Summary
Wir präsentieren einfache Techniken für aus lebenden Eizellen von Fröschen und Salamandern Riese transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen zu isolieren. Wir beschreiben , wie diese Chromosomen "lebendig" durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast zu beobachten, und wie man sie in - situ - Hybridisierung oder Immunfluoreszenzanfärbung für fluoreszierende zu beheben.
Abstract
Wir beschreiben Methoden für die riesigen transcriptionsaktive Lampbrush Chromosomen studieren (LBCS) in der Eizelle gefunden, oder unlaid Ei, von Fröschen und Salamandern. Einzelne LBCS kann bis zu 1 mm lang sein und sie befinden sich in einem gigantischen Kern, selbst mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Die große Größe der Chromosomen ermöglicht unvergleichliche Beobachtungen von aktiven Genen, die durch Licht optische Mikroskopie, aber zugleich werden spezielle Techniken zur Isolierung des Kerns, das Entfernen der Kernhülle erforderlich, und die Chromosomen auf einem Objektträger verteilen. Die Eizelle Kern auch die Keimbläschen (GV) genannt wird, wird in einem Medium isoliert, die teilweise Gelieren des nuklearen Aktin ermöglicht und bewahrt die empfindliche Struktur der LBCS. Dieser Schritt erfolgt manuell unter einem Binokular Juwelier Pinzette. Als nächstes wird die Kernhülle, wieder manuell mit Juwelier einer Pinzette entfernt. Die Kerninhalte werden schnell auf ein Medium überführt, die dispeRSES das Aktin-Gel und ermöglicht es, die unbeschädigte LBCS auf einen Objektträger zu begleichen. An diesem Punkt die LBCS und andere Kernorganellen kann durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrastmikroskopie betrachtet werden, obwohl feinere Details durch die Brownsche Bewegung verdeckt sind. Für hochauflösende mikroskopische Beobachtung oder molekulare Analyse wird die gesamte Zubereitung die empfindlichen LBCS fest an der Folie zu befestigen zentrifugiert. Eine kurze Fixierung in Paraformaldehyd wird dann durch Immunfluoreszenzfärbung oder in situ - Hybridisierung verfolgt. LBCS sind in einem transkriptionell aktiven Zustand und ihre enorme Größe ermöglicht auf der individuellen Genniveau molekulare Analyse mittels konfokaler oder superauflösende Mikroskopie.
Introduction
Die meisten Wirbeltiere, mit der bemerkenswerten Ausnahme von Beuteltiere und Plazentatiere, produzieren große yolky Eier. Trotz ihrer zum Teil enorme Größe sind diese Eier einzelne Zellen, die ihre endgültige Dimension erreichen, während noch im Ovar der weiblichen. Ovarian Eier werden Eizellen genannt und jedes enthält typischerweise einen einzigen riesigen Kern, seit dem Anfang des 19. Jahrhunderts als Keimbläschen bekannt oder einfach GV. 1 Oozyten der gemeinsamen Labor Frösche, Xenopus laevis und Xenopus tropicalis, einen maximalen Durchmesser von 1,2 mm und 0,8 mm bzw. (Abbildung 1) erreichen. Die GVs von reifen Eizellen dieser beiden Frösche sind 0,3-0,4 mm Durchmesser (2, 3). Molche haben in der Regel noch größere Eizellen und GVs. Völlig reife Eizellen des mexikanischen Axolotl Ambystoma mexicanum, sind mehr als 2 mm im Durchmesser und der GV ist etwa 0,5 mm. Somit sind diese Kerne gut sichtbar für das bloße Auge und kannwerden in vielfältiger Weise manipuliert, die mit den Kernen der typischen somatischen Zellen unmöglich sind.
Ebenso bemerkenswert ist die gigantische Größe der Chromosomen innerhalb der GV, was sich bereits am Ende des 19. Jahrhunderts anerkannt. Einzelnen Chromosomen von Ambystoma und andere Molche kann bis zu 1 mm in der Länge (4, 5) liegen. Diejenigen von Xenopus sind beträchtlich kleiner ist , wenn auch mit Längen bis zu 100 & mgr; m oder mehr ist , sie die typischen somatische Chromosomen der meisten Organismen dwarf. Ein wichtiges Merkmal der Eizelle Chromosomen ist ihre außergewöhnliche Transkriptionsaktivität, die auf einer ihrer charakteristischen morphologischen Merkmale führt - Hunderte von paarigen seitlichen Schleifen (Abbildung 5). Jede Schleife besteht aus einem oder wenigen Transkriptionseinheiten, die aktiv RNA synthetisieren. Die Schleifen geben Eizelle Chromosomen einer Fuzzy-Auftritt, der auf den Namen "Lampbrush" Chromosom führte nach ihrer oberflächlichenÄhnlichkeit mit den in früheren Zeiten verwendet Bürsten Petroleumlampe Schornsteine zu reinigen. 2
Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von isolierten GVs LBCS und Kernorganellen (Kernkörperchen, Histon-Locus Körper und Sprenkel) zu studieren. Zwei ziemlich unterschiedliche Techniken beschrieben werden. In der ersten, häufiger Technik, GVs werden in einer Salzlösung unter Verwendung von Juwelier Zange isoliert, kurz adhärenten Eigelb zu entfernen, gespült und der Kernhülle entfernt wurde, wieder mit Juwelier Zange. Die gallertartiger Inhalte, die LBCS und Kernorganellen enthält, dürfen sich auf einen Glasobjektträger oder Deckglas zu begleichen. Solche Präparate können direkt durch Phasenkontrast oder DIC-Mikroskopie untersucht werden. Alternativ zentrifugiert werden können Zubereitungen, die die LBCS und Organellen mit dem Schlitten oder Deckglas zu befestigen. Solche Präparate können dann für detaillierte molekulare Analyse von Nukleinsäuren und Proteinen verarbeitet werden, in erster Linie durch Immunofluoreszenz und fluorescent in situ - Hybridisierung (FISH). 3-7
Eine zweite Technik beinhaltet die Isolierung des GV in Mineralöl. 8 Öl isoliert GVs bleiben transcriptionsaktive für viele Stunden und sind potentiell nützlich für Studien , in denen man will , dass die Kerninhalte möglichst naturgetreu zu sein. 9,10 Da der Brechungsindex des Kern "Saft" zu der der LBCS Nähe und andere Kernorganellen (Abbildung 3) kann mikroskopischer Techniken eine Herausforderung mit öl isoliert GVs sein.
Schließlich aufgrund ihrer Größe und Leichtigkeit der Manipulation, GVs sind ideale Material für Studien über die Kernhülle. Die Kernporenkomplex wurde zuerst aus elektronenmikroskopische Untersuchungen an Amphibien GV Umschläge 11 und neueren Hochauflösungs - Beobachtungen haben das gleiche Material verwendet , beschrieben. 12,13
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Protocol
Xenbase (http://www.xenbase.org) und Sal-Website (http://www.ambystoma.org): Allgemeine Informationen über Frösche und Molche sowie Quellen von Tieren können auf folgenden Websites zu finden. Dieses Protokoll folgt die Tierpflege Richtlinien des Department of Embryologie von der Carnegie Institution for Science.
1. Lösungen
- Machen Sie 10 L "Frosch Wasser": In 10 ml 1 M CaCl 2 und 10 ml 1 M NaHCO 3 bis 10 L entsalztem oder entchlortem H 2 O unter Rühren.
- Machen Sie 1 L 20% Paraformaldehyd: Stellen Sie 1 l 4 mM Na 2 CO 3. In einer chemischen Haube mit 200 g pulverförmigem Paraformaldehyd und Wärme auf etwa 80 o C aufzulösen. Cool, und Filter durch Filterpapier. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Alternativ kaufen kommerziellen Paraformaldehydlösung.
- Machen Sie 1 L Amphibie Betäubungslösung: In 1,5 g Ethyl-3-aminobenZoate Methansulfonat auf 1 L Frosch Wasser. Bei Raumtemperatur lagern.
- Machen Sie 1 L Eizelle Kulturmedium OR2 14: 82,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (von 500 mM Lager, pH 8,3). Der endgültige pH-Wert wird etwa 7,8 pH-Wert. Werden 100 mg Ampicillin und 100 mg Streptomycin Bakterienwachstum zu verhindern.
- Auffüllen auf 1 L GV Isolierungslösung: 83 mM KCl, 17 mM NaCl, 6,5 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 1 mM Dithiothreitol (DTT). Passen Sie auf pH 7,0.
- Make 100 ml GV Ausbreitungslösung: 20,7 mM KCl, 4,3 mM NaCl, 1,6 mM Na 2 HPO 4, 0,9 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1% Paraformaldehyd. Passen Sie auf pH 7,0. Um eine schnellere Ausbreitung des Kern Gel erleichtern, fügen Sie 10-50 uM CaCl 2.
- Machen Sie 500 ml Haftung verbessernden Lösung. Swell 0,5 g handelsüblicher Gelatine in 20 mL H 2 O 5 - 10 min. In 500 ml koch H 2 O und vorsichtig schwenken die Gelatine aufzulösen. Kühle und 50 mg CrK (SO 4) 2 · 12 H 2 O bei 4 o C abgesaugt und Lagerfilter
- Machen Sie 10 ml Eindeckmediums. Man löst 10 mg Phenylendiamin in 5 ml PBS (135 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,5 mM KH 2 PO 4, eingestellt auf pH 9). In 5 ml Glycerin. Shop in 250 ul Aliquots bei -80 o C
2. Materialien
- Für substrierten Dias, Platz 3 Zoll x 1 Zoll Glasobjektträger in einem kommerziellen Reinigungslösung und reiben sie alle Verunreinigungen zu entfernen. Legen Sie in einer Dia-Rack und spülen Sie gut in Leitungswasser, dann in entmineralisiertem Wasser. Tauchen Sie die Folien in der die Haftung verbessernden Lösung, abtropfen lassen in einem Winkel, und backen über Nacht bei 60 o C.
- Für Kunststoff-Quadrate schneiden 25 mm Quadrate aus einem Blech aus 1 mm dicken Poly (methylmethacrylat). Bohren Sie ein5 mm runden Loch in der Mitte jedes Quadrates. Sand beide Flächen und die Kanten des Quadrats sowie den Umfang der Bohrung.
HINWEIS: Als Alternative zu hausgemachten Kunststoff Quadrate und gut gleitet, wie im nächsten Abschnitt beschrieben, verwenden kommerziellen Klebstoff in situ - PCR und Hybridisierungskammern (25 & mgr; l). Man könnte wahrscheinlich auch wiederverwendbare Silikonisolatoren für die Zellkultur verwendet werden, obwohl dies nicht gründlich wie noch nicht getestet worden. - Für gut gleitet, schmelzen 20 - 30 g Paraffinwachs (56 - 57 ° C) in einem 50 ml - Becherglas auf einer Heizplatte. Mit einer 20 & mgr; l-Pipette verteilt ein 5 ul Tropfen Paraffin auf jeder Seite der Mitte eines substrierten Folie. Drücken Sie eine Kunststoff-Quadrat in das Paraffin und legen Sie die Folie auf die heiße Platte. Das Paraffin schmilzt und sollte gleichmäßig unter der Plastik Platz verteilt.
- Entfernen Sie die Folie von der Heizplatte und abkühlen lassen. Eine Stütze unter jedem Ende des Schiebers, so dass der Schlitten nicht in Kontakt mit der Tabletop während des Kühlprozesses. Wenn das Paraffin zu schnell abkühlt, kann es ziehen aus dem zentralen Loch entfernt. Bereiten Sie 10 oder mehr gut Dias: jede GV Zubereitung verwendet eine neue und Folie.
- Für Dia-Träger für die Zentrifugation, verwenden speziell Träger für den Rotor verwendet konstruiert. Mehrere Hersteller bieten Zentrifugen mit Trägern für 96 - und Kunststoffplatten. Diese Träger kann ganz einfach angepasst werden Objektträger zu halten.
3. Isolierung von Oozyten
- Legen Sie eine erwachsene weibliche Frosch (Xenopus laevis oder Xenopus tropicalis) oder Salamander (Ambystoma mexicanum) in ausreichend Anästhesielösung das Tier vollständig zu bedecken. Wenn das Tier Bewegung aufhört, legen Sie es dem Bauch nach oben auf einem Bett aus abgebrochenen Eis in einem geeigneten Behälter.
- Mit chirurgische Scheren eine 2 - 3 cm langer Schnitt im Unterbauch lateral der Mittellinie. Bewegen Sie die inneren Organe sanft beiseite den Eierstock an der Seite des Einschnitts zu finden (there sind zwei Ovarien, eine auf jeder Seite des Bauches). Schneiden Sie einen Teil des Ovars mit genügend Eizellen aus für die geplanten Experimente. Da es in jedem Ovarium Tausende von Oozyten sind, ein relativ kleines Stück des Ovars (1 - 3 cm) üblicherweise ausreichend.
- Legen Sie eine oder ein paar Stücke von Ovar in OR2 Kochsalzlösung in einer großen Petrischale (100 mm) bei Raumtemperatur. Oozyten kann in gutem Zustand für mehrere Tage aufbewahrt werden, wenn sie beschädigt sind Eizellen entnommen und die OR2 Lösung wird täglich gewechselt.
- Nähen Sie den Schnitt mit chirurgischer Seide und zurück, das Tier zu einem individuellen Glasschüssel für Erholung. In gerade genug "Frosch Wasser", das Tier zu decken, bis sie das Bewusstsein wiedererlangt (ca. 15 min). Nachdem das Tier willkürliche Bewegungen zeigt, füllen Sie die Schüssel mit Wasser. Obwohl frisches Wasser verwendet werden soll, ist die Sterilität nicht notwendig, da Amphibien fast nie nach der Operation infiziert werden. Falls gewünscht, kann Neomycin den Nähten angewendet werden. Die Wunde heilt in der Regel vollständig nach einer few Tage und das gleiche Tier kann nach ca. 2 Monaten wieder verwendet werden.
4. Isolierung eines Germinalvesikel (GV)
- Platzieren eines Teils des Ovars (10 - 20 große Oozyten) in eine kleine Petrischale (35 x 10 mm), enthaltend OR2 Lösung.
- Entfernen einer Eizelle aus dem Eierstock mit zwei Paaren von # 5 Juwelier Zange den dünnen Stiel des Gewebes zu reißen, die die Eizelle zu den Ovarien Wand verbindet. Legen Sie die Eizelle in einem anderen kleinen Petrischale mit GV Isolationsmedium.
HINWEIS: Der Zustand des LBCS hängt von der Größe (Fälligkeit) der Eizelle. LBCS erreichen maximale Länge mit prominenten Schleifen in Eizellen, die etwas weniger als in voller Größe sind. Die reifen Eizellen enthalten oft kurze Chromosomen mit kontrahierten Schleifen. - Führen Sie die folgenden Schritte unter geringer Vergrößerung von einem Binokular (Felddurchmesser ca. 10 - 20 mm).
- Fassen Sie die Eizelle mit den beiden Zangenpaaren in der Nähe des Tier Pol (dunkle Hemisphäre) und einen sm machenalle reißen. Schauen Sie in den extrudierten Eigelb für die transparente Eizelle Kern, auch die Keimbläschen oder GV genannt.
- Alternativ stecken ein großes Loch in der Nähe des Tiermast mit einer Pinzette vorsichtig die GV Squeeze - out zusammen mit Eigelb (Abbildung 2).
- Sanft rollen von der Masse des Eigelbs der GV entfernt. Gewöhnlich gibt es eine geringe Menge an Eigelb fest anhaftende zum GV sein.
5. Entfernen der Kernhülle
- Für X. laevis und X. tropicalis, übertragen Sie die GV aus dem Isolationsmedium auf das Ausbreitungsmedium innerhalb von 60 s der Isolation, auch wenn es noch ein wenig anhaftende Dotter ist.
HINWEIS: GVs dieser beiden Spezies "härten" innerhalb von etwa 60 s, wenn in dem Isolationsmedium verbleiben und werden in den nachfolgenden Schritten nicht zu verbreiten. Daher Geschwindigkeit ist von äußerster Wichtigkeit , wenn Xenopus GV Inhalte zu untersuchen.- Fassen Sie die Kernhülle in der Nähe der Spitze des GV mit einem Paarder Zange Juwelier, dabei nicht nach unten zu drücken. Fassen Sie den Umschlag mit einem zweiten Paar Pinzette so nah an der ersten wie möglich. Ziehen Sie die beiden Paare von Zangen voneinander entfernt und die GV Inhalt wird "Pop" aus frei von dem Umschlag, der fest an einem oder beiden Zangen haftet.
- Pick-up die GV Inhalte in einer Glaspipette oder eine einstellbare 20 & mgr; l-Mikro. Wenn eine einstellbare Pipette, stellen Sie die Pipette auf 10 & mgr; l und das Ende der Kunststoffspitze mit einer Rasierklinge abgeschnitten. Zeichnen Sie in 5 & mgr; l Flüssigkeit vor der GV in den verbleibenden 5 ul aufnimmt.
- Übertragen Sie die noch lierten Kerninhalt in die Mitte eines gut Dia vorher mit Streulösung gefüllt. Die Ausbreitungslösung muß eine konvexe Oberfläche haben, so dass eine Blase nicht eingeklemmt wird, wenn das Deckglas hinzugefügt wird.
- Fügen Sie ein Deckglas (18 mm) und den Objektträger in einer feuchten Kammer. Das Kern Gel dispergieren langsam über die nächsten 10 bis 60 min, so dass das Chromosoms und Kernorganellen kommen auf der Oberfläche des Glasobjektträger zu liegen.
HINWEIS: GVs der Molche A. Mexicanum und N. viridescens "härten" nicht über Gebühr in die Isolationsmedium. Deshalb kann man gemächlicher mit der Entfernung der Kernhülle als eine Dose mit Xenopus gehen.
- Entfernen Sie die Kernhülle von einem GV Salamander, wie in Abschnitt 5.1.1 beschrieben, sondern tun dies in dem Isolationsmedium.
- Pick-up die leicht geliert GV Inhalte mit einer Pipette und Transfer in eine Petrischale mit Spreitlösung.
- Schnell die Pipettenspitze in der Streulösung auszuspülen, die nukleare Gel abholen, und legen Sie sie in der Mitte eines gut Dia vorher mit Streulösung gefüllt. Fügen Sie eine 18 mm Deckglas und legen Sie die gesamte Folie in einer feuchten Kammer. Der Kernsaft wird zerstreuen langsam über die nächsten 10 bis 60 min und die Chromosomen und der Kernorganellen kommen auf der Glasoberfläche zu liegen. </ Ol>
6. Vorbemerkung von LBCS und Organell
- Sehen Sie sich die LBCS und Kernorganellen durch Phasenkontrast (konventionelle aufrechten Mikroskop) bei geringer Vergrößerung nach Zerstreuung der Kerninhalt in der Ausbreitungskammer. Da die Kammer etwa 1 mm tief ist und die Kerninhalte am Boden sind, verwenden Sie eine niedrige vergrößerndes Objektiv mit einem großen Arbeitsabstand (5X - 10X).
HINWEIS: Der Hauptgrund für die Vorbereitung zu diesem Zeitpunkt untersucht, um zu bestimmen, ob es sich lohnt, die nächsten Schritte durch. In einer guten Vorbereitung sind die Chromosomen ungebrochen und sind zu dem Boden der Kammer angesiedelt. Fahren Sie mit dem Zentrifugationsschritt innerhalb einer Stunde die Vorbereitung zu machen, da dies eine optimale Befestigung der Lampbrush Chromosomenschleifen auf den Objektträger gewährleisten.
7. Zentrifugieren der Kerninhalt
- Legen Sie ein Stück Filterpapier auf dem Deckglas und drücken SieÜberschüssige Flüssigkeit aus der Kammer zu entfernen.
- Setzen Sie etwa 1 mm 3 Vaseline auf jeder Seite des Deckglases. Schmelzen Sie die Vaseline mit einem Metallstab auf etwa 70 bis 80 ° C das Deckglas auf den darunterliegenden Kunststoff Platz zu versiegeln.
- Die Objektträger in den Schieberträger für die Zentrifugation, um sicherzustellen, dass gegenüberliegende Träger ausgeglichen. Zentrifugieren Sie die Folien bei etwa 4.800 × g für 30 min - 1 h. bei 4 o C. Verwenden Sie den langsamen Start - Funktion auf der Zentrifuge.
8. Befestigung der Kerninhalt
- Für die meisten nachfolgenden Verfahren, fixieren die Kerninhalte mit Paraformaldehyd.
- Legen Sie eine Dia-Rack in einem Standard-Mikroskop-Objektträger Färbetrog und legen Sie dann die Dias einzeln im Rack. Fügen Sie genug Fixiermittel die Folien zur Abdeckung (2 bis 4% Paraformaldehyd in OR2 oder PBS).
- Mit einem Paar stumpfen Pinzette, drücken Sie die Deck seitlich, es aufnehmen und entsorgen Sie sie in den entsprechenden Glas Müll.Verlassen Folien im Fixiermittel für mindestens 15 - 30 min. Für in - situ - Hybridisierung und die meisten Antikörper färbt, längere Fixierung (h oder d) zulässig.
- Um den Kunststoff Platz zu entfernen, Platz gleitet man in einer Zeit, in eiskaltes OR2 oder PBS in einem Färbetrog. Legen Sie eine scharfe Rasierklinge am Rand des Kunststoff-Quadrat und hebeln sie locker.
HINWEIS: Im Idealfall sauber die Kunststoff abgehen wird, auf der Folie alle Paraffinwachs zu verlassen. Das Wachs dient einem nützlichen Zweck: da es die kleinen zentralen Bereich umgibt , wo die Kerninhalte der Folie angebracht sind, es als Damm wirkt , dass man mit kleinen Volumina arbeiten können (von 5 bis 10 & mgr; l) von Reagenzien für die Immunfärbung usw. Dias können auf unbestimmte Zeit in kalten OR2 oder PBS gehalten werden.
9. Immunostaining von LBCS und Reaktor Organell
- Entfernen Sie eine feste GV Zubereitung aus dem Speicher in OR2 oder PBS. Wischen Sie überschüssige Flüssigkeit und auf Stützen in einer feuchten Kammer. Eine bequeme chamber ist ein 90 x 15 mm Petrischale mit einem 90 mm Kreis von feuchtem Filterpapier enthält.
HINWEIS: An dieser Stelle werden die Kerninhalte sind fest in einem 5 mm Kreisfläche frei von Paraffinwachs mit dem Schlitten befestigt. Weil das Wachs wasserabweisend ist, kann man Lösungen durch Hinzufügen und kleine Flüssigkeitsvolumina zu der Kante des zentralen Bereichs mit einer 20 & mgr; l-Pipette entfernt. Die Hauptmaßnahme ist die wachsfreie Fläche mit der Pipettenspitze zu berühren. - Führen Sie immunostaining mit kleinen Volumina (10 - 20 & mgr; l) von Reagenzien. Da die Chromosomen und Kernorganellen sind sehr klein und in unmittelbaren Kontakt mit der zugegebenen Reagenzien, Färbeprotokollen kann kurz sein. Primäre und sekundäre Antikörperfärbung Zeiten können so kurz wie 1 Stunde oder weniger. Sie Reinigungsmittel nicht in jedem Schritt enthalten, da dies zu Schäden an der Herstellung verursacht. Falls gewünscht, beflecken die Herstellung mit DAPI (1 ug / ml) für 10 - 20 min, die Achsen der LBCS zu akzentuieren.
- Berg in Glycerin oder eine kommerzielle Halterunging Medium geeignet für Immunofluoreszenz. Um zu vermeiden, Trapping eine Luftblase während der Montageschritt, gehen Sie wie folgt vor.
- Pull 15 & mgr; l Medium in die Spitze einer Pipette 20 ul Montage. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Bereich unmittelbar um die nukleare Ausbreitung von "Wicking" es mit einem Stück Filterpapier (Schnitt in der Form eines sehr dünnen Dreieck aus einem 90 mm Kreis von # 1-Filterpapier) ab.
- Pipettieren die meisten der Montagemedium auf die Vorbereitung, man aufpassen, nicht den Bereich der nuklearen Verbreitung zu berühren. Legen Sie die letzten 1 & mgr; l oder so Eindeckmedium in der Mitte einer 22 mm Deckglas (Dicke # 1.5). Kehren Sie die Deck über die Vorbereitung und fallen vorsichtig an ihren Platz.
- Für vorübergehende Halterungen, bis auf ein paar Tage, verwenden Sie 1 mg / ml Phenylendiamin in 50% Glycerin. Für die permanente Mounts, vor allem für Hochauflösungs-Studien, mit einem Low-Fluoreszenz Medium, das von etwa 1,46 bis einem Brechungsindex aushärtet.
10. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von LBCS und Reaktororganelles
- Da FISH-Protokolle in der Regel einen Schritt bei erhöhter Temperatur erforderlich ist, entfernen Sie das Paraffinwachs aus der Herstellung. Vorsichtig kratzen mit einer Rasierklinge, obwohl das Verfahren langwierig ist und um eine versehentliche Beschädigung der Zubereitung führen kann. Es ist nützlich, den Bereich der Zubereitung auf der Rückseite des Schlittens mit einer Diamantspitze zu markieren.
- Alternativ lösen sich die Paraffinwachs mit Xylol. Legen Sie eine Reihe von Färbetrog oder färbekasten enthält: 30%, 50%, 70%, 95% und 100% Ethanol; 3 Behälter aus Xylol; 2 weitere Behälter mit 100% Ethanol und Aceton ein.
- Legen Sie Folien in der Folienträger und dehydrieren sie in der Ethanol-Serie, Dias 3 verlassen - 5 min in jeder Konzentration (kürzere Zeiten, wenn gerührt).
- Man löst das Paraffinwachs durch die Folien durch die 3 Behälter Xylol vorbei, ca. 5 min jeweils, wenn gerührt. Entferne dasXylol, indem sie durch zwei 100% ethanole und schließlich das Ethanol mit Aceton zu entfernen. Nehmen Sie die Folien aus Aceton und kippen sie zu trocknen.
- Führen Sie in - situ - Hybridisierung mit einem beliebigen Standard - Protokoll. 15,16
11. Isolierung eines GV unter Öl
- Pick-up eine Eizelle aus der OR2 Lösung mit Juwelier Zange, darunter so wenig umgebende Gewebe wie möglich. Legen Sie die Eizelle auf einem kleinen Stück # 1-Filterpapier. Überschüssiges OR2 Lösung wird auf das Filterpapier übertragen, die Eizelle zu verlassen fast frei von Flüssigkeit. Nehmen Sie den "trockenen" Eizelle und legen Sie sie unter der Oberfläche des leichten Mineralöl (Paraffinöl) in einer kleinen Petrischale (35 x 10 mm).
- Mit einem feinen Wolfram Nadel oder ein Zinken der Zange, stecken Sie ein kleines Loch in der Eizelle in der Nähe des dunklen Tiermast. Pick-up die Eizelle mit einer Zange (Vermeidung der Spitzen) und vorsichtig drücken. Die GV wird extrudieren zusammen mit einer kleineren oder lArger Menge an Eigelb auf seiner Oberfläche (3).
- Entfernen Sie so viel wie möglich Eigelb vorsichtig mit der Seite der Zange die GV fegt. In den meisten Fällen wird es schwierig sein, alle dem Eigelb zu entfernen. Jedoch ist für die meisten Zwecke eine geringe Menge an Eigelb ist kein Problem.
- Um die GV Inhalte beobachten, glätten die GV zu einer mehr oder weniger stark.
- Entfernen Sie die Plastik Quadrat aus einem Brunnen Rutsche und verwenden, um die restlichen Paraffinwachs als flache Behälter für Paraffinöl. 10 Pick - up die GV zusammen mit Paraffinöl in einer 20 & mgr; l - Pipette und Transfer zum Zentrum des Paraffin - Bereich. Fügen Sie ein Deckglas und beobachten Sie den Inhalt der teilweise abgeflacht GV. Diese Technik nicht beschädigt die LBCS.
- Alternativ glätten die GV auf etwa 10 & mgr; m Dicke für die Beobachtung von Kernorganellen.
- Schneiden Sie die letzte 1 mm von einer Plastikpipettenspitze mit einer scharfen Rasierklinge ab. Saugen Sie die GV in dieSpitze zusammen mit genau 5 & mgr; l Mineralöl. Extrudieren die GV und das gesamte Öl auf die Mitte einer 22 mm Deckglas.
- Senken Sie eine Standard-3 "x 1" Objektträger aus Glas langsam, bis sie den Öltropfen berührt. Der Tropfen und Deckglas wird durch Kapillarität angehoben werden und das Öl zu den Kanten des Deckglases verteilt werden. Wenn der Tropfen vollständig ausgebreitet hat, wird das Öl etwa 10 & mgr; m dick sein. Die LBCS wird beschädigt und große Nucleoli leicht zusammengedrückt werden, aber die meisten der kleineren Kernorganellen mehr oder weniger erscheinen , wie sie in dem intakten GV vorhanden (Abbildung 3).
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Representative Results
Um zu untersuchen, Riese Lampbrush Chromosomen beginnt man von Eizellen aus einem Frosch oder Salamander zu isolieren. Abbildung 1 zeigt eine Gruppe von reifen Eizellen in einer gepufferten Salzlösung nach der Entnahme aus dem Ovar des Frosches Xenopus. Solche Eizellen bleiben für Tage bei Raumtemperatur in einem guten Zustand. Der Kern (oder Keimbläschen) wird dann von einer Oocyte mit Juwelierpinzette, entweder in einer Salzlösung (Abbildung 2) oder in Öl (3) entfernt wird . Die Kern Inhalt eines öl isoliert Kern kann durch leichtes Quetschen den Kern und durch Phasenkontrast oder Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie beobachtet untersucht werden. Um den Inhalt eines Kerns untersuchen, die in einer Salzlösung isoliert wurde, muss man entfernen Sie zunächst die Kernhülle mit Juwelier Zange und lassen Sie die Inhalte auf einen Objektträger zu begleichen. Die Zubereitung wird dann zentrifugiert t anhängener Chromosomen fest an der Folie, nach dem die Chromosomen mit einem Antikörper (Figur 4) oder unterzogen , um in - situ - Hybridisierung gefärbt werden. Die Lampbrush Chromosomen von Salamandern sind viel größer als die der Frösche (Abbildung 5). In beiden Fällen einzelne Transkriptionseinheiten (Gene) als Schleifen von Chromatin aus dem Chromosom Achse seitlich abstehenden gesehen werden.
Abbildung 1: Reife Oozyten aus dem Frosch X. tropicalis. Das Ovar eines reifen weiblichen Frosch enthält Tausende von Eizellen in verschiedenen Reifestadien. Die kleinste sind die Größe der somatischen Zellen und haben bereits Prophase der ersten meiotischen Teilung erreicht. Da die Eizelle wächst, reichert es sich allmählich Eigelbs, der die Zelle ein opakes weißes Aussehen verleiht. Die größte Matteeine dunklere Kappe aufgrund der Ansammlung von Melaninpigment ure Oozyten, hier gezeigt, zu erwerben. Die größten Oozyten von X. tropicalis sind etwa 0,8 mm im Durchmesser, laevis diejenigen von X etwa 1,4 mm, während die der Axolotl sind eine enorme 2,2 mm. Mit Ausnahme der Größe, sind alle drei ähnlich im allgemeinen Aussehen. Maßstabsbalken = 1 mm.
Abbildung 2: Die Entfernung der GV von einer Oozyten von X. tropicalis. Links. Ein kleines Loch wurde mit Juwelier Zange in den dunkleren Tier Pol einer Eizelle gemacht und die GV wurde sanft extrudiert. In diesem Beispiel war der GV von Eigelb fast frei, wie es aus der Eizelle kam. Adhärenten yolk kann durch Ansaugen des GV in eine und aus einer Pipette mit einem Spitzendurchmesser nur geringfügig größer als der Durchmesser des GV selbst entfernt werden. Recht. Trei GVs von X. tropicalis. Diese GVs wurden ein paar Minuten in einem leicht sauren Medium (GV Isolationslösung auf pH 5,8) nach links, die die Kernhülle verursacht von den gelierten Kern Inhalte zu quellen entfernt. GVs auf diese Weise behandelt werden nicht für die zytologische Untersuchung verbreiten. Allerdings sind solche GVs ideal für die molekulare Analyse: Die Hülle kann mit Juwelieren einer Pinzette entfernt werden, um eine Probe der Kern Inhalt vollständig frei von zytoplasmatischen Kontamination bereitstellt. 17,18 Maßstabsbalken = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: GV von X. tropicalis in Öl isoliert. Links. Nach einem kleinen Einstich wurde in der Eizelle in der Nähe der dunklen Tier po gemachtle, begann die GV zu extrudieren. In diesem Fall kam der GV fast ohne anhaftende Dotter aus. Mitte. Die GV ist jetzt völlig frei von der Eizelle Zytoplasma. Solche GVs weiterhin RNA stundenlang zu transkribieren. Recht. Nach der GV sanft in Öl unter einem Deck zerquetscht wird, kann Kernorganellen von DIC betrachtet werden, wie hier dargestellt, oder durch Phasenkontrast. Die gesamte GV ist viel größer als die kleine Fläche hier gezeigt. HLB = Histon locus Körper mit drei Sprenkel auf seiner Oberfläche. Maßstabsbalken = 0,5 mm für ersten beiden Platten, 10 & mgr; m für die dritte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Lampbrush Chromosome (LBCS) aus dem Axolotl A. Mexicanum. Links. Recht. Die gleiche Zubereitung von Dunkelfeldbeleuchtung betrachtet. Man kann nun die zahlreichen ungefärbten verstärkt Kernkörperchen zu sehen. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: A Single LBC vom Axolotl A. Mexicanum und den Frosch X. tropicalis, bei gleicher Vergrößerung. Diese Bilder zeigen die extreme Größenunterschied zwischen LBCS eines Salamander und ein Frosch (kleines Bild). Die Größe difference korreliert mit der Gesamt - DNA - Gehalt des Genoms (etwa 30 GBP für A. mexicanum vs 1,7 Gbp für X. tropicalis). Einzelne Seitenschleifen (Transkriptionseinheiten) sind auch viel länger in der Salamander als im Frosch. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die ersten Beobachtungen von "lebenden" LBCS von Hand isoliert GVs von Fröschen und Salamandern wurden durch die amerikanische Biologe William Duryee, 19 vor fast 80 Jahren vor der Einführung der Phasenkontrast und DIC - Mikroskopie vor Fluoreszenzimmunfärbung und vor FISH. Die Vorteile von LBCS für Details von Chromosomenstruktur und Transkription auf der individuellen Gen-Ebene erforderlich Entwicklung von Techniken der Untersuchung der LBCS auf Glasobjektträger zu befestigen, sie in einer naturgetreuen Weise zu fixieren, und molekularen Techniken anzuwenden, ohne ihre Grund Morphologie zu zerstören. Fast jede Technik, um diese Ziele zu erreichen, erfordert eine gewisse Anpassung an die untersuchten Art und einige Kompromiss zwischen naturgetreue Erhaltung und molekulare Charakterisierung. Zum Beispiel GVs und LBCS von tailed Amphibien sind ungewöhnlich leicht zu verarbeiten aufgrund ihrer enormen Größe und der Leichtigkeit, mit der die GV Inhalt in dem geeigneten Medium zu dispergieren. Until vor kurzem wurde jedoch sehr wenig über ihre genomics bekannt, was es schwierig macht, die Fülle von cytologischen Eigenschaften mit molekularen Details zu korrelieren. Umgekehrt LBCS von Xenopus sind ziemlich klein im Vergleich zu denen von tailed Amphibien (Abbildung 5), aber die Genome von sowohl X. tropicalis und X. laevis wurden sequenziert und einigermaßen gut kommentierten sind.
Für die erste mit Amphibien GVs, wird die große Herausforderung sein, die GV zu isolieren und die Kernhülle entfernen, ohne die LBCS zu beschädigen. Bis heute hat niemand einen Weg entdeckt, den Umschlag mit Ausnahme von Hand mit Juwelier Zange zu entfernen. Es wäre ein großer technischer Fortschritt, wenn ein Weg gefunden zu "lösen" oder "verdauen", um den Umschlag aber die Chromosomen und andere Kernorganellen unbeschadet lassen. Eine solche Technik wäre für molekulare Untersuchungen gleichermaßen nützlich sein. Bei unseren Untersuchungen über die nukleare und zytoplasmatische RNA fanden wir es wichtig,Entfernen Sie die Kernhülle vor der Analyse von Kern - RNA (Abbildung 2). 17,18 Wenn der Umschlag nicht entfernt wird, wird die kleine Menge an Kern - RNA überwältigt durch zytoplasmatische RNA verunreinigenden, die auf die Außenseite der Hülle haftet.
Eine weitere wichtige Verbesserung würde Entdeckung gewisser Weise sein LBCS befestigen fester an einem Mikroskop-Objektträger. Zentrifugierung der Herstellung kritisch ist, sondern auch längere Zentrifugation (1 h bei 4500 xg) keine Befestigung zu gewährleisten. Man kann in der Regel sagen, wenn LBCS gut befestigt werden, indem sie mit Phasenkontrast bei mittlerer Vergrößerung zu untersuchen. Gut angebracht Chromosomen überhaupt keine Brownsche Bewegung zeigen. Wenn eine Brownsche Bewegung der Schleifen nachweisbar ist, werden nachfolgende Immunfärbung oder FISH-Protokolle zu umfangreichen Schäden oder Materialverlust führen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G.
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
