A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Real Time Polymerase Chain Reaction også kjent som kvantitativ PCR (q-PCR) er et mye brukt verktøy i mikrobiell økologi å kvantifisere genetiske Forekomsten av taksonomiske og funksjonelle grupper i miljøprøver. Brukes i kombinasjon med en revers transkriptase reaksjon (RT-q-PCR), kan det også brukes til å kvantifisere genet transkripsjoner. q-PCR gjør bruk av svært sensitive deteksjons fluorescerende kjemikalier som tillater kvantifisering av PCR-amplikoner i løpet av den eksponensielle fase av reaksjonen. Derfor blir de skjevheter knyttet til "end-point" PCR detektert i platåfasen av PCR-reaksjonen unngås. En protokoll for å kvantifisere bakterielle 16S rRNA gener og transkripsjoner fra kystsedimenter via real-time PCR er gitt. For det første en fremgangsmåte for ko-ekstraksjon av DNA og RNA fra kyst sedimenter, inkludert de ytterligere trinnene som er nødvendig for fremstillingen av DNA-fri RNA, er angitt. For det andre, en steg-for-steg guide for kvantifisering av 16S rRNA gener og transcripts fra de utpakkede nukleinsyrer via q-PCR og RT-q-PCR er skissert. Dette inkluderer informasjon om bygging av DNA og RNA standardkurver. Viktige faktorer for bruk av RT-q-PCR-analyser i mikrobiell økologi er inkludert.
Mikroorganismer er hjørnesteinen i biosfæren kjøre økosystem funksjon. Flertallet av mikroorganismer forbli uncultured en. Derfor molekylære baserte tilnærminger er grunnleggende for å fremme vår forståelse av mangfold og funksjon av mikroorganismer i miljøet. Sentralt til disse metodene er utvinning av nukleinsyrer fra miljøprøver og påfølgende amplifikasjon av målgener ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR).
Det første trinn i DNA / RNA-ekstraksjon som mål å lysere celleveggene i den mikrobielle fellesskap til stede, fjerne uønskede ikke-nuklein-syremolekyler (for eksempel organiske og uorganiske stoffer) og beholde DNA / RNA i oppløsning for ytterligere nedstrøms analyse. Blant flere alternativer tilgjengelig i litteraturen 2,3,4,5, inkludert en rekke kommersielle utvinning kits er Griffiths metoden seks vidt ansatt 7,8,9. Det er kostnadseffektivt og particularly vel egnet til sedimenter som den bruker en vulst ledende trinn å lysere cellene, og omfatter trinn for å minimere den ko-utvinning av PCR-inhibitorer, slik som humussyrer, mens samtidig å gjenvinne DNA og RNA.
Det andre trinnet benytter polymerase kjedereaksjon (PCR) for å amplifisere mål-gener, slik som 16S rRNA taksonomiske markør, fra de ekstraherte nukleinsyrer. Denne tilnærmingen har og fortsetter å lette utforskningen av ukarakterisert mikrobielle sorte boksen 10,11. Men end-point PCR-baserte metoder lider av ulike begrensninger som kan skjevhet karakterisering av mikrobielle samfunn 12. For nøyaktig kvantifisere gen / karakter abundances, må real-time PCR, også kjent som kvantitativ PCR (qPCR) anvendes. qPCR utnytter fluorescerende reporter fargestoff systemer som sporer amplicon akkumulering etter hver syklus av PCR. Dette er viktig fordi det betyr at kvantifisering kan forekomme i løpet av den tidlige eksponensielle fase, hellerenn endepunktet, fase av PCR-reaksjonen, når amplikonet utbyttet fremdeles er direkte proporsjonal med den initielle overflod av målgenet.
