Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות

Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54103
Automatic Translation
1, 1
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science

Summary

אנו מציגים טכניקות פשוטות לבידוד הכרומוזומים lampbrush פעיל תעתיק ענק לחיות ביציות של צפרדעים סלמנדרות. בהמשך נתאר כיצד להתבונן הכרומוזומים הללו "חי" על ידי בניגוד שלב או התערבות ההפרש לעומת זאת, וכיצד לתקן אותם ניאון הכלאה באתרו או מכתים immunofluorescent.

Abstract

אנו מתארים שיטות ללימוד הכרומוזומים lampbrush הפעילים הענקים תעתיק (LBCs) נמצאים הביצית, או ביצה תאבה מין, צפרדעים וסלמנדרות. LBCs פרט יכול להיות עד 1 מ"מ אורך והם מתגוררים גרעין ענק, עצמו עד 0.5 מ"מ קוטר. גודלו של הכרומוזומים מתיר תצפיות ללא תחרות של גנים פעילים ידי מיקרוסקופיה אופטית האור, אבל בעת ובעונה אחת טכניקות מיוחדות נדרשים לבידוד הגרעין, הסרת מעטפת הגרעין, והפצת הכרומוזומים בשקופית מיקרוסקופ. גרעין הביצית, הנקרא גם השלפוחית ​​הנבטיה (GV), מבודד מדיום המאפשר gelling החלקית של תקטין הגרעיני ושמר את המבנה העדין של LBCs. שלב זה מתבצע באופן ידני תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים של צורף. בשלב הבא, מעטפת הגרעין מוסר, שוב באופן ידני עם מלקחיים של צורף. תכני הגרעין מועברים במהירות מדיום disperses הג'ל יקטין ומאפשר LBCs הניזוק להתיישב לשקופית מיקרוסקופ. בשלב זה LBCs האברונים גרעיניים אחרים ניתן לצפות על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה התערבות הפרש לעומת זאת, אם כי פרטים עדינים מטושטשים על ידי תנועה בראונית. להסתכלות Microscopical ברזולוציה גבוהה או ניתוח מולקולרי, הכנת כולו centrifuged לצרף את LBCs עדין בתוקף לשקופית. קיבעון קצר paraformaldehyde לאחר מכן על ידי מכתים immunofluorescent או הכלאה באתרו. LBCs נמצא במצב תעתיק פעיל הגודל העצום שלהם מאפשר ניתוח מולקולרי ברמת הגן הבודדה באמצעות confocal או מיקרוסקופ ברזולוציה סופר.

Introduction

רוב בעלי החוליות, למעט, יש לציין של חיות כיס ויונקי שליה, לייצר ביציות yolky גדולות. למרות גודלם לפעמים עצום, ביצים אלה הם תאים בודדים שמגיעים מימד הסופי שלהם ועדיין בשחלה של הנקבה. ביצי השחלות נקראות ביציות וכל בדרך כלל בנוי מגרעין ענק יחיד, ידוע מאז 19 בתחילת המאה ה כמו השלפוחית הנבטיה או פשוט GV. 1 ביציות צפרדעי המעבדה המשותפות, laevis Xenopus ו tropicalis Xenopus, להגיע בקוטר מקסימאלי של 1.2 מ"מ ו 0.8 מ"מ בהתאמה (איור 1). Gvs מ ביציות בוגרות של שתי צפרדעים אלה הם 0.3 - 0.4 מ"מ קוטר (איורים 2, 3). סלמנדרות בדרך כלל יש גם ביציות גדולות Gvs. מלא ביציות בוגרות של אקסולוטל המקסיקני, Ambystoma mexicanum, יותר מ -2 מ"מ קוטר ואת GV היא כ 0.5 מ"מ. לפיכך, גרעינים אלה גלויים בקלות בעין בלתי מזוינת פחיתלטפל בדרכים רבות כי הם בלתי אפשריים עם הגרעינים של תאי סומטיים טיפוסיים.

לא פחות מדהים הוא בגודל הענק של הכרומוזומים בתוך GV, עובדה המוכרת כבר בסוף המאה ה -19. כרומוזומים בודדים של Ambystoma וסלמנדרות אחרות יכולים להיות עד 1 מ"מ האורך (איורים 4, 5). אלה של Xenopus הם ניכרים קטנים, אם כי עם אורכים עד 100 מיקרומטר או יותר, הם מגמדים את הכרומוזומים סומטיים הטיפוסיים של רוב האורגניזמים. תכונה חשובה של כרומוזומים ביצית היא פעילות התעתיק יוצאת הדופן שלהם, מה שמוביל לאחת תכונות המורפולוגיות האופייניות להם - מאות לולאות לרוחב לזווג (איור 5). לולאה כל מורכב אחד או כמה יחידות שעתוק כי פעיל לסנתז RNA. הלולאות לתת ביצית הכרומוזומים מראה מטושטש, מה שהוביל את השם "lampbrush" כרומוזום לאחר השטחי שלהםדמיון המברשות בשימוש בתקופות קודמות לנקות ארובות מנורת נפט. 2

ההתמקדות של מאמר זה היא על השימוש Gvs מבודד ללמוד LBCs האברונים גרעיניים (nucleoli, גופי מוקד היסטון, ואת כתמים). שני די טכניקות שונות יתוארו. בחלק הראשון, הטכניקה הנפוצה יותר, Gvs מבודד בתוך תמיסת מלח באמצעות המלקחיים של צורף, שטוף בקצרה להסיר חלמון חסיד, ואת מעטפת הגרעין מוסרת, שוב עם המלקחיים של צורף. התכנים הדביקים, המכילים את LBCs האברונים גרעיניים, מותר להתיישב לשקופית מיקרוסקופ זכוכית או coverslip. הכנות כזה ניתן לבדוק באופן ישיר על ידי בניגוד שלב או מיקרוסקופיה DIC. לחלופין, ההכנות ניתן centrifuged לצרף את LBCs האברונים לשקופית או coverslip. הכנות כזה יכול להיות מעובד מכן לניתוח מולקולרי מפורט של חומצות גרעין וחלבונים, בעיקר על ידי immunofluorescence ו fluorescent הכלאה באתרו (FISH). 3-7

טכניקה שנייה כרוכה בידוד של GV בשמן מינרלים. 8 Gvs-מבודד שמן נשאר פעיל תעתיק במשך שעות רבות מועיל פוטנציאלי עבור מחקרים שבם אחד לא רוצה את התוכן הגרעיני להיות מציאותי ככל האפשר. 9,10 בגלל מקדם השבירה של "מוהל" הגרעין קרובה לזו של LBCs האברונים גרעיניים אחרים (איור 3), טכניקות Microscopical יכול להיות אתגר עם Gvs שמן-מבודד.

לבסוף, בגלל הגודל וקל מניפולציה שלהם, Gvs הוא חומר אידיאלי עבור מחקרים על מעטפת הגרעין. המתחם הנקבובי הגרעין תואר לראשונה ממחקרים מיקרוסקופים אלקטרונים על מעטפות GV דוחות 11 ותצפיות superresolution אחרונות יותר השתמש באותו חומר. 12,13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מידע כללי על צפרדעים וסלמנדרות, וכן המקורות של בעלי חיים, ניתן למצוא באתרי האינטרנט הבאים: Xenbase (http://www.xenbase.org) וסאל באתר (http://www.ambystoma.org). פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות טיפול בבעלי חיים המחלקה ואמבריולוגיה ממכון קרנגי למדע.

1. פתרונות

  1. הפוך 10 L "מים צפרדע": להוסיף 10 מ"ל של 1 M CaCl 2 ו 10 מ"ל של 1 M NaHCO 3 עד 10 L ללא יונים או dechlorinated H 2 O עם ערבוב.
  2. הפוך 1 L 20% paraformaldehyde: הפוך 1 ליטר של 4 מ"מ Na 2 3 CO. במנדף כימי להוסיף 200 גרם של paraformaldehyde אבקה, וחום לכ -80 מעלות צלסיוס לפזר. מגניב, ולסנן דרך נייר סינון. זהירות: paraformaldehyde הוא רעיל ויש לטפל בו בזהירות. לחלופין, לרכוש פתרון paraformaldehyde מסחרי.
  3. הפוך 1 L ההרדמה אמפיבי: להוסיף 1.5 גרם של אתיל 3-aminobenmethanesulfonate zoate למי צפרדע 1 L. חנות בטמפרטורת החדר.
  4. הפוך בינוני תרבות 1 L הביצית OR2 14: 82.5 מ"מ NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 1 מ"מ 2 CaCl, 1 מ"מ MgCl 2, 1 mM Na 2 4 HPO, 5 HEPES מ"מ (מ -500 מ"מ המניות, pH 8.3). ה- pH הסופי יהיה כ 7.8 pH. הוספת 100 אמפיצילין מ"ג ו -100 מ"ג סטרפטומיצין כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  5. בצע פתרון בידוד GV 1 L: 83 מ"מ KCl, 17 mM NaCl, 6.5 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ KH 2 4 PO, 1 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ dithiothreitol (DTT). התאם ל -7.0 pH.
  6. הפוך 100 פתרון פיזור מ"ל GV: 20.7 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ NaCl, 1.6 מ"מ Na 2 HPO 4, 0.9 מ"מ KH 2 4 PO, 1 מ"מ MgCl 2, 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), 0.1% paraformaldehyde. התאם ל -7.0 pH. כדי להקל על פיזור מהיר יותר של ג'ל הגרעיני, להוסיף 10-50 מיקרומטר CaCl 2.
  7. הפוך 500 פתרון subbing מ"ל. 0.5 גרמו יופי של ג'לטין מסחרי 20 מ"ל H 2 O עבור 5 - 10 דקות. הוסף 500 מ"ל רותחים H 2 O ובזהירות מערבולת לפזר את הג'לטין. CRK מגניב להוסיף 50 מ"ג (SO 4) 2 · 12 H 2 O. מסנן עם יניקה ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס
  8. הפוך 10 מ"ל הרכבה בינונית. ממיסים 10 מ"ג phenylenediamine ב 5 מ"ל PBS (135 mM NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 4.3 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.5 מ"מ KH 2 PO 4, מותאם pH 9). הוסף 5 מ"ל גליצרול. חנות ב 250 aliquots μL ב -80 o C.

2. חומרים

  1. עבור שקופיות לספסל, מיקרוסקופ זכוכית במקום 3 אינץ 'x 1 אינטש ומחליק בתמיסת דטרגנט מסחרית ולשפשף אותם כדי להסיר כל מזהמים. מניחים בתוך מתלה השקופית ולשטוף היטב במי ברז, אז מים ללא יונים. טובלים את השקופיות הפתרון subbing, לנקז בזווית, ואופים לילה בשעה 60 o C.
  2. עבור ריבועי פלסטיק, לחתוך 25 ריבועי מ"מ מסדין של 1 מ"מ פולי העבים (methacrylate מתיל). לקדוח5 מ"מ עגול חור במרכז כל ריבוע. חול בשני פניה ואת הקצוות של הכיכר, כמו גם ההיקף של החור.
    הערה: כחלופת תוצרת בית ריבועי פלסטיק ומגלשות היטב, כפי שתואר בפסקה הבא, השתמש דבק מסחרי באתרו PCR ותאי הכלאה (25 μL). אפשר כנראה גם להשתמש המבודדים סיליקון מחדש שמיש עבור תרבית תאים, אם כי זה לא נבדק ביסודיות עד כה.
  3. עבור שקופיות היטב, להמיס 20 - 30 גרם של שעוות פרפין (56 - 57 מעלות צלסיוס) בכוס זכוכית 50 מ"ל על פלטה חשמלית. עם טפטפת 20 μL, להפיץ טיפה אחת 5 μL של פרפין בכל צד של מרכז שקופית לספסל. קש על ריבוע פלסטיק לתוך פרפין במקום להחליק לתוך הצלחת הלוהטת. גם הנפט יתמוסס וצריך להתפשט באופן שווה מתחת לכיכר הפלסטיק.
    1. להסיר את השקופית מהצלחת החמה ומניח בצד לקירור. מניח תמיכה מתחת לכל מגלשה, כך שהגלישה לא לפנות tabletop במהלך תהליך הקירור. אם פרפין מתקרר מהר מדי, הוא עלול להתרחק מהחור המרכזי. כן 10 או יותר שקופית היטב: כל הכנת GV משתמשת שקופית באר חדשה.
  4. במקרה של ספקים ולהחליק על צנטריפוגה, להשתמש נבנה ספקים במיוחד עבור הרוטור בשימוש. יצרנים אחדים לספק צנטריפוגות עם ספקים עבור 96 - גם צלחות פלסטיק. ספקים אלה ניתן להתאים בקלות להחזיק שקופיות מיקרוסקופ.

3. בידוד של ביציות

  1. הוסף צפרדע נקבה בוגרת (laevis Xenopus או tropicalis Xenopus) או סלמנדרה (mexicanum Ambystoma) בתמיסת הרדמה מספיק כדי לכסות את החיה לחלוטין. כאשר החיה מפסיקה תנועה, למקם אותו בטן כלפי מעלה על גבי מצע של קרח סדוק במכל מתאים.
  2. עם מספריים כירורגיות לבצע 2 - חתך ס"מ 3 בבטן התחתונה לרוחב קו האמצע. הזז את האיברים הפנימיים בעדינות הצידה כדי למצוא את והשחלה של החתך (there שתי השחלות, אחד בכל צד של הבטן). לגזור חלק של השחלה עם מספיק ביציות עבור הניסויים המתוכננים. מאז יש אלף ביציות בכל שחלה, פיסה קטנה יחסית של שחלה (1 - 3 סנטימטרים) בדרך כלל תספיק.
  3. מקום אחד או כמה פיסות השחלה מלוחים OR2 בצלחת פטרי גדולה (100 מ"מ) בטמפרטורת החדר. ביציות ניתן לאחסן במצב טוב במשך כמה ימים, אם ביציות פגומות יוסרו פתרון OR2 מוחלף מדי יום.
  4. לתפור את החתך עם משי כירורגית מוחזרים לבעליו קערת זכוכית בודדת להתאוששות. להוסיף מספיק "מי צפרדע" כדי לכסות את החיה עד שהוא חוזר להכרה (כ -15 דקות). אחרי החיה מראה תנועות רצוניות, למלא את הקערה עם מים. למרות אמורים לשמש מים מתוקים, עקרות אינן הכרחיות, כמו דו-חי כמעט אף פעם לא להידבק לאחר ניתוח. אם תרצה, neomycin ניתן ליישם את התפרים. הפצע בדרך כלל מרפא לחלוטין לאחר Feימי w ואותו בעל חיים יכולים לשמש שוב לאחר כ 2 חודשים.

בידוד 4. של רמינל שלפוחיות (GV)

  1. מניח חלק שחלה (10 - 20 ביציות גדולות) בצלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ"מימ) המכילה פתרון OR2.
  2. סר ביצית מהשחלה באמצעות שני זוגות המלקחיים של צורף # 5 לקרוע את הגבעול הדק של רקמה שמחבר את הביצית אל קיר השחלה. מניח את הביצית אחרת בצלחת פטרי קטנה המכילה בינוני בידוד GV.
    הערה: מצב LBCs תלוי בגודל (בגרות) של הביצית. LBCs להגיע אורך מקסימאלי עם לולאות בולטות ביציות כי הם מעט פחות מאשר בגודל מלא. הביציות הבשלות לרוב מכילות כרומוזומים קצרים עם לולאות נדבקות.
  3. בצע את השלבים הבאים בהגדלה נמוכה של מיקרוסקופ לנתח (קוטר שדה כ 10 - 20 מ"מ).
    1. אחוז הביצית עם שני זוגות מלקחיים ליד הקוטב בעלי חיים (אונה כהה) ולעשות SMכל דמעה. חפש ב חלמון משוחלים עבור גרעין הביצית שקוף, הנקרא גם שלפוחית ​​או GV נבטי.
    2. לחלופין, נקבו חור גדול ליד הקוטב חיה עם זוג אחד של מלקחיים בעדינות לסחוט את GV יחד עם חלמון (איור 2).
    3. בעדינות לגלגל את GV הרחק הארי של חלמון. בדרך כלל תהיה כמות קטנה של חלמון בחוזקה חסיד אל GV.

הסרת 5. של מעטפת הגרעין

  1. לקבלת laevis X. ו tropicalis X., להעביר את GV ממדיום הבידוד למדיום מתפשט תוך 60 שעות של בידוד, אפילו אם עדיין יש חלמון חסיד קטן.
    הערה: Gvs של שני אלה מינים "להקשיח" בתוך כ -60 שניות אם נותר בטווח הבינוני הבידוד לא יתפשט בשלבים הבאים. לכן המהירות היא בעלת חשיבות עליונה כאשר בוחנים תוכן Xenopus GV.
    1. אחוז מעטפת הגרעין בסמוך לחלקו העליון של GV עם זוג אחדהמלקחיים של צורף, נזהר שלא ומהדק. אחוז את המעטפה עם זוג נוסף של מלקחיים כמו לסגור את הראשון ככל האפשר. משוך את שני זוגות מלקחיים אחד משני ואת תוך GV יהיו "פופ" מתוך חינם של המעטפה, הדוגלת בחוזקה מלקחיים אחד או שניהם.
    2. תרים את תוכן GV ב פיפטה מזכוכית או micropipette 20 μL מתכווננת. אם באמצעות פיפטה מתכווננת, להגדיר פיפטה עד 10 μL ו לחתוך את הקצה של קצה פלסטיק עם סכין גילוח. צייר ב 5 μL של נוזל, ואז הרים את GV ב 5 μL הנותרים.
    3. מעבירים את תכולת הגרעין עדיין בג'ל למרכז שקופית גם מילא בעבר עם הפצת פתרון. הפתרון מתפשט חייב להיות משטח קמור כך בועה אינה לכוד כאשר coverslip מתווסף.
    4. הוספת coverslip (18 מ"מ) במקום להחליק בתא לח. הג'ל הגרעיני יהיה לפזר לאט במהלך 10 הבאות - דקות 60, כך כרומוזוםים האברונים גרעיניים לבוא לשכב על פני השטח של שקופיות הזכוכית.
      הערה: Gvs של סלמנדרות א mexicanum ונ viridescens לא "להקשיח" יתר על המידה בטווח הבינוני בידוד. לכן אפשר להמשיך יותר נינוח עם הסרת מעטפת הגרעין מ פחית אחת עם Xenopus.
  2. הסר את מעטפת הגרעין מתוך GV סלמנדרה כמפורט בסעיף 5.1.1, אבל לעשות זאת בטווח הבינוני בידוד.
    1. תרים את תוכן GV בג'ל מעט עם טפטפתי להעביר בצלחת פטרי המכילה פתרון מתפשט.
    2. במהירות לשטוף את קצה פיפטה בפתרון המתפשט, להרים את הג'ל הגרעיני, ולמקם אותו במרכז שקופית גם מלא בעבר עם הפצת פתרון. הוסף coverslip 18 מ"מ ומניחים את השקופית כולה בתא לח. השרף הגרעיני יהיה לפזר לאט מעל בא 10 - דקות 60 הכרומוזומים אברונים גרעיניים יגיעו לשכב על משטח הזכוכית.
      3. </ Ol>

    6. תצפית ראשונית של LBCs האברונים

    1. ראיית LBCs האברונים גרעיניים על ידי בניגוד שלב (מיקרוסקופ הזקוף הקונבנציונלי) בהגדלה נמוכה לאחר פיזורו של תוכן הגרעין בתא מתפשט. מכיוון החדר הוא כ 1 מ"מ עמוק ואת תוך הגרעיניים נמצאים בתחתית, להשתמש מטרה בהגדלה נמוכה עם מרחק עבודה ארוך (5X - 10X).
      הערה: הסיבה העיקרית לבחינת ההכנה בשלב זה לקבוע אם זה שווה נושאת דרך בשלבים הבאים. בשנת הכנת טובת הכרומוזומים הם רצופים התיישבו אל החלק התחתון של החדר. המשך לשלב צנטריפוגה תוך שעה של עשיית ההכנה, כמו זו תבטיח מצורפת אופטימלית של לולאות כרומוזום lampbrush לשקופית.

    7. צנטריפוגה של התוכן הגרעיני

    1. מניחים פיסת נייר פילטר על coverslip ומהדקיםכדי להסיר את נוזל עודף מהאולם.
    2. שים על 1 מ"מ 3 של וזלין על כל צד של coverslip. ממס את וזלין עם מוט מתכת מחומם על 70 - 80 מעלות צלסיוס לאטום את coverslip ריבוע הפלסטיק הבסיסי.
    3. מקום שקופית נושאי השקופיות עבור צנטריפוגה, ולוודא כי ספקים מול מאוזנים. צנטריפוגה השקופית בסביבות 4,800 XG במשך 30 דקות - 1 שעה. ב 4 o C. השתמש בתכונת ההתחלה האיטית על צנטריפוגות.

    8. תיקון התוכן הגרעיני

    1. עבור רוב ההליכים שלאחר מכן, לתקן את תוכן הגרעין עם paraformaldehyde.
    2. שם מתל שקופיות לתוך צלחת מכתים שקופיות מיקרוסקופ רגילה ולאחר מכן למקם את השקופיות בנפרד במעמד. הוסף מספיק מקבע כדי לכסות את השקופיות (2 - 4% paraformaldehyde ב OR2 או PBS).
    3. עם זוג מלקחיים בוטים, לדחוף את coverslip רוחבית, להרים אותו, וזורקים אותו לפח הזכוכית המתאים.השאר שקופיות מקבעים לפחות 15 - 30 דקות. עבור כלאה באתר ורוב כתמי נוגדן, תקופות ארוכות יותר של קיבעון (h או ד) מותרות.
    4. כדי להסיר את ריבוע הפלסטיק, במקום מחליק את אחד בכל פעם לתוך קרח הקר OR2 או PBS בצלחת מכתימה. הכנס סכין גילוח חד בקצה כיכר הפלסטיק לשחרר אותו.
      הערה: באופן אידיאלי הפלסטיק ירד בצורה נקיה, מה שמשאיר את כל שעוות פרפין בשקופית. השעווה משרתת מטרה מועילה: מאז הוא מקיף באזור המרכזי הקטן שבו התוכן הגרעיני מחובר לשקופית, הוא מתנהג כמו סכר אשר מאפשר לעבוד עם כמויות קטנות (5 - 10 μL) של ריאגנטים עבור immunostaining, וכו. שקופיות ניתן שנערך ללא הגבלת זמן בקור OR2 או PBS.

    9. Immunostaining של LBCs גרעינית אברונים

    1. סר כנה GV קבוע מאחסון OR2 או PBS. תמחק את נוזלי במקום עודפים על תומך בתא לח. Chamb נוחאה הוא צלחת פטרי 90 x 15 מ"מ המכיל מעגל 90 מ"מ של נייר סינון לח.
      הערה: בשלב זה את התוכן הגרעיני מחוברת היטב לשקופית באזור 5 מ"מ עגול ללא שעוות פרפין. בגלל השעווה הוא דוחה מים, אפשר לשנות את הפתרונות על ידי הוספה והסרה של כמויות קטנות של נוזלים אל קצה באזור המרכז עם טפטפת 20 μL. הזהירות העיקרית היא כדי להימנע ממגע באזור השעווה חינם עם קצה פיפטה.
    2. ביצוע immunostaining עם כמויות קטנות (10 - 20 μL) של חומרים כימיים. בגלל הכרומוזומים אברונים גרעיניים הם קטנים מאוד הנמצא במגע ישיר עם ריאגנטים הוסיף, פרוטוקולים מכתימים יכולים להיות קצרים. פעמים מכתימות נוגדן יסודית ובחטיבות ביניים יכולות להיות קצרות ככל 1 hr או פחות. אין לכלול חומר ניקוי בכל צעד, כמו זו גורמת נזק ההכנה. אם תרצה, להכתים את ההכנה עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 - 20 דקות כדי להדגיש את הצירים של LBCs.
    3. הר גליצרול או הר מסחריing בינוני מתאים immunofluorescence. כדי למנוע השמנת בועת אוויר במהלך שלב ההרכבה, פעל כמפורט להלן.
      1. משוך 15 μL של הרכבה בינונית לתוך קצה פיפטה 20 μL. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מאזור מיד סביב התפשטות גרעינית על ידי "הפתילה" אותו עם פיסת נייר סינון (חתך בצורת משולש דק מאוד ממעגל 90 מ"מ של 1 # נייר הסינון).
      2. פיפטה ביותר של המדיום גובר על ההכנה, נזהרת שלא לגעת באזור של התפשטות הגרעין. מניח את 1 μL האחרון בערך של הרכבה בינונית במרכז של coverslip 22 מ"מ (עובי 1.5 #). הפוך את coverslip על ההכנה ושחרר בזהירות למקומו.
      3. לקבלת תושבות זמנית, עד כמה ימים, להשתמש 1 מ"ג / מ"ל ​​phenylenediamine גליצרול 50%. לקבלת תושבות קבעו, במיוחד ללימודי superresolution, להשתמש במדיום נמוך קרינה זה מקשה על מקדם שבירה של כ 1.46.

    10. פלורסנט הכלאה באתרו (FISH) של LBCs גרעינית אברונים

    1. בגלל פרוטוקולי FISH דורשים בדרך כלל צעד בטמפרטורה גבוהה, להסיר את פרפין מן ההכנה. בזהירות לגרד עם סכין גילוח, למרות ההליך הוא מייגע עלולה להביא לנזק תאונתי של התכשיר. כדאי וסמנו את השטח של התכשיר על הגב של השקופית עם נקודת יהלומים.
      1. לחלופין, לפזר את שעוות פרפין עם קסילן. הגדרת סדרה של צנצנות Coplin או מנות מכתים המכילות: 30%, 50%, 70%, 95% ו -100% אתנול; 3 מכולות של קסילן; 2 יותר מכולות של אתנול 100% ואצטון אחד.
      2. מניח שקופיות במנשא השקופית מייבש אותם בסדרת אתנול, עוזב מגלשות 3 - 5 דקות בכל ריכוז (זמנים קצרים יותר אם נסער).
      3. ממיסים את פרפין על ידי העברת שקופיות דרך 3 מכולות של קסילן, כ -5 דקות כל אחד אם נסער. הסר אתקסילן על ידי עובר דרך שני ethanols 100%, ולבסוף להסיר את אתנול עם אצטון. קח את השקופיות אצטון להטות להם להתייבש.
    2. לבצע הכלאה באתרו באמצעות כל פרוטוקול סטנדרטי. 15,16

    בידוד 11. של GV תחת שמן

    1. תרים ביצית מפתרון OR2 עם המלקחיים של צורף, כולל רקמה שמסביב כמה שפחות. מניחים את הביצית על חתיכה קטנה של נייר סינון # 1. עודף פתרון OR2 יעביר את נייר הסינון, עוזב את הביצית כמעט ללא נוזל. תרימי את הביצית "יבש" ולמקם אותו מתחת לפני השטח של שמן מינרלי קל משקל (שמן פרפין) בצלחת פטרי קטנה (35 x 10 מ"מ).
      1. עם מחט טונגסטן בסדר או שן אחת המלקחיים, לתקוע חור קטן הביצית ליד קוטב החיה הכהה. תרים את הביצית עם זוג אחד של מלקחיים (הימנעות הטיפים) וסוחט בעדינות. GV יהיה extrude יחד עם קטן או lסכום arger של חלמון על פני השטח שלו (איור 3).
      2. סר כמו חלמון ככל האפשר על ידי גורף בעדינות GV עם הצד של המלקחיים. ברוב המקרים זה יהיה קשה להסיר את כל החלמון. עם זאת, לרוב מטרות כמות קטנה של חלמון היא לא בעיה.
    2. כדי לבחון את תוכנו GV, לשטח את GV במידה כזו או אחרת.
      1. הסר ריבוע הפלסטיק של שקופית היטב ולהשתמש שעוות פרפין הנותרים ככלי קיבול רדוד עבור שמן פרפין. 10 הרם את GV יחד עם שמן פרפין ב פיפטה 20 μL ולהעביר למרכז באזור פרפין. הוספת coverslip ולבחון את התוכן של GV בברוטליות חלקית. טכניקה זו אינו גורם נזק LBCs.
    3. לחלופין, לשטח את GV לכ -10 מיקרומטר עובי להסתכלות של אברונים גרעיניים.
      1. חותכים את 1 מ"מ הסופי של קצה פיפטה פלסטיק עם סכין גילוח חד. למצוץ את GV לתוךלהטות לצד בדיוק 5 μL של שמן מינרלי. Extrude את GV וכל שמן על גבי במרכז coverslip זכוכית 22 מ"מ.
      2. מנמיכים זכוכית שקופית 3 "x 1" תקן לאט עד שהוא נוגע רק טיפת שמן. הירידה ו coverslip יוסר על ידי קפילריות והשמן יתפשט אל הקצוות של coverslip. כאשר הירידה התפשטה לחלוטין, השמן יהיה כ 10 מיקרומטר עבים. LBCs יינזק ו nucleoli הגדול יידחס מעט, אבל רוב האברונים הגרעיניים הקטנים יופיעו פחות או יותר כפי שהם מתקיימים הטובה והשלמה GV (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לבחון הכרומוזומים lampbrush ענק אחד מתחיל על ידי בידוד ביציות מתוך צפרדע או סלמנדרה. איור 1 מציג קבוצה של ביציות בוגרות בתמיסה בופר לאחר הסרה מההשחלה של הצפרדע, Xenopus. ביציות כזה להישאר במצב טוב במשך ימים בטמפרטורת החדר. הגרעין (או השלפוחית נבטיה) מוסר אז מן ביצית עם המלקחיים של צורף, בין בהליך תמיסת מלח (איור 2) או בשמן (איור 3). תכני הגרעין של גרעין שמן-מבודדת ניתן לבדוק בעדינות מועך הגרעין והתבוננות על ידי בניגוד שלב או התערבות הפרש לעומת זאת מיקרוסקופ (DIC). כדי לבחון את תוכנו של גרעין כי כבר מבודד בתוך תמיסת מלח, צריך קודם להסיר את מעטפת הגרעין עם מלקחיים של צורף ולאפשר את התוכן להתיישב לשקופית מיקרוסקופ. ההכנה היא centrifuged אז לצרף tהוא הכרומוזומים בתקיפות לשקופית, שלאחריו כרומוזומים יכול להיות מוכתם עם נוגדן (איור 4) או נתון הכלאה באתרה. הכרומוזומים lampbrush סלמנדרות הם גדולים בהרבה מאלה של צפרדעים (איור 5). בשני המקרים יחידי שעתוק פרט (גנים) ניתן לראות לולאות של הכרומטין המקרינים רוחבי מהציר כרומוזום.

איור 1
איור 1: בוגר ביציות מן tropicalis צפרדע X.. השחלה של צפרדע נקבה בוגרת מכיל אלפי ביציות בשלבים שונים של הבשלה. הקטן הם בגודל של תאים סומטיים כבר הגיע prophase של חלוקת meiotic הראשונה. כמו הביצית גדלה, זה בהדרגה צובר חלמון, אשר נותן את התא מראה לבן אטום. המחצלת הגדולהביציות יור, המוצגות כאן, לרכוש כובע כהה בשל הצטברות של פיגמנט המלנין. הביציות הגדולות של tropicalis X. הן כ -0.8 מ"מ קוטר, אלה של X. laevis על 1.4 מ"מ, בעוד אלה של אקסולוטל מהווים 2.2 מ"מ עצום. מלבד הגודל, כל השלושה הם דומים במראה הכללי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.

איור 2
איור 2: הסרת GV מתוך ביצית של tropicalis X.. שמאל. חור קטן נעשה עם המלקחיים של צורף קוטב החיה הכהה של ביצית ואת GV היה נמתח בעדין. בדוגמה זו GV היה כמעט ללא חלמון כפי שהוא יצא של הביצית. חלמון חסיד ניתן להסיר על ידי מציצת GV פנימה והחוצה של טפטפת בקוטר טיפ רק מעט גדול יותר מאשר קוטר של GV עצמה. ימין. Three Gvs של tropicalis X.. Gvs אלה נותרו כמה דקות בתוך (פתרון בידוד GV מותאם 5.8 pH) בינוני מעט חומצה, הגורמת מעטפת הגרעין להתנפח מן התוכן גרעיני בג'ל. Gvs שטופל בדרך זו לא יתפשט לבדיקת ציטולוגיה. עם זאת, Gvs כאלה הם אידיאליים עבור ניתוח מולקולרי: המעטפה ניתן להסיר עם מלקחיים תכשיטנים, מתן דגימה של תוכן גרעיני לחלוטין ללא זיהום cytoplasmic. 17,18 בר סולם = 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: GV של X. tropicalis מבודד שמן. שמאל. לאחר ניקור קטן נעשה הביצית ליד פו החיה הכההle, את GV החל extrude. במקרה זה GV יצא כמעט ללא חלמון חסיד. אֶמצַע. GV עכשיו בחינם לחלוטין מן הציטופלסמה הביצית. Gvs כזה ממשיך לתמלל RNA במשך שעות. ימין. לאחר GV נמחץ בעדינות בשמן תחת coverslip, ניתן לצפות אברונים גרעיני על ידי דסק"ש, כפי שמוצג כאן, או על ידי בניגוד שלב. GV כולו הוא הרבה יותר גדול מאשר באזור הקטן שמוצג כאן. HLB = גוף מוקד היסטון עם שלושה כתמים על פני השטח שלו. סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ עבור שני לוחות ראשונים, 10 מיקרומטר עבור השלישי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: Lampbrush כרומוזומים (LBCs) מן mexicanum א אקסולוטל. שמאל. ימין. באותו ההכנה שנצפתה על ידי תאורת darkfield. אפשר עכשיו לראות את nucleoli המוגבר הרב בלא הכתם. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: LBC יחיד מן mexicanum א אקסולוטל ואת tropicalis X. צפרדע, בהגדלה זהה. תמונות אלו ממחישות את גודל ההבדל הקיצוני בין LBCs של סלמנדרה וצפרדע (הבלעה). גודל בידולce בקורלציה עם תוכן DNA הכולל של הגנום (כ -30 ליש"ט ל א mexicanum vs 1.7 GBP עבור tropicalis X.). לולאות לרוחב אישית (יחידות שעתוק) הם גם הרבה יותר ב הסלמנדרה מאשר את הצפרדע. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התצפית הראשונה של LBCs "החיים" מתוך Gvs מבודדים יד של צפרדעים וסלמנדרות נעשו לפני כמעט 80 שנה על ידי הביולוג האמריקני ויליאם Duryee, 19 לפני כניסתה של בניגוד שלב מיקרוסקופיה DIC, לפני immunostaining פלורסנט, ולפני FISH. היתרונות של LBCs לחקירת פרטים של מבנה הכרומוזום שעתוק על הפיתוח הנדרש רמת גן היחידה של טכניקות כדי לצרף את LBCs שקופיות זכוכית, לתקן אותם באופן מציאותי, ועל מנת ליישם שיטות מולקולאריות מבלי להרוס המורפולוגיה הבסיסית שלהם. כמעט כל טכניקה כדי להשיג את המטרות הללו דורשת קצת הסתגלות המין בחקירת פשרה כלשהי בין שימור בחיים ואפיון מולקולרי. למשל, Gvs ו LBCs של דו חי זנב קלים בצורה יוצאת דופן לעבוד עם בשל גודלם העצום ואת הקלות שבה תוכן GV להתפזר המדיום המתאים. Until לאחרונה, עם זאת, מעט מאוד היה ידוע על גנומיקה שלהם, מה שהופך אותו קשה למצוא מתאם בין השפע של תכונות ציטולוגיה עם פרטים מולקולריים. לעומת זאת, LBCs של Xenopus הם די קטן בהשוואה לאלו של דו חי זנב (איור 5), אך הגנומים של שני tropicalis X. ו laevis X. היו רצף והם סבירים מבוארים.

לקבלת Gvs דוחי הראשון באמצעות אלה, האתגר העיקרי יהיה לבודד את GV ולהסיר את מעטפת הגרעין מבלי לפגוע LBCs. עד כה, אף אחד לא גילה דרך להסיר את המעטפה, אלא בידיו עם המלקחיים של צורף. זה יהיה מראש הטכניים עיקריים אם דרך נמצאה "לפזר" או "לעכל" את המעטפה אבל להשאיר את הכרומוזומים האברונים גרעיני אחרות ניזוק. כגון טכניקה תהיה שימושית לא פחות עבור מחקרים מולקולריים. בחקירות שלנו על RNA גרעיני cytoplasmic מצאנו אותו חיונילהסיר את מעטפת הגרעין לפני ניתוח RNA גרעיני (איור 2). 17,18 אם המעטפה לא הוסרה, הכמות הקטנה של RNA הגרעיני מומי זיהום RNA cytoplasmic כי דבקה החיצונית של המעטפה.

עוד שיפור גדול יהיה גילוי בדרך כלשהי לצרף LBCs יותר בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ. צנטריפוגה של התכשיר היא קריטית, אבל אפילו צנטריפוגה ממושכת (1 שעות ב 4500 XG) אינה מבטיחה מצורפת. אחת בדרך כלל ניתן לדעת מתי LBCs הם גם מחובר על ידי בחינה אותם עם ניגודיות שלב בהגדלה בינונית. ובכן מצורף הכרומוזומים מראים תנועה בראונית בכלל. אם כל תנועה בראונית של לולאות ניתן לזהות, פרוטוקולים immunostaining או FISH הבאים יביא נזק או אובדן של חומר רב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) Sigma-Aldrich P6148-500G Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich A5040-100G Sometimes referred to as MS-222
Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures VWR  95057-000
Paraplast (paraffin wax) Sigma-Aldrich P3558-1KG
p-Phenylenediamine Sigma-Aldrich P6001
Gelatin Grocery Store Commercial Knox gelatin works fine
ProLong Gold antifade mountant ThermoFisher Scientific P10144
Gold Seal cover glass  22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) Electron Microscopy Sciences 63786-01 These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy
Dumont forceps #5 Electron Microscopy Sciences 72700-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx
Paraffin oil (light)  EMD Chemicals PX0047-1 For isolating GVs in oil
Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) BioRad Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers
Silicone isolators Grace-Biolabs select from catalog link http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html
Coplin jars and staining dishes Electron Microscopy Sciences select from catalog link http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
  2. Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
  3. Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
  4. Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
  5. Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
  6. Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
  7. Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
  8. Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
  9. Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
  10. Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
  11. Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
  12. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
  13. Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
  14. Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
  15. Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
  16. Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
  17. Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
  18. Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
  19. Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).

Tags

גנטיקה גיליון 118 שלפוחית ​​רמינל (GV) גוף מוקד היסטון כרומוזום lampbrush מעטפת גרעין רבב גרעיני nucleolus ביצית שעתוק
בידוד של ענק Lampbrush כרומוזומים מחי ביציות של צפרדעי סלמנדרות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gall, J. G., Nizami, Z. F. Isolation … More

Gall, J. G., Nizami, Z. F. Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders. J. Vis. Exp. (118), e54103, doi:10.3791/54103 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter