Abstract
Real Time Polymerase Chain Reaction även kallad kvantitativ PCR (q-PCR) är en allmänt använd verktyg för mikrobiell ekologi att kvantifiera gen bestånd av taxonomiska och funktionella grupper i miljöprover. Används i kombination med ett omvänt transkriptas-reaktion (RT-q-PCR), kan den också användas för att kvantifiera gentranskript. q-PCR använder sig av mycket känsliga fluorescenta detekterings kemier som tillåter kvantifiering av PCR-amplikoner under den exponentiella fasen av reaktionen. Därför är de fördomar som är förknippade med "end-point" PCR upptäcks i platåfasen av PCR-reaktionen undvikas. Ett protokoll för att kvantifiera bakteriella 16S rRNA gener och utskrifter från kustsediment via realtids-PCR tillhandahålls. Först, en metod för samtidig extraktion av DNA och RNA från kustsediment, inklusive de ytterligare åtgärder som krävs för framställning av DNA-fri RNA, beskrivs. För det andra, en steg-för-steg guide för kvantifiering av 16S rRNA gener och transcripts från de extraherade nukleinsyrorna via Q-PCR och RT-q-PCR skisseras. Detta inkluderar information om konstruktionen av DNA och RNA standardkurvor. Viktiga överväganden för användning av RT-q-PCR-analyser i mikrobiell ekologi ingår.
Introduction
Mikroorganismer är hörnstenen i biosfären körning ekosystem funktionen. Majoriteten av mikroorganismer förblir okultiverade en. Därför molekylbaserade metoder är grundläggande för att öka vår förståelse för mångfalden och funktion av mikroorganismer i miljön. Centralt för dessa tillvägagångssätt är utvinning av nukleinsyror från miljöprover och den efterföljande amplifieringen av målgener genom att använda polymeraskedjereaktion (PCR).
Det första steget i DNA / RNA-extraktion som mål att lysera cellväggarna i den mikrobiella miljön närvarande, avlägsna oönskade icke nuklein-syramolekyler (t.ex., organiska och oorganiska ämnen) och behålla DNA / RNA i lösning för vidare analys nedströms. Bland flera alternativ tillgängliga i litteraturen 2,3,4,5, bland annat en rad kommersiella utvinning kit är Griffiths metod 6 i stor utsträckning 7,8,9. Det är kostnadseffektivt och particularly väl lämpade att sediment som den använder en vulst ledande steg för att lysera celler och innehåller steg för att minimera samtidig extraktion av PCR-inhibitorer, såsom humussyror, samtidigt återvinna DNA och RNA.
Det andra steget använder polymeraskedjereaktionen (PCR) för att amplifiera mål-gener, såsom 16S rRNA taxonomiska markör, från de extraherade nukleinsyrorna. Detta tillvägagångssätt har och fortsätter att underlätta utforskningen av okaraktäriserat mikrobiell svarta lådan 10,11. Men end-point PCR-baserade metoder lider av olika begränsningar som kan snedvrida karakterisering av mikrobiella samhällen 12. För att exakt kvantifiera gen / avskrift bestånd, måste realtids-PCR, även känd som kvantitativ PCR (qPCR) användas. qPCR utnyttjar fluorescerande reporterfärgämnessystem som spårar amplikon ackumulering efter varje cykel av PCR. Detta är betydelsefullt eftersom det innebär att kvantifiering kan inträffa under den tidiga exponentiella fasen, snarareän den endpoint fasen av PCR-reaktionen, när amplikonet utbytet är fortfarande direkt proportionell mot den initiala överflödet av målgenen.
Två reportersystem används vanligen: en interkalerande nukleinsyra fläcken 13 och 5'-3 'exonukleasaktivitet hos DNA-polymeraset 14. Eftersom den förstnämnda reportersystem binder indistinctively alla dubbelsträngade DNA, kan det leda till en överskattning av målsekvensen om oönskade ospecifika amplikoner eller primerdimerer från produkter förekommer. För att kringgå detta, kan omfattande optimering av amplifiering erfordras. I det senare systemet, är mall amplifiering spåras med hjälp av en kombination av en 5 'nukleasaktivitet hos Taq-polymeras som klyver en fluorofor från en intern prob. Den här funktionen ökar analysens specificitet på grund av att användningen av ett fluorogent sond som endast binder till den komplementära målspecifik sequence mellan primerparet. Med båda kemierna kvantifiering uppnås genom bestämning av korsningspunkten (Cp), där ackumuleringen av PCR-amplikoner, såsom mätt genom en ökning i fluorescens, är signifikant över bakgrundsfluorescens.
qPCR har i stor utsträckning använts i mikrobiell ekologi att bestämma gen bestånd i olika miljöer 15. Dessutom är omvänd transkription av RNA till cDNA kombinerat med qPCR och RT-qPCR att kvantifiera genuttryck. Därför qPCR och RT-qPCR representerar snabba, effektiva metoder för kvantifiering av genen och / eller transkript nummer inom miljöprover.