To reporter-systemer blir ofte brukt: en interkalerende nukleinsyre flekk 13 og det 5'-3'-eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerasen 14. Siden det tidligere rapportørsystemet bindes indistinctively til alle dobbeltkjedet DNA, kan det føre til en overestimering av målsekvensen dersom uønskede ikke-spesifikke amplikonene eller primer-dimerer ved produkter oppstår. For å unngå dette, kan omfattende optimalisering av forsterkning være nødvendig. I det sistnevnte system blir mal forsterkning spores ved hjelp av en kombinasjon av en 5 'nukleaseaktivitet av Taq-polymerase som spalter en fluorofor fra en indre sonde. Dette trekk øker spesifisiteten av analysen på grunn av utnyttelsen av et fluorogent probe som binder seg bare til den komplementære target-spesifikke-sekvensene mellom primerpar. Med begge kjemi kvantifisering oppnås ved å bestemme krysningspunktet (CP) hvor akkumuleringen av PCR-amplikoner, som målt ved en økning i fluorescens, er betydelig over bakgrunnsfluorescens.
qPCR har vært mye brukt i mikrobiell økologi for å fastslå genet i hopetall i ulike miljøer 15. Videre er revers transkripsjon av RNA til cDNA kombinert med qPCR og RT-qPCR å kvantifisere genekspresjon. Derfor qPCR og RT-qPCR representerer raske og effektive metoder for kvantifisering av genet og / eller transkripsjons tall innenfor miljøprøver.
Mikroorganismer i kystnære sedimenter kjøre ulike økosystemprosesser, herunder mineralisering av organisk materiale, nedbrytning av miljøgifter og biogeokjemiske kretsløp av makronæringsstoffer som nitrogen 16,17,18. Den uttømmende forståelse av disse transformasjoner krever en omfattende regnskapst av de medvirkende mikrobielle populasjoner, inkludert kvantitative data om gen- og transkripsjon hopetall. Her introduserer vi en rekke grundig testet, strømlinjeformet og standardiserte protokoller for kvantifisering av bakterielle 16S rRNA-genet og karakterutskrift i hopetall i kystnære sedimenter. Protokollen beskriver prøvetaking, samtidig DNA og RNA ekstraksjon, DNA-fri RNA forberedelse, kvalitet kontroll av utvunnet nukleinsyrer, generering av 16S rRNA-DNA og -RNA standarder og kvantifisering av miljøprøver. Kvantitative data fra metodene som beskrives her er nødvendig for å belyse mikrobielle samfunn kjørekystnære økosystemer.
Kombinasjonen av DNA / RNA ekstraksjon med qPCR gir en rask, nøyaktig, relativt kostnadseffektiv metode for sensitiv kvantifisering av genet og karakterutskrift Forekomsten av en rekke miljøprøver, for eksempel kystsedimenter.
Den opprinnelige nukleinsyre ekstraksjon er det kritiske trinn for å sikre et representativt riss av den mikrobielle fellesskap liggende oppnås 22. En rekke begrensninger må tas i betraktning for utvinning protokoll: a) oppnåelse av total cellelysering, b) ko-ekstraksjon av inhiberende forbindelser (f.eks humussyrer eller polyphenolics), c) kontaminerende DNA på RNA-fraksjon, d) rask nedbrytning av utvunnet nukleinsyrer ved lagring. Forholdsregler må tas for å omgå disse begrensningene. For eksempel må tas særlig hensyn til at utvinning av nukleinsyrer er optimalisert for prøvetype (for eksempel sedimenter, jord, avløp, etc.). Betydelige forbedringer i nukleinsyre utbytte og kvalitet for både DNA og RNA kan bli oppnådd ved å utføre preliminære eksperimenter 23. For å minimere effekten av hemmende forbindelser i PCR-baserte applikasjoner 24, teste en rekke fortynninger fra det ekstraherte DNA og RNA. For å omgå den raske nedbrytning av det ekstraherte DNA / RNA fra flere fryse-tine-sykluser og unngå mulig tap av genetisk informasjon, kan lagre flere små volum alikvoter ved -80 ° C.
Når nøye utformet, qPCR er en robust, meget reproduserbar og følsom metode. Spesielt kan de metoder for forsterkning og standardkurve konstruksjon som er skissert i denne protokollen tilpasses ethvert gen mål av interesse, inkludert andre fylogenetiske markører (dvs. archaeal 16S rRNA, sopp 18S rRNA) eller gener som er involvert i viktige funksjoner i miljøet. Kjente begrensninger i bruken av qPCR er: a) generering av reproduserbar høy kvalitet standard kurve for absolutt mengdebestemmelse, b) valg av primer / prober og optimalisering av q-PCR-analysebetingelser, c) bruk av lav kvalitet / skåret nukleinsyrer, d) valg av arbeids fortynning av DNA / RNA for å unngå inhibering . Videre må det tas i betraktning at qPCR teknikk gir genet / karakterhopetall som ikke kan likestille til celle teller: Dette er særlig tilfelle når 16S og 18S rRNA gener er målrettet, som mikroorganismer har ulike kopiantall av ribosom gen i sitt genom 25.
Dårlig kvalitet standardkurver vil resultere i unøyaktig kvantifisering av genet av interesse. Det er god praksis å lagre en aksje med høy konsentrasjon standarder i små porsjoner som ferske standardkurver kan gjøres. Ikke lagre standardkurver, alltid ferske fortynninger fra et lager av den høyeste konsentrasjonen hver gang. For nøyaktig kvantifisering av miljøprøver sikre en rekke konsentrasjoner av de standard kurve spenner de forventede Cp verdiene av de ukjente prøvene. Når kvantifisere transkripsjoner, konstruere standardkurve fra RNA ikke doble DNA. Når det er mulig, bør kvantifisering av prøver å bli direkte sammenlignet være fullført innen en enkelt analyse for å unngå inter-assay variasjon 20. Dette kan ikke alltid være mulig. Derfor, for å sammenligne genet abundances generert mellom analysene er det lurt å ha en tilfeldig sub-sett av prøvene replikeres mellom analyser. Et bredt utvalg av primer og sonde sett er for tiden tilgjengelig for qPCR målretting mikrobiell taxa og funksjonelle grupper 15. Nøye vurdering er nødvendig når du velger disse for å sikre både maksimal dekning og spesifisitet for målgruppen. Dersom reaksjonen effektiviteten av en qPCR-analyse er ikke tilfredsstillende, begynner feilsøking med å teste forskjellige termiske sykluser værforhold (annealing tid og / eller temperatur) og / eller reaksjonsbetingelser, for eksempel varierende primer-probe konsentrasjoner. ONCE Q-PCR-analyse og reaksjonsbetingelser er optimalisert, alltid gjennomføre en innledende test av en rekke DNA / cDNA fortynninger for å bestemme passende mal konsentrasjon. Velge den fortynning område som resulterer i den høyeste kopitallet som den optimale fortynning templat for ytterligere analyser.
Foreløpig neste generasjons sekvensering teknologi effektivt belyse mikrobiell samfunnsstruktur og funksjoner i en mengde miljøer 26,27,28. Imidlertid er disse datasettene ofte basert på endepunkts PCR fragment biblioteker og derfor gir bare halv kvantitative vurderinger av overflod av spesielle taxa. Derfor, for å evnen til Real Time PCR-basert teknikk målrette bestemte taksonomiske markører (fra høyere domene ned til stammenivå) gir effektiv validering av resultatene oppnådd av neste generasjons sekvensering. Videre qPCR har blitt brukt i kombinasjon med andre mikrobiell økologi molekylære metoder slik som stabil isotope sondering (SIP) eller fylogenetiske / funksjonelle mikromatriser. Kombinert med den tidligere verktøyet, kan qPCR brukes til å kvantifisere metabolsk aktive fellesskap 29,30. Når det kombineres med microarray analyse, gir qPCR nøkkelen kvantitativ tolkning av fylogenetiske markør-basert og funksjonelle genet kartlegging av miljøene 31,32.
Derfor brukes alene eller i kombinasjon med andre (ofte prosessbasert) vurdering av økosystem funksjon, er kvantitativ PCR et viktig verktøy for mikrobielle økologer i utforskningen av den unnvikende koblingen mellom mikrobielle samfunn og økosystemfunksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikasjonen har strømmet ut fra forskning utført med økonomisk støtte fra Natural Environment Research Council (NERC) under tilskuddet antallet NERC NE / JO11959 / 1 og Science Foundation Irland og Marie-Curie Handling COFUND henhold Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded til CJS og den østlige akademisk forskning Consortium (Eastern ARC).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |