A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
ПЦР в реальном времени, также известный как количественной ПЦР (Q-PCR) является широко используемым инструментом в микробной экологии для количественного определения генов обилиями таксономических и функциональных групп в пробах окружающей среды. При использовании в сочетании с реакцией обратной транскриптазы (ОТ-Q-ПЦР), он также может быть использован для количественного определения генных транскриптов. Q-ПЦР использует высокочувствительных флуоресцентных обнаружения химических, которые позволяют количественно оценить ПЦР-ампликонов во время экспоненциальной фазы реакции. Таким образом, систематические ошибки, связанные с "конечной точки" PCR обнаруживались в фазе плато ПЦР-реакции можно избежать. Протокол для количественного определения бактериальных генов 16S рРНК и распечаток из прибрежных отложений с помощью в режиме реального времени обеспечивается ПЦР. Во-первых, способ совместного извлечения ДНК и РНК из прибрежных отложений, в том числе дополнительных шагов, необходимых для получения ДНК-РНК, свободной, изложена. Во-вторых, руководство шаг за шагом для количественного определения генов 16S рРНК и трanscripts из извлеченного нуклеиновых кислот с помощью д-PCR и RT-Q-ПЦР изложена. Это включает в себя данные для построения кривых ДНК и РНК стандартных. Основные соображения по использованию анализов RT-Q-ПЦР в микробной экологии включены.
Микроорганизмы являются краеугольным камнем функции биосферного вождения экосистем. Большинство микроорганизмов остаются некультурная 1. Поэтому молекулярные подходы, основанные имеют основополагающее значение для улучшения нашего понимания разнообразия и функции микроорганизмов в окружающей среде. Центральное место в этих подходах является извлечение нуклеиновых кислот из образцов окружающей среды и последующее усиление генов-мишеней с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Первая стадия экстракции ДНК / РНК стремится лизировать клеточные стенки микробного сообщества, удалите нежелательные не являющиеся нуклеиновых кислот молекулы (например, органические и неорганические вещества) и сохраняют ДНК / РНК в растворе для дальнейшего анализа вниз по течению. Среди нескольких вариантов , имеющихся в литературе 2,3,4,5, в том числе целый ряд коммерческих наборов экстракции, метод Гриффитс 6 широко используется 7,8,9. Он является экономически эффективным и раrticularly хорошо подходит для отложений, как он использует шаг шарик бьющие лизировать клетки, и включает в себя шаги, чтобы свести к минимуму взаимодействие экстракции ингибиторов ПЦР, таких как гуминовые кислоты, в то время как одновременно восстанавливается ДНК и РНК.
На втором этапе используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации генов-мишеней, таких как таксономического маркера 16S рРНК, из извлеченных нуклеиновых кислот. Такой подход имеет и продолжает содействовать исследованию неохарактеризованной микробного черного ящика 10,11. Тем не менее, конечной точки ПЦР методы , основанные страдают от различных ограничений , которые может оказывать влияние на характеристику микробных сообществ 12. Для того, чтобы точно определить их ген / транскриптов содержаний, ПЦР в реальном времени, также известный как количественной ПЦР (КПЦР) должен быть использован. КПЦР использует флуоресцентные системы репортерного красителя, которые позволяют отслеживать накопление ампликона после каждого цикла ПЦР. Это имеет большое значение, поскольку это означает, что количественное определение может происходить во время ранней фазы экспоненциального, ачем конечной точки, фазы ПЦР-реакции, когда выход ампликонов по-прежнему прямо пропорциональна начальной обилию гена-мишени.
Обычно используются две системы репортер: интеркалирования пятно нуклеиновой кислоты , 13 и 5 '3' экзонуклеазной активности ДНК – полимеразы 14. Поскольку прежняя система репортер связывает indistinctively всем двухцепочечной ДНК, это может привести к завышению целевой последовательности в случае возникновения нежелательных неспецифических ампликонов или праймера димеры по продукции. Для того чтобы обойти это ограничение, может потребоваться обширная оптимизация усиления. В последней системе шаблон амплификации отслеживается с использованием комбинации 5 'нуклеазной активности Taq – полимеразы , которая расщепляет флуорофором с внутреннего зондом. Эта особенность повышает специфичность анализа за счет использования флюорогенного зонда, который связывается только с комплементарной целевой конкретных sequencе между парой праймеров. С тенистом Количественное достигается путем определения пункта пересечения (Cp) где накопление ПЦР-ампликонов, как измерено увеличению флуоресценции, что значительно выше фоновой флуоресценции.
КПЦР широко используется в микробной экологии для определения генов содержаний в различных средах 15. Кроме того, обратной транскрипции РНК в кДНК сочетается с кПЦР и RT-КПЦР для количественного определения экспрессии гена. Таким образом, КПЦР и RT-КПЦР представляют собой быстрые, эффективные методы для количественного определения числа генов и / или транскриптов в пробах окружающей среды.
Микроорганизмы в прибрежных отложениях привода различных процессов экосистем, в том числе минерализации органического вещества, деградации загрязняющих веществ и биогеохимического круговорота макроэлементов , таких как 16,17,18 азота. Исчерпывающий понимание этих преобразований требует комплексного accounт способствующих микробных популяций, включая количественные данные о генных и транскриптов содержаний. Здесь мы вводим ряд тщательно проверенных, упорядоченных и стандартизированных протоколов для количественного определения бактериальных генов и транскриптов содержаний 16S рРНК в прибрежных отложениях. Протокол описывает сбор образцов, одновременно ДНК и экстракции РНК, ДНК-препараты без РНК, проверка качества добываемых нуклеиновых кислот, образование 16S рРНК-ДНК и стандартов -РНК и количественной оценки проб окружающей среды. Количественные данные, полученные из методов, описанных здесь необходимы, чтобы пролить свет на микробные сообщества вождения прибрежных экосистем.
Сочетание экстракции ДНК / РНК с кПЦР обеспечивает быстрый, точный относительно экономически эффективный метод для чувствительного количественного гена и транскриптов содержаний из ряда проб окружающей среды, таких как прибрежные отложения.
Первоначальной экстракции нуклеиновой кислоты является важным шагом , чтобы обеспечить репрезентативное представление о микробного сообщества настоящее время достигается 22. Ряд ограничений необходимо учитывать для протокола экстракции: а) достижение полного лизиса клеток, б) совместное извлечение ингибирующих соединений (например, гуминовых кислот или полифенолов), с) загрязняющей ДНК в РНК фракции, d) быстрое разложение выделенных нуклеиновых кислот при хранении. Должны быть приняты меры для того, чтобы обойти эти ограничения. Например, особое внимание должно быть принято , чтобы гарантировать , что извлечение нуклеиновых кислот оптимизирована для данного типа образца (например, осадки, почвы, сточных вод и т.д.). Значительное улучшение урожайности нуклеиновых кислот и качества как ДНК и РНК , может быть достигнуто путем проведения предварительных экспериментов 23. Для того, чтобы свести к минимуму влияние ингибирующих соединений на 24 приложений на основе ПЦР, тестирование ряда разведений из извлеченной ДНК и РНК. Чтобы обойти быстрой деградации извлеченной ДНК / РНК из нескольких циклов замораживания-оттаивания и избежать возможной потери генетической информации, хранить несколько небольших аликвот объема при температуре -80 ° C.
Когда тщательно разработан, КПЦР является надежной, хорошо воспроизводимым и чувствительным методом. Следует отметить, что методы амплификации и стандартного построения кривой , описанные в данном протоколе могут быть адаптированы для любого гена – мишени , представляющей интерес, в том числе других филогенетических маркеров (т.е. архейных 16S рРНК, грибковые 18S рРНК) или генов , участвующих в важных функций в окружающей среде. Известные ограничения в использовании кПЦР являются: а) генерирование воспроизводимым высокого качества сtandard кривая для абсолютной количественной оценки, б) выбор праймеров / зондов и оптимизация условий анализа Q-ПЦР, с) использование низкого качества / срезанные нуклеиновых кислот, д) выбор рабочего разведения ДНК / РНК, чтобы избежать ингибирования , Кроме того, необходимо учитывать, что метод КПЦР обеспечивает ген / транскриптов содержаний, которые не могут приравнять к Цитоз: это особенно тот случай, когда гены 16S и 18S рРНК ориентированы, как и микроорганизмы имеют разные числа копий гена рибосомного в их геноме 25.
