Introduction
Sequencing en genotypering op basis van studies, met inbegrip van Genome-Wide Association Studies (GWAS), kandidaat locus studies, en diep-sequencing studies, hebben veel genetische varianten die statistisch worden geassocieerd met een ziekte, trek, of fenotype geïdentificeerd. Anders dan vroege voorspellingen meeste van deze varianten (85-93%) zijn in niet-coderende gebieden en niet de aminozuursequentie van eiwitten 1,2 niet veranderen. De functie van deze niet-coderende varianten interpreteren en die de biologische mechanismen ze op de geassocieerde ziekte heeft eigenschap of fenotype bewezen uitdagende 3-6. genexpressie - We hebben een algemene strategie om de moleculaire mechanismen die varianten verwijzen naar een belangrijk tussenproduct fenotype te identificeren ontwikkeld. Deze leiding is speciaal ontworpen om modulatie van TF binding door genetische varianten te identificeren. Deze strategie combineert computationele benaderingen en moleculair biologische technieken om te voorspellenbiologische effecten van kandidaat-varianten in silico en controleer deze voorspellingen empirisch (figuur 1).
Figuur 1:.. Strategische aanpak voor de analyse van niet-coderende genetische varianten stappen die niet zijn opgenomen in de gedetailleerde protocol in verband met dit manuscript zijn grijs Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In veel gevallen is het belangrijk om te beginnen uitbreiding van de lijst van varianten die allemaal in hoge linkage-onevenwicht (LD) met elkaar verbonden statistisch variant omvatten. LD is een maat voor niet-willekeurige associatie van allelen op twee verschillende chromosomale posities, die kan worden gemeten door de r 2 7 statistiek. r 2 is een maat voor de linKage onevenwichtigheid tussen twee varianten, met een r 2 = 1 aangeeft perfecte verbinding tussen twee varianten. Allelen hoge LD blijken co-segregeren op het chromosoom in voorouderlijke populaties. Huidige genotypering arrays niet alle bekende varianten in het menselijk genoom. In plaats daarvan gebruik maken van de LD in het menselijk genoom en omvatten een subset van de bekende varianten die als proxies voor andere varianten binnen een bepaalde regio van LD 8. Aldus kan een variant zonder biologische gevolg worden geassocieerd met een bepaalde ziekte omdat het in LD met de causale variant-de variant met een zinvolle biologisch effect. Procedureel, is het raadzaam om te zetten van de nieuwste versie van de 1000 genomen projecteren 9 variant call-bestanden (VCF) in binaire bestanden compatibel zijn met Plink 10,11, een open-source tool voor het gehele genoom vereniging analyse. Vervolgens worden alle andere genetische varianten met LD r 2> 0,8 bij elke ingang genetische variant kunnen worden geïdentificeerd als kandidaten. Het is belangrijk om de overeenkomstige referentiegroep voor dit stap- bijvoorbeeld als een variant geïdentificeerd bij personen van Europese afkomst, de data van onderwerpen van soortgelijke afkomst moeten worden gebruikt voor LD expansie.
LD expansie resulteert vaak in tientallen kandidaat varianten, en het is waarschijnlijk dat slechts een klein deel daarvan bijdragen aan ziektemechanisme. Vaak is onhaalbaar experimenteel onderzoeken elk van deze varianten afzonderlijk. Daarom is het nuttig om de duizenden publiekelijk beschikbare functionele genomische datasets te benutten als een filter om voorrang te geven aan de varianten. Zo heeft de ENCODE consortium 12 duizenden ChIP-seq experimenten waarin de binding van TF en co-factoren en histon markeringen uitgevoerd in diverse contexten, samen met chromatine bereikbaarheidsgegevens van technologieën zoals DNase-seq 13, ATAC -seq 14 en FAIRE-seq 15. databases en webservers zoals de UCSC Genome Browser 16, Roadmap Epigenomics 17, Blueprint Epigenome 18, Cistrome 19 en Remap 20 bieden gratis toegang tot de gegevens die door deze en andere experimentele technieken in een breed scala van celtypen en voorwaarden. Wanneer er te veel varianten experimentele onderzoeken, kunnen deze gegevens worden gebruikt om prioriteit die zich binnen waarschijnlijk regulerende gebieden desbetreffende cel- en weefseltypen. Verder wanneer een variant binnen een ChIP-seq piek voor een specifiek eiwit, deze gegevens kunnen potentiële leads geven over de specifieke TF (s) of co-factoren waarvan de binding zou kunnen beïnvloeden.
Vervolgens worden de resulterende prioriteit varianten experimenteel gescreend om voorspelde genotype-afhankelijke eiwit binding te valideren met behulp van EMSA 21,22. EMSA meet de verandering in de migratie van de oligo op een niet-reducerende TBE gel. Fluorescent gemerkte oligo wordt geïncubeerd met denucleaire lysaat en binding van nucleaire factoren de beweging van de oligo vertragen op de gel. Op deze wijze oligo dat meer kernfactoren is gebonden zal een sterker fluorescentiesignaal op scantoepassingen. Met name EMSA geen voorspellingen over de specifieke eiwitten waarvan de binding zal worden beïnvloed vereisen.
Zodra varianten zijn geïdentificeerd die zich binnen het voorspelde regelende gebieden en kunnen verschillend binding kernfactoren zijn computationele werkwijzen toegepast om de specifieke TF (n) waarvoor bindende ze invloed kunnen voorspellen. Wij geven de voorkeur aan CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UniProbe 26 en JASPAR 27 gebruiken. Zodra de kandidaat-TF's worden geïdentificeerd, kunnen deze voorspellingen specifiek worden getest met behulp van antilichamen tegen deze TF's (EMSA-supershifts en DAPA-Westerns). Een EMSA-supershift bij de bereiding een TF-antilichamen voor de nucleaire lysaat en oligo. Een positief resultaat in een EMSA-supershift is represented een verdere verschuiving in de EMSA band, of een verlies van de band (besproken in referentie 28). In de complementaire DAPA, een 5'-gebiotinyleerde oligo duplex die de variant en 20 basenparen flankerende nucleotiden zijn geïncubeerd met nucleaire lysaat uit relevante type (s) cel nucleaire factoren die specifiek binden de oligo vangen. De duplex-oligo nucleaire factor complex geïmmobiliseerd op streptavidine microkralen in een magnetische kolom. De gebonden nucleaire factoren worden rechtstreeks verzameld via elutie 29,48. Bindende voorspellingen kunnen dan worden beoordeeld door een Western blot met gebruik van antilichamen specifiek voor het eiwit. In gevallen waarin er geen duidelijke voorspellingen, of te veel voorspellingen, de eluties van variant pull-downs van de DAPA experimenten kan een proteomics kern worden gestuurd om de kandidaat-TF's te identificeren met behulp van massaspectrometrie, die vervolgens kunnen worden gevalideerd met behulp van deze eerder beschreven werkwijzen.
In de rest van de article, is de gedetailleerde protocol voor het EMSA en DAPA analyse van genetische varianten voorzien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van oplossingen en reagentia
- Bestel aangepaste DNA oligonucleotide probes voor gebruik in EMSA en DAPA.
- Om niet-specifieke eiwit binding te verminderen, het ontwerpen van korte oligo (tussen 35-45 basenparen (bp) in de lengte) 30, en plaats de variant van belang direct in het centrum geflankeerd door de 17 bp endogene genoomsequentie. Voor EMSA oligo's, voeg een 5 'fluorofoor. Voor DAPA oligo's, voeg een 5 'biotine tag.
- Bestel zowel de sense streng en de omgekeerde complement streng. Als alternatief orde duplex (pre-gegloeid) oligo's. Bij het benoemen van de oligo's, baseren de nomenclatuur op een gevestigde verwijzing genoom.
Let op: "Risk" en "non-risk" aanwijzing kan zijn ziekte en projectspecifieke, terwijl de "referentie" en "non-reference" zijn meer universeel relevant. - Bij aankomst van de oligos kort spin down de inhoud en resuspendeer in nuclease-vrij water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μ; M. Store gesuspendeerd voorraad bij -20 ° C. Bescherm oligo gelabeld met een fluorofoor van licht door het wikkelen met aluminiumfolie.
| Naam | Volgorde |
| rs76562819_REF_FOR | GTAATGCCTTAATGAGAGAG Een GTTAGTCATCTTCTCACTTC |
| rs76562819_REF_REV | GAAGTGAGAAGATGACTAAC T CTCTCTCATTAAGGCATTAC |
| rs76562819_NONREF_FOR | GTAATGCCTTAATGAGAGAG G GTTAGTCATCTTCTCACTTC |
| rs76562819_NONREF_REV | GAAGTGAGAAGATGACTAAC C CTCTCTCATTAAGGCATTAC |
Tabel 1: Voorbeeld EMSA / DAPA oligonucleotide ontwerp om een SNP testen differentiële binding. "REF" staat voor de referentieallel, terwijl "NONREF" staat voor de niet-referentieallel. "FOR" staat voor de voorwaartse streng, terwijl "REV" geeft aan zijn complement. De SNP wordt gezien in rood.
- Bereid cytoplasmatische extractie (CE) buffer met een eindconcentratie van 10 mM HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl en 0,1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.
- Bereid nucleaire extractie (NE) buffer met een eindconcentratie van 20 mM HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl en 1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.
- Bereid annealing buffer met een eindconcentratie van 10 mM Tris (pH 7,5-8,0), 50 mM NaCl en 1 mM EDTA in gedeïoniseerd water.
2. Voorbereiding van nucleair lysaat van gekweekte cellen
Opmerking: Dit experimentele protocol werd geoptimaliseerd met behulp B-lymfoblastoïde cellijnen, maar is getest in verscheidene ongerelateerde hechtende / ophanging cellijnen en werkt universeel.
- Culture B-lymfoblastoïde cellen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum en 1 x antibioticum-antimycoticum bevattende 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 250 ng / ml amfotericine B.
- Zaad op een afstand van 200,000-500,000 levensvatbare cellen / ml en incubeer kolven bij 37 ° C met 5% kooldioxide in een rechtopstaande positie ontlucht of losse doppen.
Opmerking: De groei van B-lymfoblastoïde cellen vertraagt wanneer ze meer dan 1.000.000 cellen / ml te bereiken. Breken cel ontploffing door en neer te pipetteren meerdere malen en cellen opnieuw 200,000-500,000 cellen / ml in een snelle groei te handhaven.
- Zaad op een afstand van 200,000-500,000 levensvatbare cellen / ml en incubeer kolven bij 37 ° C met 5% kooldioxide in een rechtopstaande positie ontlucht of losse doppen.
- Was gekweekte cellen tweemaal met 10 ml ijs- koude met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), het afsluiten bij 4 ° C, 300 g gedurende 5 minuten en verwijder PBS via aspiratie.
- Aantal cellen met een hemocytometer en resuspendeer pellet met 1 ml ijskoude PBS per 10 7 cellen.
Opmerking: Als bijvoorbeeld lyseren van 2 x 10 7 </ Sup> cellen, hersuspenderen in 2 ml PBS. - Aliquot 1 ml tot 1,5 ml microcentrifugebuizen zodat elke buis bevat 10 7 cellen in PBS. Centrifugeer bij 3300 xg gedurende 2 min 4 ° C en zuig af PBS.
- Voor gebruik, voeg 1 mM dithiothreitol (DTT), 1x fosfataseremmer en 1x proteaseremmer een werkvoorraad van CE buffer. Resuspendeer celpellet met 400 gl CE buffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten.
- Voeg 25 ul van 10% Nonidet P-40 en meng door pipetteren. Centrifugeer bij 4 ° C, maximale snelheid gedurende 3 minuten. Giet en gooi de supernatant.
- Voor gebruik, voeg 1 mM DTT, 1x fosfataseremmer en 1x proteaseremmer een werkvoorraad van NE buffer. Resuspendeer celpellet met 30 ul van NE buffer en meng door vortexen.
- Incubeer bij 4 ° C in een buis rotator of op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer 3300 xg gedurende 2 min 4 ° C.
- Verzamel de heldere bovenstaande vloeistof (nucleair lysaat) en hoeveelheid voordat u bij -806, C meerdere vries-dooicycli dat het eiwit kan verminderen voorkomen. Laat een 10 ul monster te eiwitconcentratie te meten met behulp van de bichoninic acid test (BCA) 31.
3. Elektroforetische Mobility Shift Assay (EMSA)
- Bereid Oligo Working Stock en EMSA Gel.
- Als oligo's werden besteld in duplex, ontdooien van de 100 uM voorraad en verdund 1: 2000 in gloeien buffer om een 50 nm werkvoorraad te bereiken.
- Als oligo enkelstrengs werden besteld, dooi de 100 pm voorraden en verdund 1:10 in gloeien buffer tot 100 nm werkvoorraden te realiseren. Combineer 100 pi van 100 nM complement streng oplossing met elkaar in een microcentrifugebuis.
- Plaats in een verwarmingsblok bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Zet de verwarmingsblok en laat de oligo langzaam afkoelen tot kamertemperatuur gedurende ten minste één uur voor gebruik.
- Pre-run de EMSA Gel.
- Verwijder de schuif uit een prefab 6% TBE gel en spoel onder gedemineraliseerd water meerdere malen aan een buffer van de putten te verwijderen. Bereid 1 L 0,5X TBE buffer door het toevoegen van 50 ml 10x TBE tot 950 ml gedeïoniseerd water.
- Monteer de gel-elektroforese apparatuur en controleer op lekken door het vullen van de binnenkamer met 0.5x TBE buffer. Als er geen buffer lekt in de buitenste kamer, vul de buitenste kamer ruwweg tweederde van de weg.
- Pre-run de gel bij 100 V gedurende 60 min.
- Spoel elk putje met 200 pi 0,5x TBE buffer.
- Bereid Binding Buffer Master Mix.
- Bereid 10x bindingsbuffer met een eindconcentratie van 100 mM Tris, 500 mM KCI, 10 mM DTT; pH 7,5 in gedemineraliseerd water.
- In een microcentrifugebuis, maakt een master mix bestaande uit reagentia voor alle reacties (10 pl 10x bindingsbuffer, 10 pl DTT / polysorbaat, 5 pl poly d (IC) en 2,5 ul zalmsperma DNA; Tabel 2). Bereid een additionele 10%om rekening te houden volume verlies als gevolg van pipetteren.
| Reagens | Eindconc. | Rxn # 1 | Rxn # 2 | Rxn # 3 | Rxn # 4 |
| ultrapuur water | 20 pl vol. | 13,5 pl | 11.98 pi | 13.5μl | 11.98 pi |
| 10x Binding Buffer | 1x | 2 gl | 2 gl | 2 gl | 2 gl |
| DTT / TW-20 | 1x | 2 gl | 2 gl | 2 gl | 2 gl |
| Zalmsperma DNA | 500 ng / gl 0,5 pl | 0,5 pl | 0,5 pl | 0,5 pl | |
| 1 ug / ul Poly d (IC) | 1 ug | 1 pi | 1 pi | 1 pi | 1 pi |
| Nuclear Extract (5,26 ug / ul) | 8 ug | - | 1,52 pl | - | 1,52 pl |
| NE Buffer | 1,52 pl | - | 1,52 pl | - | |
| Referentieallel oligo | 50 fmol | 1 pi | 1 pi | - | - |
| Niet-referentieallel oligo | 50 fmol | - | - | 1 pi | 1 pi |
Tabel 2: Voorbeeld EMSA reactie Setup. De tabel toont een voorbeeld EMSA testen van de hypothese dat er genotype-afhankelijke binding van TF aan een specifiek SNP.
- Add nuclease-vrij water aan elke microcentrifugebuis zodat het uiteindelijke volume na toevoeging van alle reagentia wordt 20 pl.
- Voeg de juiste hoeveelheid (5,5 pl) van master mix aan elke microcentrifugebuis.
- Voeg 8 ug nucleaire lysaat op de juiste microcentrifugebuizen. Omvat buizen met de oligo zonder nucleair extract als negatieve controles (bv Tabel 2, RXN # 1 en # 3 rxn).
Opmerking: De optimale hoeveelheid lysaat per reactie moet proefondervindelijk worden bepaald door titratie. In het algemeen titreren verschillende 2-10 ug lysaat volstaat. - Voeg 50 fmol van oligo om de juiste microcentrifugebuizen. Flick te mengen en kort draaien de inhoud naar de bodem van de buis. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Als attempting een supershift Incubeer het lysaat mengsel antilichaam gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur vóór de toevoeging van oligos. Het wordt aanbevolen om 1 ug van een chip-grade antilichaam voor het beste resultaat. - Voeg 2 pl 10x Orange geladen kleurstof aan elke microcentrifugebuis. Pipet op en neer om te mengen.
- Laad de monsters in de pre-run 6% TBE gel door pipetteren op en neer om te mengen en dan het verdrijven van elk monster in een aparte goed. Voer de gel bij 80 V tot de oranje kleurstof 2/3 heeft gemigreerd naar 3/4 van de weg naar beneden de gel. Dit moet ongeveer 60-75 minuten duren.
- Verwijder de gel uit de plastic cassette door nieuwsgierige hem open met een gel mes en plaats de gel in een container met 0,5% TBE buffer om te voorkomen dat het uitdroogt.
- Plaats de gel op het oppervlak van een infrarood chemiluminescentie en beeldvormingssysteem, waarbij u eventuele luchtbellen of verontreinigingen die het beeld verstoren elimineren.
- Met behulp van het scansysteem software, klikt u op het tabblad "Acquire"en selecteer "tekenen Nieuwe" naar een doos om het gebied dat aangeeft waar de gel op het oppervlak van de scanner.
- In de sectie "Channels" van het tabblad "Acquire", selecteert u het kanaal dat overeenkomt met de golflengte van de fluorofoor tag op de oligo. In de sectie "Scanner", klikt u op "voorbeeld" naar een lage kwaliteit preview-scan te krijgen. Pas de scan gebied door de blauwe doos de verworven voorvertoning omlaag naar het gedeelte van de gel rond te slepen af te beelden.
Opmerking: Bijvoorbeeld, bij gebruik van oligo gelabeld met een 700 nm fluorofoor, zorg ervoor dat de "700 nm" kanaal is geselecteerd voor het scannen. - In de sectie "Scan Controls", selecteer de "84 uM" resolutie optie en de "Medium" kwaliteit optie. Stel de scherpstelling offset halve dikte van de gel. Opmerking: Bijvoorbeeld, een 1 mm gel een 0,5 mm nadruk afwijking gebruikt.
- In de sectie "Scanner", klikt u op "Start" naar bEgin de scan.
Opmerking: Tijdens het scannen, de helderheid, contrast en kleuren kunnen vaak handmatig afhankelijk van de fabrikant van het scansysteem aangepast. - Nadat de scan is voltooid, selecteert u het tabblad "Beeld" en klik op "Draaien of spiegelen" in het hoofdstuk "Create" om de richting te corrigeren. Sla het image-bestand door te klikken op "Export" in het hoofdmenu en selecteer dan "Single afbeelding te bekijken."
4. DNA Affinity Purification Assay (DAPA)
- Voorbereiding van 5 uM Oligo werken Stock.
- Als oligo's werden besteld in duplex, ontdooien van de 100 uM voorraad en verdund 1:20 in gloeien buffer tot een 5 uM werkvoorraad te bereiken.
- Als oligo enkelstrengs werden besteld, dooi de 100 pm voorraden en verdund 1:10 in gloeien buffer tot 10 urn werkvoorraden te realiseren. Combineer 10 pi van 10 uM complementaire strengen met elkaar. Plaats in een verwarmingsblok bij 95 ° C5 minuten. Zet de verwarmingsblok en laat de oligo langzaam afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Voordat Verwarm de bindingsbuffer lage stringentie wasbuffer, hoge stringentie wasbuffer en elutiebuffer tot kamertemperatuur.
Opmerking: Een eindconcentratie van 50 ng / ml Poly kan d (IC) aan de bindingsbuffer, lage stringentie wasbuffer en hoge stringentie wasbuffer toegevoegd om mogelijke niet-specifieke binding van eiwitten aan het oligo verminderen. - Bereid de binding mengsels voor elke variant.
- Meng 1 deel nucleaire lysaat met 2 volumes bindingsbuffer.
Opmerking: De benodigde hoeveelheid lysaat moet proefondervindelijk worden bepaald door variabele overvloed aan TF. Met behulp van tussen de 100-250 ug nucleaire lysaat per kolom volstaat in de meeste gevallen. - Voeg 1x fosfatase inhibitor, 1x proteaseremmer, en 1x binden versterker (optioneel) en meng door flicking de buis meerdere malen.
Opmerking: 100X bindingenhancer bestaat uit 750 mM MgCl2 en 300 mM ZnCl2. Voeg binding enhancer indien de binding van TF aan DNA afhankelijk cofactoren of reductiemiddelen. Als deze informatie niet bekend is, voegt de binding versterker. - Voeg 10 gl 5 uM gebiotinyleerd capture DNA (50 pmol) aan elke respectieve binding mengsel. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Incubatietijd en kan variëren afhankelijk van het TF. De optimale waarden moeten experimenteel worden bepaald.
- Meng 1 deel nucleaire lysaat met 2 volumes bindingsbuffer.
- Voeg 100 ul streptavidine microkralen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voor elke oligo probe getest, plaats een bindende kolom in de magnetische scheider. Plaats een microcentrifugebuis recht onder elke kolom binden en 100 gl bindingsbuffer toepassing op de kolom te spoelen.
- Pipetteer de inhoud van elke bindende mengsel in afzonderlijke kolommen en de vloeistof volledig stromen door de kolom in de microcentrifugebuis alvorens verder te gaan. Zorg ervoor dat de kolommen label met de variant oligo dat werd gebruikt in de binding mengsel. Label het doorstroomkanaal samples en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de lage stringentie-wassingen verzamelen.
- Breng 100 ul van lage stringentie wasbuffer aan de kolom; wachten tot de kolom reservoir leeg is. Herhaal wassen 4x. Label de low-wassing monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen om de hoge stringentie wasbeurten verzamelen.
- Breng 100 pi van hoge stringentie wasbuffer aan de kolom; wachten tot de kolom reservoir leeg is. Herhaal wassen 4x. Label de hoge stringentie monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de pre-elutie verzamelen.
- Voeg 30 ul van natief elutiebuffer aan de kolom en laat gedurende 5 minuten. Label de pre-elutie monsters en vervangen door nieuwe microcentrifugebuizen de elutie verzamelen.
Opmerking: Dit is niet het gebonden eiwit te elueren; het wast de andere high-stringentebuffer uit de kolom en vervangt deze door elutiebuffer de doeltreffendheid van de elutie maximaliseren. - Voeg een extra 50 pi inheemse elutiebuffer om de gebonden TF elueren. Voor een hogere opbrengst maar minder geconcentreerde eluaat, voeg nog eens 50 pl elutiebuffer natieve en laat het doorstroomkanaal.
Opmerking: Analyseer elutie monsters met massaspectrometrie om de identiteit van de gebonden TF 32 bepalen. Daarna controleren de proteomische resultaten door natrium dodecyl sulfiet polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gevolgd door een Western blot 33. Als massaspectrometrie niet beschikbaar is, voert een zilverkleuring behulp standaardtechniek plaats van een Western blot om de grootte van het eiwit (en) waarop genotype-afhankelijke binding te bepalen. Gebruik deze informatie om een beperking van de lijst van de voorspelde TF's uit de computationele aanpak beschreven in de inleiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit hoofdstuk worden representatieve resultaten van wat te verwachten op voorwaarde bij het uitvoeren van een EMSA of DAPA, en de variabiliteit met betrekking tot de kwaliteit van het lysaat wordt gekenmerkt. Bijvoorbeeld is gesuggereerd dat invriezen en ontdooien eiwitmonsters meerdere keren kan leiden tot denaturatie. Om de reproduceerbaarheid van EMSA analyse verkennen in de context van deze "bevriezen-ontdooien" cycli, twee 35 bp oligo verschillen op een genetische variant geïncubeerd met een enkele partij nucleaire lysaat dat werd ontdooid en opnieuw ingevroren voor het aangegeven bedrag . keren Figuur 2 toont dat invriezen en ontdooien dit B-lymfocyt nucleaire extract tot 5 maal heeft schijnbaar geen effect op de integriteit van de eiwitten; echter stabiliteit van kerneiwit afhankelijk van monsters en moet derhalve worden getest op iedere afzonderlijke cellijn gebruikt. Het is ook mogelijk de variatie van verschillende batch prepar hebbenties van de nucleaire lysaten. Of deze variatie het gevolg is van het stadium van de celcyclus voorafgaand aan lysis, passage nummer cel, of andere factoren, is het belangrijk om EMSA resultaten repliceren met verschillende batches lysaat te zorgen voor reële resultaten.
Bovendien is het belangrijk om de signaal-ruisverhouding voor de EMSA optimaliseren. Een belangrijke variabele is de oligo concentratie. De hoeveelheid oligo (5-300 fmol) werd getitreerd om te beoordelen hoe verschillende hoeveelheden oligo invloed op het signaal (Figuur 3). Een toename in de intensiteit van de band tot 100 fmol van oligo werd waargenomen. Na dit punt het signaal plateaus suggereert 100 fmol is de optimale hoeveelheid oligo EMSA voor deze reactie.
Tenslotte wordt een representatieve waarde van één van onze gepubliceerde studies een deel van de in dit manuscript beschreven strategie verschaft (figuur 4). in th34 is studie hebben we aangetoond dat de lupus-geassocieerde risico allel rs6590330 verhoogt binding van STAT1, een transcriptiefactor die betrokken is bij zowel synergetische activering en remming van genexpressie stroomafwaarts van het Type 1 IFN receptorcomplex 35. In dit voorbeeld werd eerst geïdentificeerd door STAT1 DAPA gevolgd door proteomische analyse met hoge prestatie vloeistofchromatografie, gekoppeld met massaspectroscopie (DAPA-MS). Een DAPA-Western blot werd gebruikt om de TF geïdentificeerd van proteoomanalyse (STAT1) bevestigen en bevestigen dat de gefosforyleerde vorm van STAT1 werd binding aan het niet-referentiebeeld (lupus-risico) oligo. Deze figuur toont hoe de verschillende assays deze strategie kan worden gebruikt om differentiële binding van transcriptiefactor identificeren een niet-coderende variant.
Figuur 2: Analyse van de reproduceerbaarheiden de gevolgen van vries-dooi cycli EMSA resultaten. Oligo's met de referentie (R) of niet-referentie (NR) allel van een genetische variant werden gebruikt om hetzelfde preparaat lysaat na meerdere cycli van bevriezen en ontdooien sonde. (Lys: Lysate). Elke baan bevat de vrije probe onder in de gel (blauwe pijl). Binding van TF aan de oligo kan worden gezien als een band in de bovenste helft van de gel (rode pijl). Bands vervat in de onderste helft van de gel (zie beugel) zijn niet-specifiek zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Beoordeling van het effect van verschillende concentraties oligo Verschillende concentraties van oligo's werden gebruikt om een enkel preparaat nucleaire lysaat sonde. Fluorescent signaal toeneemt met toegenomen hoeveelheden oligo, wat aangeeft dat de oligo het beperkende reagens. Het signaal plateaus op de 100-300 fmol rijstroken, waarbij de hoeveelheid eiwit wordt de beperkende reagens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het lupus risico allel van rs6590330 verhoogt STAT1 binding, zoals vastgesteld door DAPA-MS STAT1 en pSTAT1 vertonen hogere binding aan oligo's die de risico allel rs6590330 vergeleken met de niet-risico allel.. -Biotine gemerkte oligo werden met Epstein-Barr-virus getransformeerde B-cel nucleair extract. Eiwitten gebonden aan de oligo werden opgenomen met DAPA. Eiwitten werden vervolgens gescheiden door SDS-polyacrylamide gelelektroforese en gedetecteerd met behulp van anti-pSTAT1(A) of anti-STAT1 (B). M: Marker. NR: oligo die de niet-risico-allel van rs6590330; R: oligo met de risico allel van rs6590330; Mutant: oligo met een verstoorde vermeende STAT1 bindingsplaats stroomafwaarts van rs6590330; Cellysaat: nucleair extract van B-cellen. De relatieve intensiteiten van de banden worden onder elke band is aangegeven. Resultaten zijn representatief voor vier experimenten; terwijl alle experimenten aangetoond van STAT1 binding aan de probe met het risico allel in 2/4 experimenten geen STAT1 of pSTAT1 werd gedetecteerd in het immunoprecipitaat van de niet-oligo risico, terwijl zowel in het immunoprecipitaat van het risico oligo werden gedetecteerd. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie 34. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel vooruitgang in sequencing en genotypering technologieën zijn sterk verbeterd ons vermogen om genetische varianten geassocieerd met de ziekte te identificeren, is ons vermogen om de functionele mechanismen beïnvloed door deze varianten begrijpen achter. Een belangrijke bron van het probleem is dat veel ziekte-geassocieerde varianten liggen in n on-coderende gebieden van het genoom, die waarschijnlijk van invloed moeilijker te voorspellen mechanismen die genexpressie. Hier presenteren we een protocol gebaseerd op de EMSA en DAPA technieken waardevolle moleculaire instrumenten voor het identificeren genotype-afhankelijke TF bindingsgebeurtenissen die waarschijnlijk bijdragen aan de functie van vele niet-coderende varianten. Hoewel deze twee technieken zijn uitgebreid gebruikt in het verleden nog maar recentelijk aangepast voor genetische variant analyse van TF binding. Beyond TF kan EMSA ook worden gebruikt om het effect van genetische varianten op RNA bindende eiwitten met slechts kleine aanpassingen aan het protocol 36 analyseren.
ove_content "> Het protocol hierin voorgestelde eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren,. echter bepaalde onderdelen vereisen extra overwegingen voorafgaand aan experimenten Ten eerste is het belangrijk om een eerste lijst van varianten bezwarende genereren door het uitvoeren strikt statistische analyses Een fout in deze stap. kunnen ontsporen alle daaropvolgende analyses, zoals vele varianten nucleaire lysaat verschillend kunnen binden niet bijdragen tot het risico ziekte. Bovendien kan het gebruik van functionele genomics data uitgevoerd pertinente celtypen cruciaal kan als irrelevant celtypen tot de generatie van valse positieve TF binding voorspellingen. Momenteel is de meest gebruikte functionele genomische bronnen zijn ENCODE 12 en Roadmap Epigenomics 17. Aanvullende informatie met betrekking tot genexpressie niveaus in cel-types aan een ziekte van belang relevant kunnen worden verkregen uit andere bronnen, zoals ImmGen 37, BioGPS 38, 39, en SNPsea 20. bijvoorbeeld, zoals resources kan worden gebruikt om TF binding voorspellingen filter om alleen die TFs die uitgedrukt worden in relevante celtypen.Het is ook belangrijk om de restricties van in vitro experimenten, zoals EMSA en DAPA overwegen. Met name is het nodig om afzonderlijke experimenten met nucleaire lysaat preparaten herhalen valse negatieven te verminderen. Bovendien kan een succesvolle EMSA-supershift presenteren als een verdere verschuiving in de EMSA band, in welk antilichaam bindt aan de TF of een verlies van band, in welk antilichaam blokkeert de TF DNA bindend domein. In beide scenario's, waaronder een isotype controle antilichaam en / of een antilichaam aan een ander TF is nuttig bij de bevestiging van de specificiteit van de supershift. Een andere overweging bij het uitvoeren van een supershift is of DTT / polysorbaat in de reactie omvatten. DTT / polysorbaat stabiliseert de ladingskleurstof waardoor meer kwantificatie van ongebonden DNA; het kan echter ook minder disulfidebindingen antilichamen resulterening in het falen van EMSA-supershift. Het wordt aanbevolen om reacties met en zonder DTT / polysorbaat bij een poging om een complex supershift proberen. De optimale hoeveelheid poly d (IC) en zalmsperma DNA per reactie moet experimenteel worden bepaald door titratie. In het algemeen, titreren een bereik van 1-6 ug Poly d (IC) en 50-500 ng zalmsperma is voldoende. Een nuttige positieve controle voor DAPA gaat met behulp van een consensus sequentie voor een TF met een goed gekarakteriseerd bindend motief (verkregen uit databases zoals CIS-BP 23 of Factorbook 40) en het runnen van een westerse met een antilichaam specifiek voor dat TF. Voor beide testen, kan gecodeerde oligo worden gebruikt om aan te tonen dat waargenomen binding specifiek is voor de oligo's plaats.
Zowel de EMSA en DAPA technieken experimentele beperkingen. Zo is bindingsaffiniteit tussen TF en DNA beïnvloed grotendeels door de bufferomstandigheden. Idealiter buffercondities de endogene conditio nabootsenns van de kern om optimale binding. Voor EMSA, ondeskundig buffer omstandigheden resulteren in een zwakke band of het verlies van een band volledig. Voor DAPA kunnen niet-ideale omstandigheden veroorzaken TF (en) wordt geëlueerd gedurende de wasstappen. Daarom heeft elke test is alleen effectief bij het identificeren TF-oligo binding onder bepaalde omstandigheden buffer. De universeel bruikbare bufferomstandigheden worden in het bovenstaande protocol. Een tweede beperking is dat de experimentele resultaten van EMSA en DAPA methoden geven weinig informatie over de mechanismen waardoor TF's binden aan de oligo's. TF's kunnen direct naar oligo binden of worden aangeworven door andere factoren. Daarom is het belangrijk om de oligo sequenties computationeel analyseren om te voorspellen hoe TFS kan binden aan oligo en verifiëren deze voorspellingen experimenten. Bijvoorbeeld kan een specifiek bindende sequentie zijn gemuteerd of bindingspartner kan experimenteel worden uitgeput. Ten slotte de hoeveelheid extract gebruikt moet worden getitreerd voor elk experiment to verwerven van een optimaal resultaat. Teveel lysaat kan de TF-oligo binding te verzadigen en verdoezelen eventuele differentiële binding tussen risico en niet-risico-allelen. Voor aanvullende probleemoplossing, kan de lezer verwijzen naar verschillende uitstekende beoordeling en wijze manuscripten 30,41,42.
Naast de hier beschreven assays, zijn verschillende in vivo assays beschikbaar om de rol van varianten in levende cellen (Figuur 1, onder) verdere studie. Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door allel-specifieke kwantitatieve polymerase chain reacties (ChIP-qPCR) studies kunnen worden uitgevoerd om vast te stellen of het differentieel binding waargenomen binnen de in vitro testen wordt gerepliceerd in levende cellen 34. Als bijvoorbeeld cellen heterozygoot voor een variant van belang worden gebruikt, qPCR experimenten kan het verschil verrijking tussen de twee allelen van TF chromatine immunogeprecipiteerd detecteren. ChIP vereist specifieke ChIP-grade antilichamen; however Als ChIP-grade TF antilichamen beschikbaar zijn, transfecteren cellen met een vlag hebben TF is een effectief alternatief 43. Bovendien kan het effect van differentiële bindend streefcijfer genexpressie worden onderzocht door middel van kwantitatieve trait loci (eQTL) analyse expressie in relevante celtypen met lokaal verzamelde expressie gegevens van genotypering cellen of publiekelijk beschikbare middelen zoals die opgesteld door Genevar 44. Luciferase reporter assays kunnen ook worden gebruikt om de mate waarin differentiële binding van het eiwit beïnvloedt genexpressie verkennen. Dergelijke bepalingen kunnen worden aangepast om, ongeacht of de varianten in een promotor, enhancer of repressor regio 45-47 werken. Tenslotte genoom-editing technologieën zoals CRISPR / Cas9 48, kan worden gebruikt om cellijnen die alleen verschillen in één variant, die van vitaal belang voor het bevestigen oorzaak genereren. Dergelijke technologieën kan aanzienlijke vermindering van de experimentele variantie betw waargenomenEen cellijnen afgeleid van genetisch diverse onderwerpen, omdat functionele uitlezingen analyseren genexpressie of een andere ziekte tussenproduct fenotype kan worden uitgevoerd op de bewerkte cellijn, en in vergelijking met niet-bewerkte cellijnen.
Het belangrijkste voordeel van het gepresenteerde is dat het eenvoudig en snelle detectie van genotype-afhankelijke TF binding. Door voorrang te geven de sleutel genetische varianten, kan verdere experimenten worden ontworpen om hun biologisch effect te identificeren en aan te tonen hun causaliteit. Met name kan dit protocol worden toegepast om een ziekte of fenotype geassocieerd variant geïdentificeerd uit GWAS of fijnkartering onderzoeken. Een grote, groeiende schat aan genetische gegevens en lijsten van statistisch geassocieerde genetische varianten is al beschikbaar. In de meeste gevallen is de biologische mechanismen die statistisch verband van deze varianten is niet duidelijk. De strategie die in dit voorstel zorgt voor nauwkeurige functionele interpretatie van de vele niet-coderende disease-geassocieerde varianten. Dergelijke kennis is essentieel voor de volledige opheldering van de moleculaire mechanismen die elk genetisch bepaalde ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl, for CE buffer |
| HEPES (1 M) | Fisher Scientific | 15630-080 | For CE and NE buffer |
| EDTA (0.5M), pH 8.0 | Life Technologies | R1021 | For CE, NE, and annealing buffer |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | NaCl, for NE buffer |
| Tris-HCl (1M), pH 8.0 | Invitrogen | BP1756-100 | For annealing buffer |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher Scientific | MT21040CM | PBS, for cell wash |
| DL-Dithiothreitol solution (1 M) | Sigma | 646563 | Reducing agent |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 87786 | Prevents catabolism of TFs |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | Prevents dephosphorylation of TFs |
| Nonidet P-40 Substitute | IBI Scientific | IB01140 | NP-40, for nuclear extraction |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | For measuring protein concentration |
| Odyssey EMSA Buffer Kit | Licor | 829-07910 | Contains all necessary EMSA buffers |
| TBE Gels, 6%, 12 Wells | Invitrogen | EC6265BOX | For EMSA |
| TBE Buffer (10x) | Thermo Scientific | B52 | For EMSA |
| FactorFinder Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-318 | Contains all necessary DAPA buffers |
| Licor Odyssey CLx | Licor | Recommended scanner for DAPA/EMSA | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contains 10,000 units/ml of penicillin, 10,000 µg/ml of streptomycin, and 25 µg/ml of Fungizone® Antimycotic |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | FBS, for culture media |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 22400-071 | Contains L-glutamine and 25 mM HEPES |
References
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Ward, L. D., Kellis, M. Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease. Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).
- Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges. Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).
- Zhang, F., Lupski, J. R. Non-coding genetic variants in human disease. Hum Mol Genet. , (2015).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Slatkin, M. Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future. Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).
- Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822 (2012).
- 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).
- Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4, 7 (2015).
- Purcell, S., et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Crawford, G. E., et al. Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS). Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
- Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes. Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).
- Liu, T., et al. Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies. Genome Biol. 12 (8), R83 (2011).
- Griffon, A., et al. Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape. Nucleic Acids Res. 43 (4), e27 (2015).
- Staudt, L. M., et al. A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).
- Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).
- Weirauch, M. T., et al. Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).
- Ward, L. D., Kellis, M. HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).
- Boyle, A. P., et al. Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB. Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).
- Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).
- Mathelier, A., et al. JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).
- Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).
- Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay. Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).
- LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from: http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910 (2014).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2014).
- Wijeratne, A. B., et al. Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).
- Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. J. Vis. Exp. (84), (2014).
- Lu, X., et al. Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression. Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).
- Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. Complex roles of Stat1 in regulating gene expression. Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).
- Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230 (2014).
- Heng, T. S., Painter, M. W. Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells. Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).
- Wu, C., et al. BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 10 (11), R130 (2009).
- Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).
- Wang, J., et al. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).
- Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
- Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from: http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx (2014).
- Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis. Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).
- Yang, T. -P., et al. Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies. Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).
- Fort, A., et al. A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster. Blood. 117 (1), 276-282 (2011).
- Solberg, N., Krauss, S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).
- Rahman, M., et al. A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A. Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).
- Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
