La detección de funcional no codificante-variantes genéticas Uso de movilidad electroforética Shift ensayo (EMSA) y el ADN afinidad Precipitación Ensayo (DAPA)

Summary

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

Abstract

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Introduction

Secuenciación y genotipado basado en estudios, incluyendo estudios de genoma completo (GWAS Association), estudios candidato locus, y profundo de secuenciación de los estudios, han identificado muchas variantes genéticas que están estadísticamente asociados con una enfermedad, rasgo o fenotipo. Contrariamente a las predicciones iniciales, la mayoría de estas variantes (85-93%) se localizan en regiones no codificantes y no cambian la secuencia de aminoácidos de las proteínas de ^1,2. Interpretación de la función de estas variantes no codificantes y la determinación de los mecanismos biológicos que los conectan a la enfermedad asociada, rasgo, o fenotipo ha demostrado ser un desafío ^3-6. Hemos desarrollado una estrategia general para identificar los mecanismos moleculares que enlazan variantes a un fenotipo intermedio importante – la expresión génica. Esta tubería está específicamente diseñado para identificar la modulación de la unión por variantes genéticas TF. Esta estrategia combina los enfoques computacionales y técnicas de biología molecular destinadas a predecirefectos biológicos de las variantes candidatos in silico, y verificar estas predicciones empíricamente (Figura 1).

Figura 1:.. Enfoque estratégico para el análisis de los pasos no codificantes de variantes genéticas que no están incluidos en el protocolo detallado asociado a este manuscrito están sombreados en gris Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En muchos casos, es importante comenzar mediante la ampliación de la lista de variantes para incluir a todos los de alta desequilibrio de unión (LD) con cada variante estadísticamente asociado. LD es una medida de asociación no aleatoria de los alelos en dos posiciones cromosómicas diferentes, que se puede medir por el r ² Estadística ^7. r ² es una medida de la linKage desequilibrio entre dos variantes, con una unión perfecta r ² = 1 denota entre dos variantes. Alelos en alto LD se encuentran a co-segregar en el cromosoma a través de poblaciones ancestrales. matrices de genotipos actuales no incluyen todas las variantes conocidas en el genoma humano. En su lugar, se aprovechan de la LD dentro del genoma humano e incluyen un subconjunto de las variantes conocidas que actúan como representantes de otras variantes dentro de una región particular del LD ^8. Por lo tanto, una variante sin ninguna consecuencia biológica puede estar asociado con una enfermedad en particular, ya que es en LD con la variante de la causal variante con un efecto biológico significativo. Del procedimiento, se recomienda para convertir la última versión de los 1.000 genomas Proyecto ⁹ archivos variante llamada (VCF) en archivos binarios compatibles con PLINK ^10,11, una herramienta de código abierto para el análisis de asociación de genoma completo. Posteriormente, todas las demás variantes genéticas con LD r ^2> 0,8 con cada entrada va genéticaRiant puede ser identificado como candidatos. Es importante la utilización de la población de referencia apropiada para este paso- por ejemplo, si una variante fue identificada en sujetos de ascendencia europea, los datos de los sujetos de ascendencia debe emplearse la misma para la expansión LD.

expansión LD a menudo resulta en variantes de candidatos docenas, y es probable que sólo una pequeña fracción de estos contribuyen a mecanismo de la enfermedad. A menudo, no es factible para examinar experimentalmente cada una de estas variantes de forma individual. Es por lo tanto útil para aprovechar los miles de conjuntos de datos de genómica funcional públicamente disponibles como un filtro para priorizar las variantes. Por ejemplo, el consorcio ENCODE ¹² ha realizado miles de experimentos chip-ss que describen la unión de TFS y co-factores, y las marcas de las histonas en una amplia gama de contextos, junto con los datos de la cromatina accesibilidad de las tecnologías tales como DNasa-ss ^13, ATAC -seq ¹⁴ y ss ^Faire-15. DatabASES y servidores web, tales como la UCSC Genome Browser ^16, Hoja de Ruta Epigenómica ^{17, 18} Epigenoma Blueprint, Cistrome ¹⁹ y ²⁰ de RECONFIGURACIÓN proporcionan acceso libre a los datos producidos por estas y otras técnicas experimentales a través de una amplia gama de tipos y condiciones de las celdas. Cuando hay demasiadas variantes para examinar experimentalmente, estos datos se pueden utilizar para dar prioridad a los situados dentro de las regiones reguladoras probables en los tipos de células y tejidos pertinentes. Además, en los casos en que es una variante dentro de un pico de chip-ss para una proteína específica, estos datos pueden proporcionar pistas potenciales en cuanto a la TF (s) específico o co-factores cuya unión podría estar afectando.

A continuación, las variantes resultantes prioridad son examinados experimentalmente para validar la unión usando EMSA ^21,22 proteína genotipo dependiente predicho. EMSA mide el cambio en la migración de la oligo en un gel de TBE no reductor. oligo marcado con fluorescencia se incuba con ellisado nuclear, y la unión de factores nucleares retardará el movimiento del oligo en el gel. De esta manera, oligo que se ha unido factores más nucleares presentará como una señal fluorescente más fuerte sobre la exploración. En particular, la EMSA no requiere predicciones acerca de las proteínas específicas cuya unión se verán afectados.

Una vez que se identifican las variantes que se encuentran dentro de las regiones reguladoras predichos y son capaces de factores nucleares diferencialmente de unión, se emplean métodos computacionales para predecir el TF (s) específico cuya unión podrían afectar. Nosotros preferimos utilizar CIS-BP ^23,24, RegulomeDB ^25, Uniprobe ²⁶ y ²⁷ JASPAR. Una vez que se identifican candidato TFS, estas predicciones pueden ser probados específicamente el uso de anticuerpos contra estos TFS (EMSA-supershifts y DAPA-Oeste). Un EMSA-supershift implica la adición de un anticuerpo específico-TF al lisado nuclear y oligo. Un resultado positivo en un EMSA-supershift es represented como un cambio adicional en la banda de EMSA, o una pérdida de la banda (revisado en referencia ^28). En la DAPA complementaria, un dúplex de oligo 5 'biotinilado que contiene la variante y la 20 pares de bases que flanquean nucleótidos se incuban con lisado nuclear de tipo de célula relevante (s) para capturar cualquier factores nucleares se unen específicamente a los oligos. El complejo del factor nuclear-duplex oligo es inmovilizado por estreptavidina microperlas en una columna magnética. Los factores nucleares unidas se recogieron directamente a través de la elución ^29,48. predicciones de unión pueden ser evaluados por una transferencia de Western usando anticuerpos específicos para la proteína. En los casos en que no hay predicciones obvias, o demasiadas predicciones, las eluciones de variantes desplegables de los experimentos DAPA se pueden enviar a un núcleo de la proteómica para identificar TFS candidatos utilizando la espectrometría de masa, que posteriormente se pueden validar el uso de estos descritos anteriormente métodos.

En el resto de la article, se proporciona el protocolo detallado para el análisis EMSA y DAPA de variantes genéticas.

Protocol

1. Preparación de soluciones y reactivos Ordenar sondas de oligonucleótidos de ADN personalizados para su uso en la EMSA y la DAPA. Para reducir la proteína de unión no específica, diseñar oligos cortos (entre 35-45 pares de bases (pb) de longitud) 30, y colocar la variante de interés directamente en el centro, flanqueado por su secuencia genómica endógena 17 pb. Para oligos EMSA, añadir un 'fluoróforo 5. Para oligos DAPA, añadir una etiqueta 5 'con biotina. O…

Representative Results

En esta sección, los resultados representativos de lo que cabe esperar se proporcionan al realizar una EMSA o DAPA, y la variabilidad en cuanto a se caracteriza la calidad de lisado. Por ejemplo, se ha sugerido que la congelación y descongelación muestras de proteínas varias veces puede dar lugar a la desnaturalización. Con el fin de explorar la reproducibilidad del análisis EMSA en el contexto de estos ciclos de "congelación-descongelación", dos 35 oligos pb que difier…

Discussion

A pesar de los avances en las tecnologías de secuenciación y genotipado han mejorado enormemente nuestra capacidad para identificar variantes genéticas asociadas con la enfermedad, nuestra capacidad para comprender los mecanismos funcionales afectadas por estas variantes se está quedando. Una fuente importante del problema es que muchas variantes asociados a la enfermedad se encuentran en n en la codificación de las regiones del genoma, lo que probablemente afectará más difícil de predecir mecanismos que c…

Materials

Custom DNA Oligonucleotides	Integrated DNA Technologies		http://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500	KCl, for CE buffer
HEPES (1M)	Fisher Scientific	15630-080	For CE and NE buffer
EDTA (0.5M), pH 8.0	Life Technologies	R1021	For CE, NE, and annealing buffer
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1	NaCl, for NE buffer
Tris-HCl (1M), pH 8.0	Invitrogen	BP1756-100	For annealing buffer
Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	MT21040CM	PBS, for cell wash
DL-Dithiothreitol solution (1M)	Sigma	646563	Reducing agent
PMSF	Thermo Scientific	36978	Protease Inhibitor
Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420	Prevents dephosphorylation of TFs
Nonidet P-40 Substitute	IBI Scientific	IB01140	NP-40, for nuclear extraction
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	For measuring protein concentration
Odyssey EMSA Buffer Kit	Licor	829-07910	Contains all necessary EMSA buffers
TBE Gels, 6%, 12 Wells	Invitrogen	EC6265BOX	For EMSA
TBE Buffer (10X)	Thermo Scientific	B52	For EMSA
FactorFinder Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-092-318	Contains all necessary DAPA buffers
Licor Odyssey CLx	Licor		Recommended scanner for DAPA/EMSA
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® Antimycotic
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	FBS, for culture media
RPMI 1640 Medium	Gibco	22400-071	Contains L-glutamine and 25mM HEPES