A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.
Real Time Polymerase Chain Reaction även kallad kvantitativ PCR (q-PCR) är en allmänt använd verktyg för mikrobiell ekologi att kvantifiera gen bestånd av taxonomiska och funktionella grupper i miljöprover. Används i kombination med ett omvänt transkriptas-reaktion (RT-q-PCR), kan den också användas för att kvantifiera gentranskript. q-PCR använder sig av mycket känsliga fluorescenta detekterings kemier som tillåter kvantifiering av PCR-amplikoner under den exponentiella fasen av reaktionen. Därför är de fördomar som är förknippade med "end-point" PCR upptäcks i platåfasen av PCR-reaktionen undvikas. Ett protokoll för att kvantifiera bakteriella 16S rRNA gener och utskrifter från kustsediment via realtids-PCR tillhandahålls. Först, en metod för samtidig extraktion av DNA och RNA från kustsediment, inklusive de ytterligare åtgärder som krävs för framställning av DNA-fri RNA, beskrivs. För det andra, en steg-för-steg guide för kvantifiering av 16S rRNA gener och transcripts från de extraherade nukleinsyrorna via Q-PCR och RT-q-PCR skisseras. Detta inkluderar information om konstruktionen av DNA och RNA standardkurvor. Viktiga överväganden för användning av RT-q-PCR-analyser i mikrobiell ekologi ingår.
Mikroorganismer är hörnstenen i biosfären körning ekosystem funktionen. Majoriteten av mikroorganismer förblir okultiverade en. Därför molekylbaserade metoder är grundläggande för att öka vår förståelse för mångfalden och funktion av mikroorganismer i miljön. Centralt för dessa tillvägagångssätt är utvinning av nukleinsyror från miljöprover och den efterföljande amplifieringen av målgener genom att använda polymeraskedjereaktion (PCR).
Det första steget i DNA / RNA-extraktion som mål att lysera cellväggarna i den mikrobiella miljön närvarande, avlägsna oönskade icke nuklein-syramolekyler (t.ex., organiska och oorganiska ämnen) och behålla DNA / RNA i lösning för vidare analys nedströms. Bland flera alternativ tillgängliga i litteraturen 2,3,4,5, bland annat en rad kommersiella utvinning kit är Griffiths metod 6 i stor utsträckning 7,8,9. Det är kostnadseffektivt och particularly väl lämpade att sediment som den använder en vulst ledande steg för att lysera celler och innehåller steg för att minimera samtidig extraktion av PCR-inhibitorer, såsom humussyror, samtidigt återvinna DNA och RNA.
Det andra steget använder polymeraskedjereaktionen (PCR) för att amplifiera mål-gener, såsom 16S rRNA taxonomiska markör, från de extraherade nukleinsyrorna. Detta tillvägagångssätt har och fortsätter att underlätta utforskningen av okaraktäriserat mikrobiell svarta lådan 10,11. Men end-point PCR-baserade metoder lider av olika begränsningar som kan snedvrida karakterisering av mikrobiella samhällen 12. För att exakt kvantifiera gen / avskrift bestånd, måste realtids-PCR, även känd som kvantitativ PCR (qPCR) användas. qPCR utnyttjar fluorescerande reporterfärgämnessystem som spårar amplikon ackumulering efter varje cykel av PCR. Detta är betydelsefullt eftersom det innebär att kvantifiering kan inträffa under den tidiga exponentiella fasen, snarareän den endpoint fasen av PCR-reaktionen, när amplikonet utbytet är fortfarande direkt proportionell mot den initiala överflödet av målgenen.
Två reportersystem används vanligen: en interkalerande nukleinsyra fläcken 13 och 5'-3 'exonukleasaktivitet hos DNA-polymeraset 14. Eftersom den förstnämnda reportersystem binder indistinctively alla dubbelsträngade DNA, kan det leda till en överskattning av målsekvensen om oönskade ospecifika amplikoner eller primerdimerer från produkter förekommer. För att kringgå detta, kan omfattande optimering av amplifiering erfordras. I det senare systemet, är mall amplifiering spåras med hjälp av en kombination av en 5 'nukleasaktivitet hos Taq-polymeras som klyver en fluorofor från en intern prob. Den här funktionen ökar analysens specificitet på grund av att användningen av ett fluorogent sond som endast binder till den komplementära målspecifik sequence mellan primerparet. Med båda kemierna kvantifiering uppnås genom bestämning av korsningspunkten (Cp), där ackumuleringen av PCR-amplikoner, såsom mätt genom en ökning i fluorescens, är signifikant över bakgrundsfluorescens.
qPCR har i stor utsträckning använts i mikrobiell ekologi att bestämma gen bestånd i olika miljöer 15. Dessutom är omvänd transkription av RNA till cDNA kombinerat med qPCR och RT-qPCR att kvantifiera genuttryck. Därför qPCR och RT-qPCR representerar snabba, effektiva metoder för kvantifiering av genen och / eller transkript nummer inom miljöprover.
Mikroorganismer i kustsediment driva olika ekosystemprocesser, inklusive mineralisering av organiskt material, nedbrytning av föroreningar och biogeokemiska cirkulationen av makronäringsämnen såsom kväve 16,17,18. Den uttömmande förståelse av dessa förändringar kräver en omfattande redovist av de bidragande mikrobiella populationer, inklusive kvantitativa uppgifter om gen och avskrift bestånd. Här presenterar vi en rad noggrant testade, strömlinjeformade och standardiserade protokoll för kvantifiering av bakteriella 16S rRNA-genen och avskrift bestånd i kustsediment. Protokollet beskriver provtagning, samtidig DNA och RNA-extraktion, DNA-fri RNA-beredning, kvalitet kontroll av extraherade nukleinsyror, generering av 16S rRNA-DNA och RNA-standarder och kvantifiering av miljöprover. Kvantitativa data från de metoder som beskrivs här behövs för att belysa mikrobiella samhällen kör kustekosystem.
Kombinationen av DNA / RNA-extraktion med qPCR ger en snabb, noggrann, relativt kostnadseffektiv metod för känslig kvantifiering av genen och transkript bestånd från en rad miljöprover, såsom kustsediment.
Den initiala nukleinsyra extraktion är det kritiska steget för att säkerställa en representativ bild av den mikrobiella miljön närvarande uppnås 22. Ett antal begränsningar måste beaktas för extraktion protokoll: a) att uppnå total cellysering, b) sam-extraktion av hämmande föreningar (t.ex. humussyror eller polyphenolics), c) kontaminerande DNA i RNA-fraktion, d) snabb nedbrytning av extraherade nukleinsyror vid förvaring. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att kringgå dessa begränsningar. Till exempel, har särskild omsorg vidtas för att säkerställa att utvinningen av nukleinsyror är optimerad för provtypen (t.ex., sediment, jord, avloppsvatten, etc.). Signifikanta förbättringar i nukleinsyra utbytet och kvaliteten för både DNA och RNA kan uppnås genom att utföra preliminära experiment 23. För att minimera effekten av hämmande föreningar på PCR-baserade applikationer 24, testa ett intervall av spädningar från det extraherade DNA och RNA. För att kringgå den snabba nedbrytningen av det extraherade DNA / RNA från flera frys-tö-cykler och undvika eventuell förlust av genetisk information, lagra multipla små volym alikvoter vid -80 ° C.
När noggrant utformade, qPCR är en robust, mycket reproducerbar och känslig metod. Noterbart kan metoder för förstärkning och standard kurvkonstruktion som beskrivs i detta protokoll anpassas för varje gen mål av intresse, däribland andra fylogenetiska markörer (dvs archaeal 16S rRNA, svamp 18S rRNA) eller gener som är involverade i viktiga funktioner i miljön. Kända begränsningar i användningen av qPCR är: a) generering av reproducerbar hög kvalitet standard kurva för absolut kvantifiering, b) val av primer / prober och optimering av q-PCR-analys förhållanden c) användning av låg kvalitet / klippta nukleinsyror, d) valet av arbetsutspädning av DNA / RNA för att undvika hämning . Dessutom måste det anses att qPCR teknik ger gen / avskrift bestånd som inte får motsvara kroppar: detta är särskilt fallet när 16S och 18S rRNA gener är riktade, eftersom mikroorganismer har olika antal kopior av det ribosomala genen i sitt genom 25.
Dålig kvalitet standardkurvor kommer att resultera i felaktig kvantifiering av genen av intresse. Det är bra att lagra en lager av hög standard koncentrations i små portioner som kan göras färska standardkurvor. Förvara inte standardkurvor, alltid färska utspädningar från ett lager av den högsta koncentrationen varje gång. För korrekt kvantifiering av miljöprover se de olika koncentrationer av standard kurva sträcker sig över förväntade Cp värdena för okända prover. När kvantifiera transkript, konstruera standardkurvan från RNA inte dubbelsträngat DNA. När det är möjligt, bör kvantifiering av prover som skall jämföras direkt slutföras inom en enda analys för att undvika inter-assay variation 20. Detta kanske inte alltid är möjligt. Därför är det tillrådligt att ha en slumpmässig undergrupp av prover replike mellan analyser för att jämföra genprodukter abundances genereras mellan analyser. Ett brett urval av primer och sond set är för närvarande tillgängliga för qPCR inriktning mikrobiell taxa och funktionella grupper 15. Noggranna överväganden krävs när man väljer dessa för att säkerställa både maximal täckning och specificitet för målgruppen. Om reaktionseffektiviteten av en qPCR analysen är inte tillfredsställande, börjar felsökning med att testa olika termiska cykel förhållande (glödgning tid och / eller temperatur) och / eller reaktionsbetingelser, t ex varierande primer-probkoncentrationer. Once Q-PCR-analys och reaktionsbetingelser är optimerade, alltid genomföra en första test av en rad DNA / cDNA späd att bestämma lämplig mall koncentration. Välj utspädningsintervallet resulterar i högsta antal kopior som den optimala mall utspädning för ytterligare analyser.
För närvarande, nästa generations sekvenseringsteknologier kasta effektivt ljus på mikrobiell samhällsstruktur och funktioner i en uppsjö av miljöer 26,27,28. Men dessa datamängder ofta baserade på slutpunkten PCR-amplikon bibliotek och ger därför endast halv kvantitativa bedömningar av överflödet av särskild taxa. Därför, att förmågan att realtids-PCR-teknik målspecifika taxonomiska markörer (från högre domän ned till spänningsnivån) möjliggör effektiv validering av de resultat som nästa generations sekvensering. Dessutom har qPCR med framgång använts i kombination med andra mikrobiell ekologi molekylära metoder som stabil isogråhaj sondering (SIP) eller fylogenetiska / funktionella mikroarrayer. Kombinerades med den förra verktyget kan qPCR användas för att kvantifiera den metaboliskt aktiva samhälle 29,30. I kombination med microarray analys, ger qPCR nyckel kvantitativ tolkning av fylogenetiska markörbaserade och funktionell gen undersökningar av miljöer 31,32.
Därför används separat eller i kombination med andra (ofta processbaserade) bedömningar av ekosystemens funktion, är kvantitativ PCR ett viktigt verktyg för mikrobiella ekologer i utforskandet av den svårfångade länken mellan mikrobiella samhällen och ekosystemfunktioner.
The authors have nothing to disclose.
Denna publikation har utgått från forskning som bedrivs med ekonomiskt stöd från Natural Environment Research Council (NERC) under licensnummer NERC NE / JO11959 / 1 och Science Foundation Irland & Marie Curie Action COFUND enligt Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded till CJS och östra Academic Research Consortium (Eastern ARC).
Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
Chloroform:Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
Tryptone | Sigma | T7293 | |
Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
Ampicillin | Sigma | 59349 | |
X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
Agar | VWR | 20768.235 | |
Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
qPCR machine |