Mikroorganismer i kustsediment driva olika ekosystemprocesser, inklusive mineralisering av organiskt material, nedbrytning av föroreningar och biogeokemiska cirkulationen av makronäringsämnen såsom kväve 16,17,18. Den uttömmande förståelse av dessa förändringar kräver en omfattande redovist av de bidragande mikrobiella populationer, inklusive kvantitativa uppgifter om gen och avskrift bestånd. Här presenterar vi en rad noggrant testade, strömlinjeformade och standardiserade protokoll för kvantifiering av bakteriella 16S rRNA-genen och avskrift bestånd i kustsediment. Protokollet beskriver provtagning, samtidig DNA och RNA-extraktion, DNA-fri RNA-beredning, kvalitet kontroll av extraherade nukleinsyror, generering av 16S rRNA-DNA och RNA-standarder och kvantifiering av miljöprover. Kvantitativa data från de metoder som beskrivs här behövs för att belysa mikrobiella samhällen kör kustekosystem.
Protocol
1. DNA och RNA-extraktion från marina kustsediment
- Framställning av ribonukleas (RNas) -fri material och arbetsyta
- Förbereda RNAse-free destillerat vatten (dH 2 O) genom behandling med 0,1% dietylpyrokarbonat (DEPC) och inkubera vid 37 ° CO / N. Avlägsna kvarvarande DEPC genom autoklavering dH 2 O vid 121 ° C under 15 minuter. Använd DEPC behandlade dH 2 O för att göra alla lösningar.
- Baka alla glas vid 180 ° CO / N. Ta bort plastlock och fälgar, blöta dem i en lösning av 2 M NaOH O / N, och skölj dem med DEPC-behandlat dH 2 O före användning.
- Förbered en CTAB-fosfatbuffertlösning enligt tabell 1.
- Bereda PEG-NaCl-fällning lösning enligt tabell 2.
- Rengör alla arbetsytor (dvs, bänk, mikro, rök-huva) och mikropipetter med hjälp av RNas-dekontaminerande lösning före start. Använd handskar under hela proceduren. Använd RNas-fri plasten tillsammans med mikropipett filter tips för att undvika provkorskontaminering.
- Miljöprov insamling och lagring
- Samla kust sediment vid lågvatten med en steril 50 ml Falcon-rör från de översta 2,5 cm. Samla cirka 15-20 g sediment. Stäng försiktigt locket efter provtagningen. Transport omedelbart till labbet i en kylare vid 4 ° C för omedelbar behandling.
- Homogenisera provet genom att blanda med en steril spatel och delprov 0,5 g våtvikt sediment i en 2 ml pärla slå rör. Alikvotera ytterligare replikat, flash-frysning genom att placera i flytande kväve. Lagra alikvoter vid -80 ° C. Varning: Använd skyddshandskar och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve.
Obs: Om fältet webbplatsen inte ligger nära till ett laboratorium, portion 0,5 g sediment i 2 ml sterila mikrocentrifugrör på fältet platsen. Flash-frysa rören genom att sätta dem omedelbart i liquid kväve och transport till laboratoriet. Förvara proverna vid -80 ° C fram till bearbetning.
- Co-extraktion av DNA och RNA från sediment
Obs: Följande protokoll är en modifierad version av Griffiths metod 6.- Tillsätt 500 | il CTAB-fosfatbuffert och 500 ^ il fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) till 2 ml bead-lyserande rör som innehåller 0,5 g av sediment och invertera röret 5-10 gånger för att homogenisera provet.
Varning: Utför detta steg i en drag-hood bära lämplig skyddsutrustning (dvs, laboratorierock, handskar och skyddsglasögon) vid alla tidpunkter. - Vortex vid full hastighet under 2,5 minuter. Centrifugera vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- I ett dragskåp, hood extrahera det övre vattenskiktet och överföra till ett nytt 1,5 ml sterilt mikrocentrifugrör. Hålla proverna på is, tillsätt 500 | il iskall kloroform: isoamylalkohol (24: 1).
- Invertera flera gånger tills en emulsion är visible. Centrifugera i 10 minuter vid 16.000 xg vid 4 ° C.
- I ett dragskåp, hood extrahera det övre vattenskiktet och placera den i ett nytt 1,5 ml sterilt rör. Fälla ut nukleinsyrorna genom tillsats av två volymer 30% PEG-NaCl-lösning och blanda väl.
- Inkubera på is under 2 timmar eller lämna prover vid 4 ° CO / N.
- Vid slutet av inkubationstid Centrifugera proverna vid 16.000 xg under 20 min vid 4 ° C.
Notera: En pellet kan vara synliga på botten av röret. - Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en mikropipett, se till att inte störa pelleten. Lämna omkring 10 | il av PEG-lösning i röret och tillsätt 1 ml iskall 70% etanol.
- Centrifugera i 20 minuter vid 16.000 xg vid 4 ° C. Sakta ut etanol med en mikropipett noga med att inte röra pelleten.
- Centrifugera i 5 sek och avlägsna rester av etanol med hjälp av en mikropipett. Lämna pelleten lufttorka under ca 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 50 | il DEPC-behandlatH2O Undersöka kvaliteten och utbytet av DNA / RNA med agarosgelelektrofores körs 5 fil på en 1% agarosgel 19. Dela in nukleinsyror i två portioner, 15 il för DNA och 30 | il för RNA.
- Lagra DNA vid -80 ° C tills de behövdes. Isolera RNA såsom beskrivs i nästa avsnitt.
- Tillsätt 500 | il CTAB-fosfatbuffert och 500 ^ il fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) till 2 ml bead-lyserande rör som innehåller 0,5 g av sediment och invertera röret 5-10 gånger för att homogenisera provet.
2. Beredning av RNA och kvalitetskontroll av DNA-fri RNA
- Digerering av DNA
- Tillsätt 3 | il DNas I-buffert och 1,5 | il DNAse I till 30 | j, l volym av nukleinsyror, inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Blanda DNAse Inaktive reagens genom att vortexa i 30 sekunder. Lägga 4,8 pl av lösningen till provet. Inkubera vid RT i 5 min, ibland knacka på botten av rören för att blanda lösningen.
- Centrifugera vid 10.000 xg under 90 sek vid RT, överför supernatanten (RNA) till ett nytt rör, noga med att inte överföra fällning som kan hämma nedströms reaktioner.
- check RNA kvalitet
- Tillsätt 2 pl RNA till 18 l sterilt RNAse-fri dH 2 O för att späda 1:10.
- I separata PCR-reaktioner, tillsätts 1 | il av ren eller 1:10 spädning av RNA till en steril 0,5 ml PCR-rör. Lägga PCR-reaktionskomponenter för att amplifiera 16S rRNA-genen enligt tabell 3. Inkludera en "positiv" (eg., DNA som extraherats från en ren bakteriekultur), ett "PCR-inhibitor" kontroll (dvs., 1 ni av positiv ren kultur DNA och 1 | il av ren extraherade RNA) och en "negativ" kontroll av sterilt RNAse-fri dH 2 O.
- Ställa in termocykler med följande förstärkningsparametrar: 95 ° C 5 min, (95 ° C 30 sek, 57 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min) x 35 cykler, 72 ° C 10 min.
- Köra 10% av PCR-produkten på en 1% agarosgel vid 85 V under 40 min. Upprepa behandlingen DNAse I om en PCR-produkt bildas i miljö RNA prover.
- Tillsätt 2 pl RNA till 18 l sterilt RNAse-fri dH 2 O för att späda 1:10.
3. Framställning av First Strand cDNA från RNA
- Tillsätt reagens enligt tabell 4 till en RNAse / DNAse fri 0,2 ml PCR-rör.
- Inkubera provet vid 65 ° C 5 min. Placera på is i minst 1 min och sedan inkubera vid 25 ° C under 10 min.
- Till samma rör lägga de reagens som anges i tabell 5.
- Inkubera provet vid 55 ° C under 50 min. Inaktivering av reaktionen vid 72 ° C under 10 min.
- Store cDNA vid -20 ° C fram till användning.
4. Kvantitativ PCR
- Generation av DNA-standarder för qPCR
- Amplifiera bakteriell 16S rRNA-sekvens 20 (eller någon annan sekvens av intresse) från genomiskt DNA extraherat från ren kultur med q-PCR-primrar (1369F & 1492R 21).
- Rena PCR-produkten med användning av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Klona renade PCRprodukten i en 3'-T-överhäng kloningsvektorsystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Transformera vektorn innehållande PCR infoga i Escherichia coli JM 109 kompetenta celler enligt tillverkarens instruktioner.
- Plattan 50 pl av transformation på ampicillin (100 | ig / ml), X-gal (20 | ig / ml) och IPTG (0,5 mM) Luria Bertani agar-plattor (trypton 10 g / L, jästextrakt 5 g / L, NaCl 10 g / L, agar 15 g / L). Inkubera O / N vid 37 ° C.
- Välja en enda positiv vit transformant från plattan. Inokulera den positiva transformant i 50 ml LB-buljong innehållande 100 ng / ml ampicillin och inkubera O / N skakning vid 250 rpm vid 37 ° C.
- Från O / N-kulturen, isolera och rena plasmiden med användning av ett kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Linjärisera plasmiden med användning av ett lämpligt restriktionsenzym som är kapabel att skära plasmiden en gång (t.ex. EcoRI).
- Bestämma koncentrationen av plasmid-DNA genom absorbans vid 260 nm med användning av en spektrofotometer 19.
Anmärkning: Alternativt kan riktigheten i kvantifiering förbättras genom användning av ett fluorescerande DNA-bindande färgämne som används i samband med en fluorometer. - Sekvens plasmiden för in för att bekräfta storleken på målet i baser. Beräkna mängden (dvs., i procent) av insatt DNA i plasmiden (t.ex., i ett 3000 bp vektor, är ett 123 bp DNA-fragment 3,9% av totalt DNA) och multiplicera det med den koncentration som erhållits i 4.1.10, för att bestämma den DNA-koncentrationen av målet (infoga).
- Använd följande ekvation för att beräkna kopior av mål per il:
belastning / 54067 / 54067eq1.jpg "/> - Beräkna Target Molekylvikt (TMW) genom att multiplicera antalet baspar i mål-DNA med den genomsnittliga molekylvikten för dubbelsträngat DNA (dsDNA, 660 Dalton per baspar).
- Späd mål-DNA i ett område från 10 10 till 10 2 kopior med 2 | il av DNA och 18 | il av steril dH 2 O. Blanda varje späd väl och spinn ner en kort stund innan nästa utspädning.
- Generering av RNA-standardkurva för qPCR
- Från steg 4.1.5, screena ett antal vita kolonier (cirka 5) genom koloni-PCR 19 med användning av mål-bakåtriktad primer (dvs R1492) och den främre vektorplasmid primer M13F.
Obs: Denna kombination av primers kommer att förstärka insatserna klonade i rätt sensorientering med en T7-promotor uppströms. - Rena PCR-produkten med användning av ett kommersiellt kit efter tillverkarens instruktioner. Kvantifiera det renade PCR-produkt vid 260 nm med användning av en spektrofotometer.
- Tillsätt 200 ng av PCR-produkt i en slutvolym av 20 | j, l med 7,5 mM av varje ribonukleotid, en T7-reaktionsbuffert och en T7-polymerasenzym för in vitro-transkriptionsreaktionen.
- Inkubera reaktionen under 4 h vid 37 ° C. Lägga en enhet av RNas-fritt DNas I till reaktionen, inkubera i 15 min vid 37 ° C för att avlägsna DNA-mall.
- Återvinna den transkriberade RNA genom etanolutfällning 19 in vitro och kvantifiera RNA utbyten med användning av en fluorimeter eller genom absorbans vid 260 nm.
- Beräkna avskrift antal per il av RNA. Tillsätt antalet baspar i mål-RNA (t.ex. 123 baser) till längden på T7-promotorn (153 baser) och multiplicera med den genomsnittliga molekylvikten för RNA, 340 Dalton per bas.
- Tillsätt 500 ng kvantifierade mål-RNA till ett omvänt transkriptas (RT) reaktion som beskrivs i avsnitt 3. Serie späda cDNA som beskrivs i 4.1.13 för användningsom standardkurvan.
- Från steg 4.1.5, screena ett antal vita kolonier (cirka 5) genom koloni-PCR 19 med användning av mål-bakåtriktad primer (dvs R1492) och den främre vektorplasmid primer M13F.
- Realtids-PCR
- Tina miljö DNA / cDNA prover, standarder och qPCR reagenser på is. Skydda fluorogena sonden från ljus.
- Späd normerna för standardkurvan som anges i 4.1.14. Gör 1:10 utspädningar av miljö DNA / cDNA från snyggt att 10 -3 genom att tillsätta 2 pl prov till 18 l sterilt dH 2 O.
- Gör en huvudblandning reaktionen för det totala antalet reaktioner plus 10% enligt tabell 6 (primers och sond) och tabell 7 (reaktionsblandning). Blanda väl och kort centrifugering.
- Lägg 19 il huvudblandning och 1 pl mall (standard, miljöprov eller vatten för negativ kontroll) till varje brunn i en 96-väl optisk qPCR plattan. Utför varje reaktion (standarder, miljöprover och negativa kontroller) i tre exemplar.
- Täck 96-brunnar med en q-PCR optiska omslaget. Centrifugera plattan kortfattat. laddaplattan i värmeblocket i qPCR maskinen och stäng locket.
- Öppna qPCR Manager. Klicka på "protokoll fliken", klicka på "Skapa ny", lägg till följande förstärkning villkor: 3 min 95 ° C, (10 sek 95 ° C, 30 sek 60 ° C) x 40 cykler. Ställ provvolym till 20 l, klicka på "OK" och spara protokollet.
- Klicka på "Plate" -fliken. Under "redigera valt" klicka "väljer fluorofor", lägga till rapporten färgämne för lämplig sond, t ex fluorescein. Klicka på "OK".
- Markera brunnar innehållande normerna, välj "standard" från menyn "provtyp". Klicka på "replikera serien" för att ändra "replikera storlek" till 3, klicka på "Apply". Klicka på "utspädningsserie" för att lägga beräknade startkoncentration för standard 1, anger spädningsfaktorn (10), välj "minska" eller "ökande" enligt den ordning standardkurvan sattestill plattan. Klicka på "Apply".
- Markera väl positioner som innehåller de okända proverna, välj "okända" från "provtyp" rullgardinsmenyn. Klicka på "replikera serien", och ändra "replikera storlek" till 3. Klicka på "Apply". Redigera prov namn under "provnamn". Upprepa proceduren för ingen mall kontroller (NTC) brunnar.
- Klicka på "OK" på plattan redigeringsrutan och spara filen. Klicka på "start run".
- Efter avslutad körning, kommer fönstret dataanalys öppnas. Klicka på "kvantifiering fliken" för att visa standardkurvan, standardkurva beskrivningar (Tabell 8) och förstärknings tomter.
- Klicka på "kvantifiering data" fliken för Cp värden och motsvarande utgångs mängd gen (SQ) av okända prover. Exportera tabell till kalkylprogram om det behövs.
- Multiplicera gen bestånd från okända prover av utspädningsfaktorn, mängden sediment extracTed från och den totala volymen nukleinsyror eluerades i att erhålla genkopior per gram våtvikt sediment.
Obs: Eluera DNA från 0,5 g av sediment i 50 ul, utspädd 1/10, tillsätt 1 pl som mall för en Q-PCR-reaktion; beräkna genkopior g -1 sediment genom att multiplicera genkopior il av DNA-x utspädningsfaktor x elueringsvolym x 2.
Representative Results
Extraktionen av god kvalitet DNA och RNA från sediment är det första steget i att kvantifiera gen- och transkript abundances. En framgångsrik extraktionsutbyte tydliga DNA- och RNA-band, såsom anges i figur 1 för prov AC, där skarpa 23S och 16S rRNA-band är synligt i tillägg till den högmolekylära genomiskt DNA-band.
Figur 1. DNA / RNA-extraktion. Typiska resultat från DNA / RNA-extraktion från tre exemplar (ABC) 0,5 g kustsediment. 5 pl av DNA / RNA kördes på en 1,4% agaros vid 85 V under 40 min. En molekylär markör i 10,037-200 bp intervall användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En qPCR reaktionsprotokoll beskrivs targeting 16S rRNA-DNA. För 16S rRNA utskrifter ersätta standard curve och mall med cDNA. Som okända prov kvantifieras mot standardkurvan, är det absolut nödvändigt att säkerställa att standardkurvan är av god kvalitet. Figur 2 visar framställningen av (A), standardkurvor och miljö DNA utspädningar, (B), amplifiering av standardkurvan och miljöprover (C) omvandling av standardkurva till en linjär regression och beräkning av genen kopietal. När en 10-faldig utspädningsintervallet är korrekt förberedda och förstärks en 3,3 cykel skillnaden mellan varje standardspäd ses (det tar 3,3 cykler för en tiofaldig ökning i mall på 100% förstärkning effektivitet) (Figur 2Bi). Standardkurvor beskrivningar, inklusive R 2 värdena 0,99 och PCR-effektivitet inom intervallet 90-110% (figur 2C) önskas. Det är viktigt att rapportera Cp värden från kontroll utan templat (NTC) om närvarande. Om detta inträffar en Cp cutoff för standarder och okända prov 3,3 cykler (<em> dvs en log gånger) högre än Cp värde NTC tas ut 20 (figur 2Cii). Okänd mall utvinns ur sediment DNA kvantifierades från snyggt, 10 -1, 10 -2 och 10 -3 utspädningar (B). Den nätta prov inte förstärka, Cp värden på 10 -1 till 10 -3 utspädningar var 24,12, 26,02 och 28,40 respektive. NTC Cp var 30,5, en NCT cutoff av 27,2 infördes. Konvertera gen bestånd till g -1 våtvikt sediment resulterade i 2,5 x 10 7 och 7,1 x 10 7 till 10 -1 och 10 -2 respektive för utspädningsintervallet. 10 -3 utspädning Cp var under NTC cutoff, och därför inte används. I detta fall 10 -2 valdes som den optimala mall utspädning.
Figur 2. 16S rRNA-genen QPCR förstärkning av standarder och miljö DNA extraherat från kustsediment. Framställning av (A) i) DNA-standardkurva och ii) miljö DNA späd för qPCR förstärkning, (B) qPCR förstärkning av i) DNA standardkurva och ii) miljöprover, Cp för varje prov visas. (C) i) Linjär regression av standardkurva med standardkurva deskriptorer, ii) beräkning av genen bestånd från miljöprover. NTC:. Negativ Mall Kontroll klicka god här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Belopp |
| CTAB | 5 g |
| K 2 HPO 4 x3H 2 O | 2,58 g |
| KH 2 PO 4 | 0,1 g |
| NaCl | 2,05 g |
| dH 2 O | upp till 100 ml |
Tabell 1. Framställning av CTAB-fosfatbuffert.
| Reagens | Belopp |
| PEG 6000 | 30 g |
| NaCl | 9,35 g |
| dH 2 O | upp till 100 ml |
| Notera: add PEG 6000 långsamt under måttlig upphettning och omröring av 50 ml dH2O | |
Tabell 2. Framställning av PEG-NaCl-fällning-lösning.
| Reagens | Belopp |
| Outspädd RNA / 1:10 utspätt RNA | 1,0 | il |
| 10x PCR-buffert | 5,0 | il |
| dNTPs 10 mM | 1,0 | il |
| 63F framåtriktad primer | 1,0 | il |
| CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC | |
| 518R omvänd primer | 1,0 | il |
| ATT ACC GCG GCT GCT GG | |
| Taq-polymeras | 0,4 | il |
| RNAse-fri dH 2 O | 40,6 | il |
Tabell 3. DNA-fri RNA kvalitetskontroll PCR Master Mix.
| Reagens | Belopp |
| RNA | 0,5-5 ^ g |
| dNTPs 10 mM | 1 pl |
| Omvänd primer 10 pM / slumpmässiga hexamerer 50 pM | 1 pl |
| DEPC-H2O | Upp till 13 pl |
Tabell 4. cDNA-syntesreaktionsblandning A.
| Reagens | Belopp |
| buffert 5x | 4 | j, l |
| DTT | 1 pl |
| RNas-inhibitor | 1 pl |
| omvänt transkriptas | 1 pl |
Tabell 5. cDNA-syntesreaktionsblandning B.
| Mål | primer namn | Sekvens | Glödgning T (° C) | Referens |
| 16S rRNA bakterier | Bact1369F | CGG TGA ATA CGT TCY CGG | 56 | Suzuki et al. 2000 19 |
| Prok1492R | GGW TAC CTT GTT ACG ACT T | |||
| TM1389F (sond) | CTT GTA CAC ACC GCC CGT C |
| Reagens | Belopp |
| 2x Master Mix | 10 pl |
| Framåtriktad primer (10 pM) | 0,8 | il |
| Omvänd primer (10 | iM) | 0,8 | il |
| Prob (10 ^ M) | 0,4 | il |
| Vatten | 7,0 | il |
| slutlig volym | 19 | il |
Tabell 7. Real time PCR-reaktionsblandningen.
| deskriptor | Betydelse |
| Korrelationskoefficient (R 2) | Ett mått på lineariteten hos standardkurvan. Idealt bör det vara R 2 = 1. Värdet på R 2 = 0,98-0,99 är acceptabla. |
| Lutning (α) | Ett mått på reaktionens effektivitet. Helst bör motsvara -3,32. Värde i området mellan -3,58 och -3,1. |
| Effektivitet (= 10 (-1 / lutning -1)) | Om det är 100%, mallarna fördubblas efter varje värmecykel under exponentiell förstärkning. En god effektivitet intervallet är mellan 90 och 110%. |
| Y Intercept (β) | Den teoretiska gränsen för detektion av reaktionen. Även om det inte används för att kvantifiera reaktionskänslighet är det viktigt när man jämför olika standardkurvor av samma mål. |
Tabell 8. QPCR reaktions deskriptorer.
Discussion
Kombinationen av DNA / RNA-extraktion med qPCR ger en snabb, noggrann, relativt kostnadseffektiv metod för känslig kvantifiering av genen och transkript bestånd från en rad miljöprover, såsom kustsediment.
Den initiala nukleinsyra extraktion är det kritiska steget för att säkerställa en representativ bild av den mikrobiella miljön närvarande uppnås 22. Ett antal begränsningar måste beaktas för extraktion protokoll: a) att uppnå total cellysering, b) sam-extraktion av hämmande föreningar (t.ex. humussyror eller polyphenolics), c) kontaminerande DNA i RNA-fraktion, d) snabb nedbrytning av extraherade nukleinsyror vid förvaring. Försiktighetsåtgärder måste vidtas för att kringgå dessa begränsningar. Till exempel, har särskild omsorg vidtas för att säkerställa att utvinningen av nukleinsyror är optimerad för provtypen (t.ex., sediment, jord, avloppsvatten, etc.). Signifikanta förbättringar i nukleinsyra utbytet och kvaliteten för både DNA och RNA kan uppnås genom att utföra preliminära experiment 23. För att minimera effekten av hämmande föreningar på PCR-baserade applikationer 24, testa ett intervall av spädningar från det extraherade DNA och RNA. För att kringgå den snabba nedbrytningen av det extraherade DNA / RNA från flera frys-tö-cykler och undvika eventuell förlust av genetisk information, lagra multipla små volym alikvoter vid -80 ° C.
När noggrant utformade, qPCR är en robust, mycket reproducerbar och känslig metod. Noterbart kan metoder för förstärkning och standard kurvkonstruktion som beskrivs i detta protokoll anpassas för varje gen mål av intresse, däribland andra fylogenetiska markörer (dvs archaeal 16S rRNA, svamp 18S rRNA) eller gener som är involverade i viktiga funktioner i miljön. Kända begränsningar i användningen av qPCR är: a) generering av reproducerbar hög kvalitet standard kurva för absolut kvantifiering, b) val av primer / prober och optimering av q-PCR-analys förhållanden c) användning av låg kvalitet / klippta nukleinsyror, d) valet av arbetsutspädning av DNA / RNA för att undvika hämning . Dessutom måste det anses att qPCR teknik ger gen / avskrift bestånd som inte får motsvara kroppar: detta är särskilt fallet när 16S och 18S rRNA gener är riktade, eftersom mikroorganismer har olika antal kopior av det ribosomala genen i sitt genom 25.
Dålig kvalitet standardkurvor kommer att resultera i felaktig kvantifiering av genen av intresse. Det är bra att lagra en lager av hög standard koncentrations i små portioner som kan göras färska standardkurvor. Förvara inte standardkurvor, alltid färska utspädningar från ett lager av den högsta koncentrationen varje gång. För korrekt kvantifiering av miljöprover se de olika koncentrationer av standard kurva sträcker sig över förväntade Cp värdena för okända prover. När kvantifiera transkript, konstruera standardkurvan från RNA inte dubbelsträngat DNA. När det är möjligt, bör kvantifiering av prover som skall jämföras direkt slutföras inom en enda analys för att undvika inter-assay variation 20. Detta kanske inte alltid är möjligt. Därför är det tillrådligt att ha en slumpmässig undergrupp av prover replike mellan analyser för att jämföra genprodukter abundances genereras mellan analyser. Ett brett urval av primer och sond set är för närvarande tillgängliga för qPCR inriktning mikrobiell taxa och funktionella grupper 15. Noggranna överväganden krävs när man väljer dessa för att säkerställa både maximal täckning och specificitet för målgruppen. Om reaktionseffektiviteten av en qPCR analysen är inte tillfredsställande, börjar felsökning med att testa olika termiska cykel förhållande (glödgning tid och / eller temperatur) och / eller reaktionsbetingelser, t ex varierande primer-probkoncentrationer. Once Q-PCR-analys och reaktionsbetingelser är optimerade, alltid genomföra en första test av en rad DNA / cDNA späd att bestämma lämplig mall koncentration. Välj utspädningsintervallet resulterar i högsta antal kopior som den optimala mall utspädning för ytterligare analyser.
För närvarande, nästa generations sekvenseringsteknologier kasta effektivt ljus på mikrobiell samhällsstruktur och funktioner i en uppsjö av miljöer 26,27,28. Men dessa datamängder ofta baserade på slutpunkten PCR-amplikon bibliotek och ger därför endast halv kvantitativa bedömningar av överflödet av särskild taxa. Därför, att förmågan att realtids-PCR-teknik målspecifika taxonomiska markörer (från högre domän ned till spänningsnivån) möjliggör effektiv validering av de resultat som nästa generations sekvensering. Dessutom har qPCR med framgång använts i kombination med andra mikrobiell ekologi molekylära metoder som stabil isogråhaj sondering (SIP) eller fylogenetiska / funktionella mikroarrayer. Kombinerades med den förra verktyget kan qPCR användas för att kvantifiera den metaboliskt aktiva samhälle 29,30. I kombination med microarray analys, ger qPCR nyckel kvantitativ tolkning av fylogenetiska markörbaserade och funktionell gen undersökningar av miljöer 31,32.
Därför används separat eller i kombination med andra (ofta processbaserade) bedömningar av ekosystemens funktion, är kvantitativ PCR ett viktigt verktyg för mikrobiella ekologer i utforskandet av den svårfångade länken mellan mikrobiella samhällen och ekosystemfunktioner.
Acknowledgments
Denna publikation har utgått från forskning som bedrivs med ekonomiskt stöd från Natural Environment Research Council (NERC) under licensnummer NERC NE / JO11959 / 1 och Science Foundation Irland & Marie Curie Action COFUND enligt Grant Number 11 / SIRG / B2159awarded till CJS och östra Academic Research Consortium (Eastern ARC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma | 40718 | Toxic, open under chemical hood |
| cetrimonium bromide (CTAB) | Sigma | 52365 | Irritant, open under chemical hood |
| potassium phosphate dibasic | Sigma | RES20765 | |
| potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol pH 8 | Sigma | P2069 | Equilibrate at pH 8 before using |
| Chloroform : Isoamylalcohol | Sigma | 25666 | |
| sodium chloride | VWR | 1.06404.0500 | |
| polyethylenglycol 6000 | VWR | 528877-100 | |
| Ethanol Molecular Grade | Sigma | E7148 | |
| Lysing Matrix E tubes | MP Biomedical | 116914050 | |
| Turbo DNAse | Ambion | AM1907 | |
| Taq polymerase | Sigma | D1806 | |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | |
| SuperScript III | Life Technologies | 18080044 | |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies | 10777019 | |
| RNAse/DNAse free 0.2 ml PCR tubes | Sarstedt | 72.985.002 | |
| SureCleanPlus | Bioline | BIO-37047 | |
| pGEM Easy T Vector | Promega | A1360 | |
| E. coli JM109 competent cells | Promega | L2005 | |
| Tryptone | Sigma | T7293 | |
| Yeast Extract | Sigma | 70161 | |
| Ampicillin | Sigma | 59349 | |
| X-Gal | Bioline | BIO-37035 | |
| IPTG | Bioline | BIO-37036 | |
| Agar | VWR | 20768.235 | |
| Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| Qubit | Life Technologies | Q33216 | |
| Quant-IT DNA HS Assay | Life Technologies | Q-33120 | |
| Quant-IT RNA HS Assay | Life Technologies | Q32855 | |
| MEGAshortscript kit | Ambion | AM1354 | |
| TaqMan SensiFast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84002 | |
| qPCR machine |
References
- Epstein, S. S.
- Zhou, J., Bruns, M. A., Tiedje, J. M. DNA recovery from soils of diverse composition. Appl. Environ. Microbiol. 62, 316-322 (1996).
- Miller, D. N., Bryant, J. E., Madsen, E. L., Ghiorse, W. C. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures from soil and sediments samples. Appl. Environ. Microbiol. 65 (11), 4715-4724 (1999).
- Burgmann, H., Pesaro, M., Widmer, F., Zeyer, J. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil. J. Microbiol. Methods. 45 (1), 7-20 (2001).
- Hurt, R. A., et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 67, 4495-4503 (2001).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O'Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Martins, G., et al. Structure and activity of lacustrine sediment bacteria involved in nutrient and iron cycles. FEMS Microbiol. Ecol. 77 (3), 666-679 (2011).
- Kuffner, M., et al. Effects of season and experimental warming on the bacterial community in a temperate mountain forest soil assessed by 16S rRNA gene pyrosequencing. FEMS Microbiol. Ecol. 82 (3), 551-562 (2011).
- Tatti, E., et al. Influences of over winter conditions on denitrification and nitrous oxide-producing microorganism abundance and structure in an agricultural soil amended with different nitrogen sources. Agric. Ecosyst . Environ. 183, 47-59 (2014).
- Giovannoni, S. J., Britschgi, T. B., Moyer, C. L., Field, K. G. Genetic diversity in the Sargasso Sea bacterioplankton. Nature. 345, 60-62 (1990).
- Ward, D. W., Weller, R., Bateson, M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms a natural community. Nature. 345, 63-65 (1990).
- Suzuki, M. T., Giovannoni, S. J. Bias caused by template annealing in the amplification of mixture of 16S rRNA genes by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 62, 625-630 (1996).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22, 130-138 (1997).
- Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H. Detection of Specific Polymerase Chain Reaction Product by Utilizing the 5' 3' Exonuclease Activity of Thermus aquaticus DNA Polymerase. PNAS. 88, 7276-7280 (1991).
- Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 2-20 (2009).
- Park, S. J., Park, B. J., Rhee, S. K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments. Extremphiles. 12 (4), (2008).
- Urakawa, H., Yoshida, T., Nishimura, M., Ohwada, K. Characterization of depth-related population variation in microbial communities of a coastal marine sediment using 16S rDNA-based approaches and quinone profiling. Environ. Microbiol. 2, 542-554 (2008).
- Smith, C. J., Dong, L. F., Wilson, J., Stott, A., Osborn, A. M., Nedwell, D. B. Seasonal variation in denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonia process rates and corresponding key functional genes along an estuarine nitrate gradient. Front. Microbiol. 6, 542 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. 205 (2001).
- Smith, C. J., Nedwell, D. B., Dong, L. F., Osborn, A. M. Evaluation of Quantitative Polymerase Chain Reaction (Q-PCR) based approaches for determining gene copy and gene transcript numbers in environmental samples. Environ. Microbiol. 8 (5), 804-815 (2006).
- Suzuki, M. T., Taylor, L. T. DeLong E.F., Quantitative analysis of small-subunit rRNA genes in mixed microbial population via 5'-nuclease assays. Appl. Environ. Microbiol. 66, 4605-4614 (2000).
- Luna, G. M., Dell'Anno, A., Danovaro, R. DNA extraction procedure: a critical issue for bacterial diversity assessment in marine sediments. Environ. Microbiol. 8 (2), 308-320 (2005).
- Lever, M. A., Torti, A., Eickenbursch, P., Michaud, A. B., Šantl-Temkiv, T., Jørgensen, B. B. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front. Microbiol. 6, 476 (2015).
- Lloyd, K. G., MacGregor, B. J., Teske, A. Quantitative PCR methods for RNA and DNA in marine sediments: maximizing yield while overcoming inhibition. FEMS Microbol. Ecol. 72, 144-151 (2010).
- Klappenbach, J. A., Dumbar, J. M., Schmidt, T. M. rRNA Operon copy number reflects ecological strategies of bacteria. App. Environ. Microbiol. 66 (4), 1328-1333 (2000).
- Shi, Y., Tyson, G. W., Eppley, J. M., DeLong, E. F. Integrated metatrascriptomic and metagenomics analyses of stratified microbial assemblages in the open ocean. ISME J. 5, 999-1013 (2011).
- Howe, A. C., Jansson, J. K., Malfatti, S. A. Tringe S.G., Tiedje J.M., & Brown C.T. Tackling soil diversity with the assembly of large, complex metagenomes. PNAS. 111 (13), 4904-4909 (2014).
- Klaedtke, S., et al. Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages. Environ. Microbiol. , (2015).
- Lueders, T., Wagner, B., Claus, P., Friedrich MW, Stable isotope probing of rRNA and DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi and protozoa in oxic rice field soil). Environ. Microbiol. 6, 60-72 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Bürgmann, H., et al. Transcriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate (DMSP). Environ. Microbiol. 9 (11), 2742-2755 (2007).
- He, J. Z., et al. Geochip: a comprehensive microarray for investigating biogeochemical ecological and environmental processes. ISME J. 1, 67-77 (2007).
