦР не является удовлетворительным, поиск и устранение неисправностей начинается с тестирования различных температурных условий езды на велосипеде (как время отжига и / или температуры) и / или условий реакции, например, различные концентрации праймера-зонда. Ость Анализируемые и условия реакции Q-PCR оптимизированы, всегда проводит первоначальную проверку диапазона ДНК / кДНК разведений для определения соответствующей концентрации матрицы. Выберите диапазон разбавления, что приводит к самым высоким числом копий в качестве оптимального шаблона для дальнейшего разбавления анализов.
В настоящее время технологии секвенирования следующего поколения эффективно пролить свет на структуру микробного сообщества и функций во множестве сред 26,27,28. Тем не менее, эти наборы данных часто основаны на конечной точке ПЦР библиотеки ампликоне и, следовательно, обеспечивают только полу-количественные оценки обилия конкретного таксона. Следовательно, способность в реальном масштабе времени методики ПЦР-предназначаться для определенных таксономических маркеров (от более высокого домена до уровня штамма), обеспечивает эффективную проверку результатов, полученных с помощью следующего поколения последовательности. Кроме того, КПЦР был успешно использован в сочетании с другими молекулярными методами микробной экологии, такие как стабильный ISOпьянствовать зондирования (SIP) или филогенетические / функциональных микрочипов. В сочетании с бывшим инструментом, КПЦР может быть использован для количественного определения метаболически активного сообщества 29,30. В сочетании с анализом микрочипов, КПЦР предоставляет ключевую количественную интерпретацию филогенетических маркеров на основе и функционального гена обследований среды 31,32.
Поэтому, независимо от того используется отдельно или в сочетании с другими (часто основанных на процессах) оценки функционирования экосистем, количественный ПЦР является важным инструментом для микробных экологами в исследовании неуловимого связи между микробных сообществ и функций экосистем.
Acknowledgments
Эта публикация исходит из исследования, проведенного при финансовой поддержке Научного совета природной среды (НКРЭ) под номером гранта НКРЕ NE / JO11959 / 1 и научного фонда Ирландии и Мари-Кюри COFUND действий в рамках гранта № 11 / Sirg / B2159awarded к CJS и Восточно-академическим исследовательским консорциумом (ARC Eastern).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S.
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