Плохое качество стандартных кривых приведет к неточной квантификации представляющего интерес гена. Это хорошая практика, чтобы сохранить запас высоких стандартов концентрации в виде небольших аликвот, из которых могут быть сделаны свежие стандартные кривые. Не хранить стандартные кривые, всегда делают свежие разведений из запаса самой высокой концентрации каждый раз. Для точной количественной оценки проб окружающей среды обеспечивают диапазон концентраций СтанКривая дарт охватывает ожидаемые значения Компартия неизвестных образцов. При количественной оценке транскриптов, построить стандартную кривую из РНК не двухцепочечной ДНК. Когда это возможно, количественное определение образцов следует сравнивать непосредственно должны быть завершены в течение одного анализа , чтобы избежать изменения между анализами 20. Это не всегда возможно. Поэтому для сравнения содержаний гена, сгенерированные между анализами, желательно иметь случайное подмножество выборок тиражируемых между анализами. Широкий выбор праймеров и зондов наборов в настоящее время доступны для КПЦР ориентации микробной таксонов и функциональные группы 15. Особое внимание требуется при выборе их для обеспечения как максимальный охват и специфичность для целевой группы. Если эффективность реакция анализа КПЦР не является удовлетворительным, поиск и устранение неисправностей начинается с тестирования различных температурных условий езды на велосипеде (как время отжига и / или температуры) и / или условий реакции, например, различные концентрации праймера-зонда. Ость Анализируемые и условия реакции Q-PCR оптимизированы, всегда проводит первоначальную проверку диапазона ДНК / кДНК разведений для определения соответствующей концентрации матрицы. Выберите диапазон разбавления, что приводит к самым высоким числом копий в качестве оптимального шаблона для дальнейшего разбавления анализов.
В настоящее время технологии секвенирования следующего поколения эффективно пролить свет на структуру микробного сообщества и функций во множестве сред 26,27,28. Тем не менее, эти наборы данных часто основаны на конечной точке ПЦР библиотеки ампликоне и, следовательно, обеспечивают только полу-количественные оценки обилия конкретного таксона. Следовательно, способность в реальном масштабе времени методики ПЦР-предназначаться для определенных таксономических маркеров (от более высокого домена до уровня штамма), обеспечивает эффективную проверку результатов, полученных с помощью следующего поколения последовательности. Кроме того, КПЦР был успешно использован в сочетании с другими молекулярными методами микробной экологии, такие как стабильный ISOпьянствовать зондирования (SIP) или филогенетические / функциональных микрочипов. В сочетании с бывшим инструментом, КПЦР может быть использован для количественного определения метаболически активного сообщества 29,30. В сочетании с анализом микрочипов, КПЦР предоставляет ключевую количественную интерпретацию филогенетических маркеров на основе и функционального гена обследований среды 31,32.
Поэтому, независимо от того используется отдельно или в сочетании с другими (часто основанных на процессах) оценки функционирования экосистем, количественный ПЦР является важным инструментом для микробных экологами в исследовании неуловимого связи между микробных сообществ и функций экосистем.
The authors have nothing to disclose.
Эта публикация исходит из исследования, проведенного при финансовой поддержке Научного совета природной среды (НКРЭ) под номером гранта НКРЕ NE / JO11959 / 1 и научного фонда Ирландии и Мари-Кюри COFUND действий в рамках гранта № 11 / Sirg / B2159awarded к CJS и Восточно-академическим исследовательским консорциумом (ARC Eastern).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |