Abstract
Ayrıca kantitatif PCR (q-PCR) olarak bilinen Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu çevre örneklerinde taksonomik ve fonksiyonel grupların gen bolluklarını ölçmek için mikrobiyal ekoloji yaygın olarak kullanılan bir araçtır. bir ters transkriptaz reaksiyonu (RT-Q-PCR) ile kombinasyon halinde kullanıldığında, aynı zamanda gen transkript ölçmek için kullanılabilir. Q-PCR reaksiyonunun üstel aşamasında PCR amplikonlarının kantifikasyonuna izin veren son derece hassas flüoresan tespit kimyaları kullanır. Bu nedenle, PCR reaksiyonunun plato fazında tespit 'son nokta' PCR ile ilişkili önyargı kaçınılır. Bir protokol PCR sağlanan gerçek zamanlı yoluyla kıyı çökelleri bakteriyel 16S rRNA genleri ve transkript ölçmek için. İlk önce, DNA içermeyen RNA hazırlanması için gerekli olan ek adımları da dahil olmak üzere, kıyı sediment, DNA ve RNA eş çıkarılması için bir yöntem olup, özetlenmiştir. İkincisi, 16S rRNA genleri ve tr ölçümü için bir adım-adım kılavuzQ-PCR ve RT-Q-PCR yoluyla ekstre nükleik asitlerden anscripts özetlenmiştir. Bu DNA ve RNA standart eğri yapımı için ayrıntıları içerir. mikrobiyal ekoloji RT-Q-PCR deneyleri kullanımı için önemli hususlar dahil edilmiştir.
Introduction
Mikroorganizmalar biyosfer sürüş ekosistem işlevi köşe taşı vardır. Mikroorganizmaların çoğu 1 uncultured kalır. Bu nedenle moleküler temelli yaklaşımlar ortamında mikroorganizmaların çeşitliliği ve işlevi anlayışımızı ilerletmek için temeldir. Bu yaklaşımlara merkezi çevresel numune nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak, hedef genlerin daha sonra amplifikasyon.
DNA / RNA ekstraksiyonu ilk aşaması, mikrobik topluluk mevcut hücre duvarlarını lize arzu edilmeyen olmayan nükleik asit molekülleri (örn, bir organik ve inorganik maddeler) kaldırmak ve daha fazla alt analiz için çözelti içinde, DNA / RNA korumak amaçlamaktadır. Ticari çıkarma kitleri bir dizi de dahil olmak üzere literatürde 2,3,4,5 mevcut çeşitli seçenekler, arasında, Griffiths yöntemi 6 yaygın 7,8,9 kullanılır. Bu maliyet-etkin ve pabu hücrelerin lize bir boncuk yenerek adımı kullanan ve aynı zamanda DNA ve RNA kurtarma iken, böyle hümik asitler PCR inhibitörleri, co-çıkarma aza indirmek için gerekli adımları içermektedir olarak rticularly de sedimanlar için uygundur.
İkinci adım, ekstre nükleik asitlerden, örneğin, 16S rRNA taksonomik markör hedef genleri amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılmaktadır. Bu yaklaşım vardır ve uncharacterized mikrobiyal kara kutu 10,11 keşif kolaylaştırmaya devam ediyor. Ancak, son nokta PCR tabanlı yöntemler çeşitli sınırlamalara muzdarip olabilir önyargı mikrobiyal toplulukların 12 karakterizasyonu. doğru gen / transkript bolluklarını ölçmek için, aynı zamanda niceliksel PCR (qPCR) olarak bilinen gerçek-zamanlı PCR, kullanılmalıdır. qPCR PCR her döngüsünden sonra amplikon birikimini izlemek floresan raportör boya sistemleri patlatır. Bu miktar çok erken üslü fazda oluşabilir aracı olarak anlamlıdıramplikon de hedef genin başlangıç bolluğu ile doğru orantılıdır son nokta, PCR reaksiyonunun faz, daha.
İki raportör sistemler yaygın olarak kullanılmaktadır: Bir araya eklenen nükleik asit lekesi 13 ve DNA polimerazı 14 5 'den 3' ekzonükleaz aktivitesi. Eski raportör sistemi bütün çift-şeritli DNA'ya indistinctivelyi bağlandığından, istenmeyen, spesifik olmayan amplikonlar veya ürünler ile astar dimerler meydana gelmesi halinde, bu hedef dizinin fazla tahmin edilmesine yol açabilir. Bu önüne geçmek için, amplifikasyon kapsamlı optimizasyon gerekli olabilir. Daha sonraki bir sistemde, şablon amplifikasyonu bölen bir iç probtan bir flüorofor Taq polimeraz, 5 'nükleaz aktivitesi bir kombinasyonu kullanılarak izlenir. Bu özellik sayesinde, tamamlayıcı hedef spesifik sequenc sadece bağlanan bir florojenik prob kullanımına tahlilinin özgüllüğü artırırprimer çifti arasında e. her iki kimya ile miktar floresansta bir artış ile ölçüldüğü üzere PCR amplikonlarının birikimi önemli ölçüde eşiğe üzerinde geçme noktası (Cp) saptanmasıyla elde edilmektedir.
qPCR yoğun farklı ortamlarda 15 gen bolluklarını belirlemek için mikrobiyal ekoloji kullanılmıştır. Ayrıca, cDNA'ya RNA'nın ters transkripsiyon gen ekspresyonunu ölçmek için qPCR RT-qPCR ile birleştirilir. Bu nedenle, qPCR RT-qPCR çevresel numuneler içindeki gen ve / veya transkript numaralarının ölçümü için hızlı, etkili yöntemler temsil etmektedir.
Kıyı sedimanlarda Mikroorganizmalar organik madde mineralizasyonu, kirleticilerin bozulması ve azot 16,17,18 olarak macronutrients biyojeokimyasal bisiklet dahil olmak üzere çeşitli ekosistem süreçleri, sürücü. Bu dönüşümlerin ayrıntılı bir anlayış kapsamlı bir Accoun gerektirirGen ve transkript miktarlara nicel veriler dahil olmak üzere katkıda bulunan mikrobiyal nüfus, t. Burada kıyı çökelleri bakteriyel 16S rRNA geni ve transkript bolluk ölçümü için iyice test, akıcı ve standart bir dizi protokol tanıtmak. protokol, örnek toplama, eş zamanlı DNA ve RNA ekstraksiyonu, DNA-RNA serbest hazırlık, çıkarılan nükleik asitlerin kalite kontrolü, 16S rRNA-DNA ve -RNA standartları ve çevre örneklerinin miktarının nesil özetliyor. Burada anlatılan yöntemlerle elde edilen nicel veriler kıyı ekosistemlerinin sürüş mikrobiyal topluluklar üzerindeki ışık tutacak ihtiyaç vardır.
Protocol
Deniz Kıyı tortulları 1. DNA RNA Ekstraksiyon
- ribonükleaz (RNaz) içermeyen malzeme ve çalışma alanının hazırlanması
- % 0.1 diethylpyrocarbonate (DEPC) ile muamele edilerek RNAse serbest distile su (dH 2 O) hazırlayın ve 37 ° CO / N inkübe. 15 dakika boyunca 121 ° C 'de DH 2 O otoklav kalıntı DEPC çıkarın. Kullanım DEPC tüm çözümler yapmak için dH 2 O tedavi.
- 180 ° CO / N tüm cam pişirin. Plastik kapak ve jantlar bulunan 2 M NaOH O / N çözeltisi içinde ıslatın ve kullanımdan önce DH 2 O tedavi DEPC ile yıkayın.
- Tablo 1'de göre CTAB-Fosfat tampon çözeltisi hazırlayın.
- Tablo 2'deki gibi PEG-NaCl yağış çözüm hazırlayın.
- Tüm çalışma yüzeyleri (yani, tezgah, mikrosantrifüj, dumanı-luk) ve başlamadan önce çözüm RNAse dekontaminasyon kullanarak mikropipetler temizleyin. Tüm işlem sırasında eldiven giyin. örnek çapraz bulaşmayı önlemek için mikropipet filtre ipuçlarıyla birlikte RNAse ücretsiz plasticware kullanın.
- Çevre numune toplama ve depolama
- Üst 2.5 cm bir steril 50 ml falcon tüp kullanarak düşük gelgit sırasında kıyı sediment toplayın. sedimanlar yaklaşık 15-20 g toplayın. Dikkatle örnek alınmasından sonra kapağını kapatın. anında işlem için 4 ° C'de bir soğutucu laboratuara hemen nakliye.
- 2 ml boncuk atan tüp içine steril bir spatula ve kısım ile ıslak ağırlık tortu 0.5 g karıştırılarak örnek homojenize. Kısım Ek çoğaltır, sıvı nitrojen içinde yerleştirilmesi ile flaş dondurma. -80 ° C'de saklayın alikotları. Dikkat: Sıvı azot dokunurken koruyucu eldiven ve koruyucu gözlük takın.
Not: Alan sitesi alanı yerinde 2 ml steril mikrosantrifüj tüpler içine bir laboratuvar, kısım sediment 0.5 g yakınında bulunan değilse. li içine hemen koyarak tüpleri flaş dondurmaklaboratuvara sterlin azot ve ulaşım. işleme kadar -80 ° C'de saklayın örnekleri.
- sediment DNA Eş Ekstraksiyon ve RNA
Not: Aşağıdaki protokol Griffiths yönteminin 6 değiştirilmiş bir versiyonu.- kloroform: 500 ul CTAB-fosfat tamponu ve 500 ul fenol ekleme izoamil alkol (25: 24: 1) ile tortu, 0.5 g ihtiva eden 2 mi Boncuk yokedici borusuna ve 5-10 kez ters örnek homojenleştirin.
Dikkat: Her zaman uygun koruyucu giysiler (yani, laboratuvar mont, eldiven ve koruyucu gözlük) giyen bir duman başlığı içinde bu adımı gerçekleştirin. - 2.5 dakika boyunca tam hızda girdap. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüjleyin.
- Bir duman başlığı içinde üst sulu tabaka ayıklamak ve yeni bir 1.5 ml steril mikrosantrifüj tüpüne transfer. buz soğukluğunda kloroform, 500 ul buz üzerinde saklandığı: izoamil alkol (24: 1).
- bir emülsiyon visib kadar birkaç kez ters çevirinle. 4 ° C'de 16,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
- Bir duman başlığı içinde üst sulu tabaka ayıklamak ve yeni bir 1.5 ml steril tüp içine koyun. % 30 PEG-NaCI çözeltisi iki hacim eklenerek nükleik asitleri çökelti ve iyice karıştırın.
- 2 saat süreyle buz üzerinde inkübe ya da 4 ° CO / H numuneler bırakın.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 16,000 x g'de santrifüj inkübasyon çalışma sonunda.
Not: pelet tüpün altındaki görülebilir. - Yavaşça bir mikropipet kullanarak süpernatant kaldırmak, pelet rahatsız etmemek için emin olun. tüp içinde PEG çözeltisi yaklaşık 10 ul boş ve buz soğukluğundaki% 70 etanol 1 ml.
- 4 ° C'de 16,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj. Yavaş yavaş bir mikropipet pelet dokunmamaya özen ile etanol çıkarın.
- 5 saniye boyunca santrifüj ve bir mikropipet kullanarak kalan etanol kaldırmak. yaklaşık olarak 5 dakika boyunca hava ile kuruması için pelet bırakın.
- Yeniden askıya 50 pelet ul DEPC tedaviH2O Bir% 1 agaroz jeli 19 5 ul çalışan agaroz jel elektroforezi ile kalite ve DNA / RNA verimi inceleyin. iki kısım, DNA 15 ul ve RNA 30 ul nükleik asitler bölün.
- kadar gerekli -80 ° C DNA saklayın. Bir sonraki bölümde özetlendiği gibi RNA izole.
- kloroform: 500 ul CTAB-fosfat tamponu ve 500 ul fenol ekleme izoamil alkol (25: 24: 1) ile tortu, 0.5 g ihtiva eden 2 mi Boncuk yokedici borusuna ve 5-10 kez ters örnek homojenleştirin.
DNA içermeyen RNA, RNA ve kalitesini kontrol 2. hazırlanması
- DNA'nın sindirimi
- I nükleik asitlerin 30 ul hacme, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe DNase I Tamponu 3 ul ve DNAaz 1.5 ul ekle.
- 30 sn için karıştırın DNAz inaktivasyon reaktif karıştırın. örnek çözeltinin 4.8 ul ekle. arada bir çözelti karıştırmak için tüplerin alt dokunun 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Oda sıcaklığında 90 sn için 10,000 x g'de santrifüjleyin alt reaksiyonları önleyebilen bir çökelti aktarmak için özen, yeni bir tüp içine süpernatant (RNA) aktarın.
- RNA kalite kontrolü
- 1:10 sulandırmak için steril RNAse ücretsiz dH 2 O 18 ul RNA 2 ul ekleyin.
- ayrı PCR reaksiyonlarında, steril 0.5 ml'lik PCR tüpü RNA saf ya da 1:10 seyreltme 1 ul ekle. . Tablo 3 uyarınca 16S rRNA geni amplifiye etmek için PCR reaksiyon bileşenleri eklemek "pozitif" (örn., Bir saf bakteri kültürü çıkarılan DNA), bir "PCR inhibitörü" kontrol dahil (yani, pozitif saf kültür DNA 1 ul ve 1 temiz çıkarılan RNA ul) ve steril RNAse ücretsiz dH 2 O bir "negatif" kontrol
- 95 ° C 5 dakika, (95 ° C 30 sn, 57 ° C'de 30 saniye, 72 ° C'de 1 dakika) 35 döngü x, 72 ° C'de 10 dk daha sonra yapılacak amplifikasyon parametreleri ile PCR ayarlayın.
- 40 dakika boyunca 85 V bir% 1 agaroz jeli üzerinde PCR ürünün 10% çalıştırın. Bir PCR ürünü, çevre RN oluşturulduğu takdirde DNase I tedavisi tekrarBir örnekler.
- 1:10 sulandırmak için steril RNAse ücretsiz dH 2 O 18 ul RNA 2 ul ekleyin.
RNA'dan ilk kol cDNA 3. Nesil
- Bir RNAse / DNAse ücretsiz 0.2 ml PCR tüp Tablo 4 uyarınca ayraçlar eklenir.
- 65 ° C 5 dakika da örnek inkübe edin. en az 1 dakika için buz üzerine yerleştirin ve 10 dakika için 25 ° C'de inkübe edin.
- Aynı tüp Tablo 5'te listelenen reaktifler ekleyin.
- 50 dakika 55 ° C'de örnek inkübe edin. 10 dakika süre ile 72 ° C'de reaksiyona etkisiz hale getirirler.
- kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın cDNA.
4. Nicel PCR
- qPCR DNA standartları Üretimi
- Q-PCR primerleri (1369F ve 1492r 21) saf bir kültüründen ekstre edildi genomik DNA'dan bakteriyel 16S rRNA dizi 20 (veya ilgi duyulan herhangi bir başka dizinin) yükseltin.
- üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak.
- saflaştınlmış PCR klonlamaüreticinin talimatlarına uygun olarak vektör sistemi klonlama bir 3'-t çıkıntı halinde bir ürün.
- PCR, üreticinin talimatlarına göre Escherichia coli JM109 kompetan hücreler içine parçasını içeren vektör dönüşümü.
- Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal (20 ug / ml) ve IPTG üzerinde dönüşüm 50 ul (0.5 mM) Luria Bertani plakaları (tripton 10 g / l, maya ekstresi 5g / L, NaCI, 10 g agar / L agar 15 g / l). 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
- plaka tek bir pozitif beyaz transformant seçin. 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden 50 mL LB et suyu içinde pozitif transformant inoküle ve 37 ° C 'de O / N, 250 rpm'de çalkalayarak kuluçkalayın.
- O / N kültüründen izole etmek ve üreticinin talimatlarına göre bir ticari kit kullanılarak plazmid arındırmak.
- (Örneğin, EcoRI) bir kere plazmid kesme kapasitesine sahip olan, uygun bir restriksiyon enzimi ile plazmid linearize.
- Bir spektrofotometre kullanılarak 19, 260 nm'de absorbans ile plasmid DNA konsantrasyonunun belirlenmesi.
Not: Alternatif olarak, miktar doğruluğunu florometre ile bağlantılı olarak kullanılan bir fluoresan DNA bağlayıcı boyanın kullanımı ile geliştirilebilir. - Sıra plazmid üsleri hedef boyutu onaylamak için yerleştirin. Miktarı plazmid ekleme DNA (yani, yüzde) hesaplayın (3000 bp vektörü örneğin, bir 123 bp DNA fragmanı toplam DNA'nın% 3,9) ve tespit etmek, 4.1.10 elde edilen konsantrasyon ile çarpın hedef (insert) DNA konsantrasyonu.
- ul başına hedefin kopyalarını hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
yük / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - iki şeritli DNA, ortalama molekül ağırlığı (dsDNA, baz çifti başına 660 Dalton) hedef DNA baz çifti sayısının çarpılması ile hedef molekül ağırlığı (TMW) hesaplayın.
- DNA, 2 ul ve steril dH 2 O 18 ul ile 10 Ekim 10-02 kopya arasında değişen bir aralıkta, hedef DNA seyreltin Her seyreltme İyice karıştırın ve bir sonraki seyreltme yapmadan önce kısaca aşağı doğru döndürün.
- qPCR RNA, standart eğrisi oluşturacak
- Adım 4.1.5 itibaren, hedef ters primer (yani, R1492) ve ileri vektör plazmid astar M13F kullanarak koloni PCR 19 beyaz koloniler (yaklaşık 5) bir dizi ekran.
Not: Bu primerler kombinasyonu, akış yukarı bir T7 yükseltici sitesi ile doğru duyu oryantasyonunda klonlanmış ekler vermelidir. - imalatçının talimatları izlenerek bir ticari kit kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. saflaştırılmış PCR s niceliğinibir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de Ü.
- In vitro transkripsiyon reaksiyonu için, her ribonükleotid, 1 T7 reaksiyon tamponu, 1 T7 polimeraz enzimi 7.5 mM, 20 ul nihai hacim içinde, PCR ürünü, 200 ng ekleyin.
- 37 ° C'de 4 saat reaksiyona inkübe edin. I DNA şablonu kaldırmak için 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin reaksiyona RNase-barındırmayan DNase 1 birim ekleyin.
- Etanol çökeltme 19 ile in vitro transkribe RNA kurtarma ve 260 nm 'de bir florimetre ya absorbans ile kullanılarak RNA kazançları ölçmek.
- RNA ul başına transkript sayısını hesaplayın. T7 promotörü (153 bazlar) uzunluğuna hedef RNA (örn, 123 baz) baz çifti sayısının ekleyin ve RNA ortalama moleküler ağırlığı, taban başına 340 Dalton ile çarpın.
- kullanım için 4.1.13 belirtildiği gibi seri olarak bölüm 3. cDNA seyreltik belirtildiği gibi, bir ters transkriptaz (RT) reaksiyona sayısal hedef RNA 500 ng eklemeStandart eğri olarak.
- Adım 4.1.5 itibaren, hedef ters primer (yani, R1492) ve ileri vektör plazmid astar M13F kullanarak koloni PCR 19 beyaz koloniler (yaklaşık 5) bir dizi ekran.
- Real-Time PCR
- Çözülme çevresel DNA / cDNA örnekleri, standartlar ve buz üzerinde qPCR reaktifler. Işıktan florojenik probu koruyun.
- 4.1.14 belirtildiği gibi, standart eğri için standartlar ile seyreltilir. / Temiz ila 10 -3 için cDNA steril dH 2 O 18 ul örnek 2 ul ekleyerek çevresel DNA 01:10 dilüsyonları olun
- Toplam reaksiyon sayısı artı Tablo 6'da (primerler ve prob) ve Tablo 7 (reaksiyon karışımı) başı olarak% 10 bir master miks reaksiyonu olun. iyi ve kısaca santrifüj karıştırın.
- 96 oyuklu bir optik qPCR plakadaki her oyuğa ana karışımı 19 ul şablonun 1 ul (standart, negatif kontrol için çevresel numune ya da su) eklenir. üç nüsha halinde, her reaksiyonu (standartlar, çevre örnekleri ve negatif kontrolleri) gerçekleştirin.
- Q-PCR Optik kapak 96 oyuklu plaka örtün. kısaca plaka santrifüj. YükqPCR makinenin ısıtma bloğu içine plaka ve kapağı kapatın.
- qPCR yöneticisi yazılımını açın. , "Protokol sekmesini" tıklayın "yeni oluşturmak" tıklatın, aşağıdaki amplifikasyon koşulları ekleyin: 3 dk 95 ° C (10 sn 95 ° C, 30 saniye 60 ° C) 40 döngü x. 20 ul Set örnek hacmi, "Tamam" a tıklayın ve protokol kaydedin.
- "Plaka" sekmesini tıklayın. "Seçilen düzenlemek" altında, "fluorofor seçin" seçeneğini tıklayın, uygun prob, örneğin, floresein rapor boya ekleyin. "Tamam" ı tıklayın.
- "Numune türü" menüsünden "standart" seçeneğini standartları içeren kuyu vurgulayın. değiştirmek 3 "boyutu çoğaltmak", "uygulamak" tıklayın "serisi çoğaltmak" tıklayın. Standart 1 için hesaplanan başlangıç konsantrasyonu eklemek için "seyreltme serisi" Click standart eğri eklendi seyreltme faktörü (10), seçme "azalan" ya da siparişe bağlı olarak "artan" işaretplaka. "Uygulamak" tıklayın.
- Iyi bilinmeyen örnekleri içeren pozisyonları vurgulayın "numune tipi" dan "bilinmeyen" seçeneğini açılır menüsünden. "Serisi çoğaltmak" tıklayın ve "uygulamak" 3. tıklayın için "boyutunu çoğaltmak" olarak değiştirin. "Örnek adı" altında örnek adlarını düzenleyin. Hiçbir Şablon Kontroller (NTC) Kuyular için prosedürü tekrarlayın.
- Plaka editörü kutusunda "Tamam" ı tıklayın ve dosyayı kaydedin. "Çalışma başlatmak" tıklayın.
- kaçak tamamlanmasından sonra, veri analizi penceresi açılacaktır. Standart eğri, standart eğri tanımlayıcıları (Tablo 8) ve büyütme araziler görüntülemek için "ölçümü sekmesi" tıklayın.
- Cp değerleri için "miktar verileri" sekmesine tıklayın ve bilinmeyen numunelerin gen (SQ) miktarı başlangıç tekabül eder. tablo yazılımı ihracat tablosu gerekirse.
- seyreltme faktörü ile bilinmeyen örnekleri çarpın gen bolluğu, sediment extrac miktarıdan Ted ve toplam hacmi nükleik asitler ıslak ağırlık tortu gramı başına gen kopyalarını elde etmek için ayrılmıştır.
Q-PCR reaksiyonunda şablon olarak 1 ul, 50 ul tortu, 0.5 g Elute DNA 1/10 seyreltilmiş; Not: Gen kopya DNA x seyreltme faktörü x yıkama hacmindeki x 2 ul: çarpılarak gen kopyaları g -1 tortu hesaplayın.
Representative Results
tortulardan kaliteli DNA ve RNA ekstraksiyon geni ve transkript bolluklarını miktarının ilk adımdır. Başarılı bir ekstre alma verimleri keskin 23S ve 16S rRNA bantları yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA, bandına ilave olarak görebilir Örnek AC için Şekil 1 'de gösterildiği gibi açık bir DNA ve RNA bantları.
Şekil 1. DNA / RNA ekstraksiyon. Üç nüsha DNA / RNA ekstraksiyonu Tipik sonuçlar (ABC) 0.5 g kıyı çökelleri. DNA / RNA'nın 5 ul 40 dakika boyunca 85 V bir% 1.4 agaroz üzerinde çalıştırıldı. 10,037-200 bp aralığında bir moleküler işaretleyici kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bir qPCR reaksiyon protokolü 16S rRNA DNA hedef belirtilmiştir. 16S için rRNA transkript standart cu yerinecDNA ile rve ve şablonu. Bilinmiyor numuneleri standart eğriye karşı nicelendirilir olarak, Şekil 2. Standart eğri iyi kalitede olduğundan emin olmak için zorunludur (A), Standart eğriler ve çevresel DNA seyreltileri, (B), standart eğrinin amplifikasyon hazırlanışını göstermektedir gen kopya numaralarının bir lineer regresyonu ve hesaplama standart eğrinin ve çevresel numuneler (C) dönüştürme. 10 kat seyreltme aralığı doğru hazırlanmış ve görülen her bir standart seyreltme arasında 3,3 döngü farkı güçlendirilmiş zaman (Şekil 2BI) (% 100 büyütme verimlilikle şablonda on kat artış 3.3 devir alır). 90 ila 110% arasındadır (Şekil 2C) içindeki 0.99 R2 değerleri ve PCR verimliliği de dahil olmak üzere standart eğriler tanımlayıcıları, arzu edilir. Hiçbir şablon kontrolü (NTC) varsa gelen Cp değerleri rapor önemlidir. Bu <standartlar ve bilinmeyen numunelerin 3.3 döngüleri (bir Cp sınır değeri oluşursaem> yani bir günlük kat) 20 (Şekil 2Cii dayatılan NTC Cp değeri) daha yüksek. Sediment DNA çıkarılan Bilinmeyen şablon, temiz 10 -1 10 -2 ve 10 -3 dilüsyonları (B) ölçüldü. Temiz numune 10 -1 -3 ila 10 dilüsyonları Cp değerleri sırasıyla 24.12, 26.02 ve 28.40 idi, yükseltmek vermedi. NTC Cp 27.2 bir NKT kesim dayatıldı, 30.5 idi. G gen bolluklarını dönüştürme -1 yaş ağırlık tortu 10 -1 ve 10 x 10 7 2.5 ve 7.1 x 10 7 sonuçlandı -2 sırasıyla seyreltme aralığı için. 10 -3 seyreltme Cp NTC kesme altında olduğu ve bu nedenle kullanılmamıştır. Bu durumda, 10 -2 uygun şablon seyreltme seçilmiştir.
Şekil 2. 16S rRNA geni QPCR standartlarının yükseltme ve kıyı çökelleri çıkarılan çevre DNA. (A) i) DNA'dır standart eğrinin hazırlanması ve qPCR amplifikasyonu için ii) çevresel DNA seyreltiler (B) qPCR amplifikasyonu), DNA standart eğri ii) çevresel örnekler, her bir örnek için, Cp gösterilmiştir. (C) i) standart eğri tanımlayıcıları ile standart eğrinin lineer regresyon, çevre örneklerinden gen bolluk ii) hesaplanması. NTC:. Negatif Şablon Kontrolü bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| reaktif | miktar |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2.58 g |
| KH 2 PO 4 | 0.1 gr |
| NaCI | 2.05 g |
| dH 2 O | en fazla 100 mi |
CTAB-fosfat tamponu Tablo 1. hazırlanması.
| reaktif | miktar |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCI | 9.35 g |
| dH 2 O | en fazla 100 mi |
| Not: yavaşça orta derecede ısıtma ve DH 2 O 50 ml karıştırılarak PEG 6000 ilave | |
PEG-NaCl yağış çözeltisinin Tablo 2. hazırlanması.
| reaktif | miktar |
| Seyreltilmemiş RNA / RNA 1:10 oranında seyreltildi | 1.0 ul |
| 10x PCR Tampon | 5,0 ul |
| 10 mM dNTP | 1.0 ul |
| 63F ileri primer | 1.0 ul |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R ters primer | 1.0 ul |
| ATT ACC GCG GTT GCT GG | |
| Taq polimerazı | 0.4 ul |
| RNAse ücretsiz dH 2 O | 40.6 ul |
Tablo 3. DNA-RNA serbest kalite kontrol PCR master karışımı.
| reaktif | miktar |
| RNA | 0,5-5 mikrogram |
| 10 mM dNTP | 1 ul |
| Ters primer 10 uM / Rasgele heksamerlerin 50 uM | 1 ul |
| DEPC H2O | En fazla 13 ul |
Tablo 4. cDNA sentez, reaksiyon karışımı A.
| reaktif | miktar |
| tampon 5x | 4 ul |
| DTT | 1 ul |
| RNaz inhibitörü | 1 ul |
| Ters transkriptaz | 1 ul |
Tablo 5. cDNA sentez, reaksiyon karışımı B.
| Hedef | astar adı | Sıra | Tavlama T (° C) | Referans |
| 16S rRNA bakteri | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki ve ark., 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (prob) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| reaktif | miktar |
| 2x Master Mix | 10 ul |
| Ileri primer (10 uM) | 0.8 ul |
| Ters primer (10 uM) | 0.8 ul |
| Sonda (10 uM) | 0.4 ul |
| Su | 7.0 ul |
| nihai hacmi | 19 ul |
Tablo 7. Gerçek zamanlı PCR reaksiyonu karışımı.
| Açıklayıcı | önem |
| Korelasyon katsayısı (R2) | Standart eğrinin doğrusal bir ölçüsüdür. İdeal = 1R 2 olmalıdır. R 2 = 0,98-0,99 değeri kabul edilir. |
| Yamaç (α) | Reaksiyon verimlilik ölçüsü. İdeal -3.32 eşdeğer olmalıdır. -3.58 Ile -3.1 aralığında değer. |
| Verimlilik (= 10 (-1 / eğim) -1) | % 100 ise, şablonlar üstel amplifikasyon sırasında her bir termal döngüsünden sonra iki katına çıkar. İyi bir verim aralığı 90 ile% 110 arasındadır. |
| Y Intercept (β) | Reaksiyonun tespit teorik limiti. Reaksiyon hassasiyetini ölçmek için kullanılan olmamasına rağmen aynı hedefin farklı standart eğrileri karşılaştırırken, bu önemlidir. |
Tablo 8. QPCR reaksiyon tanımlayıcıları.
Discussion
qPCR DNA / RNA ekstraksiyonu kombinasyonu gibi kıyı çökelleri gibi çevresel örneklerin, bir dizi gen ve transkript bolluk hassas ölçümü için hızlı, doğru, nispeten düşük maliyetli bir yöntem sağlar.
İlk nükleik asit ekstraksiyon 22 elde edilir mikrobiyal topluluk mevcut temsili bir görünüm sağlamak için kritik bir adımdır. Önleyici bileşikler (örneğin, humik asitler veya polifenolik a) Toplam hücre parçalama başarı, b) CO-ekstraksiyon) RNA fraksiyonu, C) kirletici DNA, d): sınırlamalar, ekstraksiyon protokolü için dikkate alınması gereken saklanan çıkarılan nükleik asitlerin hızlı bozulması. Önlemler bu sınırlamaları aşmak için alınmalıdır. Örneğin, özellikle bakım nükleik asitlerin ekstraksiyon örnek tipi (örneğin, sediment, toprak, atık su, vb için optimize olduğundan emin olmak için alınması gereken). DNA ve hem de RNA için nükleik asit verimi ve kalitesinde önemli ilerlemeler ön deneyler 23 gerçekleştirilmesi ile elde edilebilir. PCR bazlı uygulama 24 önleyici bileşiklerin etkisini en aza indirmek için, ekstre DNA ve RNA dilüsyonları bir dizi test edin. Birden çok dondurma-eritme çevrimleri elde edilen DNA / RNA hızlı bir şekilde ayrıştırılmaları aşmak ve -80 ° C 'de genetik bilginin kaybı, mağaza çok küçük hacimli alikotları önlemek için.
dikkatle, qPCR tasarlanmış zaman Sağlam, yüksek tekrarlanabilir ve hassas bir yöntemdir. Özellikle, bu protokolde belirtilen amplifikasyon ve standart eğri yapımı için yöntemler için diğer filogenetik belirteçleri (örneğin, arke 16S rRNA mantar 18S rRNA) ya da çevreye önemli fonksiyonları yer alan genlerin de içeren ilgili herhangi bir gen hedefi için adapte edilebilir. qPCR kullanımında bilinen sınırlamalar şunlardır: tekrarlanabilir yüksek kaliteli s) nesilMutlak ölçümü için tandard eğrisi, b) primer / prob seçimi ve Q-PCR Tayin koşullarının optimize edilmesi, c) düşük kaliteli / kesilmiş nükleik asitler, d), DNA / RNA çalışma seyreltisi seçimi kullanımı engellenmesini önlemek için . Ayrıca, qPCR tekniği hücre hesaplarına eşit olmayabilir geni / transkript bolluklarını sağlayan dikkate alınmalıdır: Mikroorganizmalar genomları ribozomal geni farklı kopya numaraları bu 16S ve 18S rRNA gen hedeflenen durumda, özellikle de bir 25.
Kalitesiz standart eğrileri ilgilenilen genin yanlış ölçümü neden olacaktır. Taze standart eğrileri yapılabilir hangi küçük alikotları yüksek konsantrasyon standartları stok saklamak için iyi bir uygulamadır. standart eğrileri tutmayın, her zaman en yüksek konsantrasyonda her zaman bir stok taze dilüsyonları yapmak. Çevresel örneklerin doğru ölçümü için stan konsantrasyonlarının aralığı sağlamakdard eğrisi bilinmeyen numunelerin beklenen Cp değerleri kapsar. transkript miktarının zaman iplikli DNA çift değil RNA standart eğri oluşturmak. Mümkün olduğunda, doğrudan karşılaştırılmasına örneklerinde miktar tayini Deneyler arası değişim 20 önlemek için tek bir tahlil içinde tamamlanmalıdır. Bu her zaman mümkün olmayabilir. Bu nedenle, tahliller arasında oluşan gen bolluklarını karşılaştırmak için tahliller arasında çoğaltılır örneklerin rastgele bir alt kümesi olması tavsiye edilir. Primer ve prob setleri geniş bir seçim anda qPCR mikrobiyal takson ve hedef grup için maksimum kapsama ve özgünlüğünü sağlamak için bu seçerken 15. Dikkatli göz gerekli fonksiyonel grupları hedef için kullanılabilir. Bir qPCR deneyinin Reaksiyon verimliliği tatmin edici değilse, sorun, EG ve / veya reaksiyon koşullarına (tavlama süresi ve / veya sıcaklık gibi), farklı termal döngü koşulları test primer prob konsantrasyonları ile başlar. OQ-PCR yöntemi ve reaksiyon koşulları optimize edilmiştir nce, her zaman uygun bir şablon konsantrasyonu belirlemek için, DNA / cDNA seyreltme aralığı bir başlangıç testi yapması gerekmektedir. Daha fazla tahliller için optimal şablon seyreltme en yüksek kopya sayısı ile sonuçlanan seyreltme aralığını seçin.
Şu anda, yeni nesil dizileme teknolojileri verimli ortamlar 26,27,28 bir bolluk mikrobiyal toplum yapısı ve fonksiyonları üzerine ışık tutacak. Ancak, bu veri kümeleri genellikle son nokta PCR amplikon kütüphaneleri dayanmaktadır ve bu nedenle belirli takson bolluğu sadece yarı-kantitatif değerlendirmeler sağlar. Dolayısıyla, gerçek zamanlı PCR tabanlı tekniğin yeteneği belirli taksonomik belirteçleri hedef (aşağı gerilme seviyesine yüksek etki alanından) yeni nesil dizileme ile elde edilen sonuçların verimli doğrulama sağlar. Ayrıca, qPCR başarılı şekilde stabil ISO başka mikrobik ekolojisi moleküler yöntemler ile bir arada kullanılmaktadıralkolik sondalama (SIP) veya filogenetik / fonksiyonel mikroarray'ler. Eski bir araç ile birlikte, qPCR metabolik olarak aktif bir topluluk 29,30 ölçmek için kullanılabilir. Mikroarray analizi ile kombine edildiğinde, qPCR ortamlarda 31,32 filogenetik belirteç tabanlı ve fonksiyonel gen araştırmalarının önemli nicel yorumunu sağlar.
Bu nedenle, ister tek başına ya da ekosistem işlevi diğer (çoğunlukla süreç tabanlı) değerlendirmeler ile birlikte kullanılır, kantitatif PCR mikrobiyal topluluklar ve ekosistem fonksiyonları arasında zor bağlantının keşif mikrobik ekolojistler için önemli bir araçtır.
Acknowledgments
Bu yayın hibe sayısı NERC NE / JO11959 / 1 ve Bilim Vakfı İrlanda & CJS Grant Sayı 11 / SIRG / B2159awarded altında Marie-Curie Eylem COFUND altında Doğal Çevre Araştırma Konseyi (Merkezi tarafından) finansal desteği ile yürütülen araştırma kaynaklanmaktadır etti ve Doğu Academic Research Consortium (Doğu ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S.
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
