Summary
Presentamos técnicas simples para aislar cromosomas gigantes lampbrush transcripcionalmente activas a partir de ovocitos de ranas y salamandras que viven. Se describe cómo observar estos cromosomas "vivo" por contraste de fase o contraste diferencial de interferencia, y la forma de solucionarlos por hibridación fluorescente in situ o tinción de inmunofluorescencia.
Abstract
Se describen métodos para el estudio de los cromosomas gigantes transcripcionalmente activos lampbrush (LBC) que se encuentran en el ovocito, o el huevo unlaid, de ranas y salamandras. LBC individuales pueden ser de hasta 1 mm de longitud y de que residan en un núcleo gigante, en sí hasta 0,5 mm de diámetro. El gran tamaño de los cromosomas permite observaciones sin precedentes de genes activos por microscopía óptica de luz, pero al mismo tiempo se requieren técnicas especiales para aislar el núcleo, la eliminación de la envoltura nuclear, y la difusión de los cromosomas en un portaobjetos de microscopio. El núcleo de los ovocitos, también llamada la vesícula germinal (GV), se aísla en un medio que permite la gelificación parcial de la actina nuclear y preserva la delicada estructura de las LBC. Este paso se lleva a cabo manualmente bajo un microscopio de disección utilizando pinzas de joyero. A continuación, se retira la envoltura nuclear, de nuevo manualmente con unas pinzas de joyero. Los contenidos nucleares se transfieren rápidamente a un medio que disperses el gel de actina y permite a los LBC en buen estado a asientan sobre un portaobjetos de microscopio. En este punto, los LBC y otros orgánulos nucleares pueden ser vistos por contraste de fase o de interferencia diferencial microscopía de contraste, aunque los detalles más finos están oscurecidos por el movimiento browniano. Para la observación microscópica alta resolución o el análisis molecular, toda la preparación se centrifugó para unir las LBC delicados firmemente a la diapositiva. Una breve fijación en paraformaldehído es seguido por la tinción de inmunofluorescencia o hibridación in situ. LBC están en un estado transcripcionalmente activo y su enorme tamaño permite el análisis molecular a nivel de genes individuales usando microscopía confocal o de super-resolución.
Introduction
La mayoría de los vertebrados, con la notable excepción de los marsupiales y mamíferos placentarios, producen huevos grandes con yema. A pesar de su enorme tamaño a veces, estos huevos son células individuales que llegan a su dimensión final, mientras que aún en el ovario de la hembra. Los huevos de ovario se denominan ovocitos y cada normalmente contiene un solo núcleo gigante, conocido desde principios del siglo 19 como la vesícula germinal o simplemente GV. 1 Los ovocitos de las ranas de laboratorio comunes, Xenopus laevis y Xenopus tropicalis, alcanzan un diámetro máximo de 1,2 mm y 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Los GVs de ovocitos maduros de estas dos ranas son 0,3 - 0,4 mm de diámetro (Figuras 2, 3). Salamandras suelen tener ovocitos y Planos generales aún mayores. Ovocitos completamente maduros del ajolote mexicano, Ambystoma mexicanum, son más de 2 mm de diámetro y de la GV es de unos 0,5 mm. Por lo tanto, estos núcleos son fácilmente visibles a simple vista y Canser manipulada de muchas maneras que son imposibles con los núcleos de células somáticas típicas.
Igualmente notable es el tamaño gigantesco de los cromosomas dentro de la GV, un hecho ya reconocido al final del siglo 19. Cromosomas individuales de Ambystoma y otros salamandras pueden ser de hasta 1 mm de longitud (Figuras 4, 5). Aquellos de Xenopus son considerable más pequeño, aunque con longitudes de hasta 100 micras o más, se empequeñecen los cromosomas somáticos típicas de la mayoría de los organismos. Una característica importante de los cromosomas de ovocitos es su extraordinaria actividad transcripcional, lo que conduce a uno de sus rasgos más característicos morfológicos - cientos de bucles laterales pareadas (Figura 5). Cada bucle consta de una o unas pocas unidades de transcripción que sintetizan activamente ARN. Los bucles dan ovocito cromosomas un aspecto borroso, lo que llevó al nombre del cromosoma "lampbrush" después de su superficialparecido con los pinceles utilizados en épocas anteriores para limpiar las chimeneas de la lámpara de queroseno. 2
El objetivo de este trabajo es sobre el uso de Planos generales aislados para estudiar LBC y orgánulos nucleares (nucleolos, los órganos de la histona locus, y manchas). se describen dos técnicas muy diferentes. En la primera técnica, más común, GVs están aislados en una solución salina utilizando pinzas de joyero, se enjuagó brevemente para eliminar la yema de adherente, y se retira la envoltura nuclear, de nuevo con unas pinzas de joyero. El contenido gelatinoso, que contienen los LBC y orgánulos nucleares, se les permite asentarse sobre un portaobjetos de vidrio o cubreobjetos. Tales preparaciones pueden ser examinados directamente por contraste de fases o microscopía DIC. Alternativamente, las preparaciones pueden ser centrifugadas para unir las LBC y orgánulos a la diapositiva o cubreobjetos. Tales preparaciones se pueden procesar para el análisis molecular detallado de ácidos nucleicos y proteínas, principalmente por inmunofluorescencia y fluorescent hibridación in situ (FISH). 3-7
Una segunda técnica consiste en el aislamiento de la GV en aceite mineral. 8 Planos generales en aceite aislado permanecen transcripcionalmente activo durante muchas horas y son potencialmente útiles para estudios en los que se quieren los contenidos nucleares sean lo más realista posible. 9,10 Debido a que el índice de refracción de la "savia" nuclear es cercana a la de los LBC y otros orgánulos nucleares (Figura 3), técnicas microscópicas puede ser un desafío con Planos generales de petróleo aislado.
Por último, debido a su tamaño y facilidad de manipulación, GVS material ideal para los estudios sobre la envoltura nuclear. El complejo del poro nuclear fue descrita por primera vez a partir de estudios de microscopía electrónica en sobres GV de anfibios y 11 observaciones más recientes superresolución haber utilizado el mismo material. 12,13
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Protocol
Información general acerca de las ranas y salamandras, así como fuentes de animales, se pueden encontrar en los siguientes sitios web: Xenbase (http://www.xenbase.org) y Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal del Departamento de Embriología de la Carnegie Institution for Science.
1. Soluciones
- Hacer 10 L "agua rana": Añadir 10 ml de 1 M de CaCl2 y 10 ml de 1 M de NaHCO3 a 10 L desionizada o sin cloro H2O con agitación.
- Hacer 1 L de 20% paraformaldehído hacer 1 litro de 4 mM de Na 2 CO 3. En una campana química añadir 200 g de paraformaldehído en polvo, y el calor a aproximadamente 80 ° C para disolver. Enfriar y filtrar con papel de filtro. Precaución: paraformaldehído es tóxico y debe ser manejado con cuidado. Como alternativa, la compra de solución de paraformaldehído comercial.
- Hacer solución anestésica anfibio 1 L: Añadir 1,5 g de acetato de 3-aminobenmetanosulfonato benzoato de agua rana 1 l. Almacenar a temperatura ambiente.
- Hacer 1 L de medio de cultivo de ovocitos OR2 14: NaCl 82,5 mM, KCl 2,5 mM, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na 2 HPO 4, 5 mM HEPES (desde el almacén 500 mM, pH 8,3). El pH final será de aproximadamente pH 7,8. Añadir 100 mg de ampicilina y 100 mg de estreptomicina para prevenir el crecimiento bacteriano.
- Hacer 1 L de solución de aislamiento GV: 83 mM de KCl, NaCl 17 mM, 6,5 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de ditiotreitol (DTT). Ajustar a pH 7,0.
- Hacer 100 ml solución GV dispersión: KCl 20,7 mM, NaCl 4,3 mM, 1,6 mM Na 2 HPO 4, 0,9 mM KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl 2, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1% de paraformaldehído. Ajustar a pH 7,0. Para facilitar más rápida dispersión del gel nuclear, añadir 10-50 mM CaCl2.
- Hacer 500 ml solución subbing. Oleaje 0,5 g de gelatina comercial en 20 ml de H2O durante 5 - 10 minutos a. Añadir 500 ml de ebullición H2O y agitar cuidadosamente para disolver la gelatina. Dejar enfriar y añadir 50 mg CRK (SO4) 2 · 12 H2O filtro con succión y se almacena a 4 ° C
- Hacer 10 ml de medio de montaje. Disolver 10 mg fenilendiamina en 5 ml de PBS (NaCl 135 mM, KCl 2,5 mM, 4,3 mM Na 2 HPO 4, 1,5 mM KH 2 PO 4, se ajustó a pH 9). Añadir 5 ml de glicerol. Tienda en 250 alícuotas a -80 ° C
2. Materiales
- Para portaobjetos impregnados, lugar de 3 pulgadas de microscopio de vidrio x 1 pulgada se desliza en una solución de detergente comercial y frotar ellos para eliminar cualquier contaminante. Colocar en un estante portaobjetos y enjuagar bien con agua del grifo, luego en agua desionizada. Sumergir los portaobjetos en la solución subbing, escurrir en un ángulo, y hornear durante la noche a 60 ° C.
- Para las plazas de plástico, corte 25 mm cuadrados a partir de una hoja de 1 mm de espesor de poli (metacrilato de metilo). perforar unagujero de 5 mm redondo en el centro de cada cuadrado. Sand ambas caras y los bordes de la plaza, así como la circunferencia del agujero.
NOTA: Como alternativa a la casera cuadrados de plástico y diapositivas, así, como se describe en el párrafo siguiente, use un adhesivo comercial PCR in situ y las cámaras de hibridación (25 mu L). Se podría utilizar probablemente también reutilizables aisladores de silicona para el cultivo de células, aunque esto no ha sido probado a fondo como todavía. - Para diapositivas así, derretir 20 - 30 g de cera de parafina (56-57 ° C) en un vaso de precipitados de 50 ml de vidrio en una placa caliente. Con una pipeta de 20 l, se extendió una gota 5 l de parafina en cada lado del centro de un portaobjetos de subbed. Presione un cuadrado de plástico en la parafina y colocar la placa sobre la placa caliente. La parafina se derrite y se debe extender uniformemente bajo la plaza de plástico.
- Retire la corredera de la placa caliente y dejar enfriar. Coloque un soporte debajo de cada extremo de la corredera, de manera que la corredera no contacta con el tablETOP durante el proceso de enfriamiento. Si la parafina se enfría demasiado rápido, puede alejarse del agujero central. Preparar 10 o más diapositivas así: cada preparación GV utiliza una nueva diapositiva también.
- Para los portadores deslizantes para centrifugación, usar especialmente construida portadores para el rotor utilizado. Varios fabricantes ofrecen centrifugadoras con los transportistas para 96 - y placas de plástico. Estos portadores se pueden adaptar fácilmente para mantener portaobjetos de microscopio.
3. Aislamiento de oocitos
- Coloque una rana adulta femenina (Xenopus laevis o Xenopus tropicalis) o salamandra (Ambystoma mexicanum) en la solución anestésica suficiente para cubrir el animal completo. Cuando el animal cesa el movimiento, lo coloca panza arriba sobre un lecho de hielo picado en un recipiente adecuado.
- Con tijeras quirúrgicas hacen un 2 - 3 cm de la incisión en el abdomen inferior lateral a la línea media. Mover los órganos internos suavemente a un lado para encontrar el ovario en el lado de la incisión (thERE son dos ovarios, uno a cada lado del abdomen). Recortar una parte del ovario con suficientes ovocitos para los experimentos planeados. Puesto que hay miles de ovocitos en cada ovario, una pieza relativamente pequeña de ovario (1 - 3 cm), será usualmente suficiente.
- Coloque una o unas pocas piezas de ovario en OR2 solución salina en una gran placa de Petri (100 mm) a temperatura ambiente. Los ovocitos se pueden almacenar en buenas condiciones durante varios días, si se eliminan los ovocitos dañados y la solución OR2 se cambian todos los días.
- Suturar la incisión con seda quirúrgica y devolver el animal a un recipiente de vidrio individuales para la recuperación. Añadir la cantidad necesaria "agua rana" para cubrir el animal hasta que recupere la conciencia (unos 15 minutos). Después de que el animal muestra los movimientos voluntarios, llenar el recipiente con agua. A pesar de que el agua dulce se debe utilizar, la esterilidad no es necesario, ya que los anfibios casi nunca se infectan después de la cirugía. Si se desea, la neomicina se puede aplicar a las suturas. La herida se suele curar por completo después de una Fedía w y el mismo animal se pueden utilizar de nuevo después de aproximadamente 2 meses.
4. Aislamiento de un Germinal vesículas (GV)
- Colocar una porción de ovario (10 - 20 ovocitos grandes) en una pequeña placa de petri (35 x 10 mm) que contiene la solución OR2.
- Retirar un ovocito desde el ovario mediante dos pares de pinzas # 5 de joyero para desgarrar la delgada tallo de tejido que conecta el ovocito a la pared del ovario. Coloque el ovocito en otra pequeña placa de Petri que contiene medio de aislamiento GV.
NOTA: El estado de la LBC depende del tamaño (madurez) de los ovocitos. LBC alcanzan longitud máxima con bucles prominentes en los ovocitos que son ligeramente menos de tamaño completo. Los ovocitos maduros más a menudo contienen cromosomas cortos con bucles contratados. - Realice los siguientes pasos debajo de bajo aumento de un microscopio de disección (diámetro del campo de aproximadamente el 10 - 20 mm cuando).
- Captar el ovocito con los dos pares de pinzas cerca del polo animal (en el hemisferio oscuro) y hacer un smtodos lágrima. Mira en la yema extruido para el núcleo del oocito transparente, también llamado de vesícula germinal y GV.
- Por otra parte, hacer un agujero grande cerca del polo animal con un par de pinzas y apretar suavemente la GV, junto con la yema (Figura 2).
- rodar suavemente la GV lejos de la mayor parte de la yema. Por lo general, habrá una pequeña cantidad de yema con buena adherencia a la GV.
5. La eliminación de la envoltura nuclear
- Para X. laevis y X. tropicalis, transferir la GV desde el medio de aislamiento al medio de propagación dentro de los 60 s de aislamiento, incluso si todavía hay un poco de yema de adherente.
NOTA: Planos generales de estas dos especies "endurecer" en unos 60 s si se deja en el medio de aislamiento y no se extenderá en los pasos posteriores. Por lo tanto, la velocidad es de suma importancia cuando se examina el contenido de Xenopus GV.- Agarre la envoltura nuclear cerca de la parte superior de la GV con un parde pinzas de joyero, teniendo cuidado de no presionar. Agarre el sobre con un segundo par de pinzas tan cerca de la primera como sea posible. Tire de los dos pares de pinzas de distancia unos de otros y el contenido GV se "pop" fuera libre de la envoltura, que se adhiere fuertemente a una o ambas pinzas.
- Recoge los contenidos GV en una pipeta de vidrio o una ajustable 20 l micropipeta. Si se utiliza una pipeta ajustable, ajustar la pipeta para 10 l y cortar el extremo de la punta de plástico con una hoja de afeitar. Dibuje en 5 l de líquido antes de recoger la GV en los 5 l restantes.
- Transferir el contenido nucleares todavía gelificados con el centro de un portaobjetos así previamente lleno de solución propagación. La solución de la difusión debe tener una superficie convexa para que una burbuja no es atrapado cuando se añade el cubreobjetos.
- Añadir un cubreobjetos (18 mm) y colocar el portaobjetos en una cámara húmeda. El gel nuclear se dispersará lentamente durante los siguientes 10 - 60 min, por lo que el cromosomas y orgánulos nucleares llegan a estar en la superficie de la lámina de vidrio.
NOTA: GVS del salamandras A. mexicanum y N. viridescens no se "endurecen" indebidamente en el medio de aislamiento. Por lo tanto se puede proceder más pausado con la eliminación de la envoltura nuclear de una lata con Xenopus.
- Retire la envoltura nuclear de una salamandra GV tal como se describe en la sección 5.1.1, pero hacerlo en el medio de aislamiento.
- Recoge los contenidos GV ligeramente gelificado con una pipeta y transferir a una placa de Petri que contenía solución de difusión.
- enjuagar rápidamente la punta de la pipeta en la solución de difusión, recoger el gel nuclear, y colocarlo en el centro de un porta bien previamente lleno de solución difusión. Añadir un cubreobjetos de 18 mm y colocar toda la diapositiva en una cámara húmeda. El jugo nuclear se dispersará lentamente durante los próximos 10 - 60 min y los cromosomas y orgánulos nucleares vendrá a tumbarse en la superficie del vidrio. </ Ol>
6. Observación preliminar de LBC y orgánulos
- Ver las LBC y orgánulos nucleares por contraste de fase (microscopio vertical convencional) a bajo aumento después de la dispersión de los contenidos nucleares en la cámara de difusión. Debido a que la cámara es de aproximadamente 1 mm de profundidad y el contenido nuclear son en la parte inferior, utilice un objetivo de baja magnificación con una larga distancia de trabajo (5X - 10X).
NOTA: La razón principal para el examen de la preparación en este momento es determinar si vale la pena llevar a través de los siguientes pasos. En una buena preparación de los cromosomas son ininterrumpida y se han depositado en el fondo de la cámara. Proceder a la etapa de centrifugación a una hora de hacer la preparación, ya que esto garantizará la óptima de los bucles de cromosomas lampbrush a la diapositiva.
7. La centrifugación de los Contenidos nucleares
- Coloque un pedazo de papel de filtro sobre el cubreobjetos y presione hacia abajopara eliminar el exceso de líquido de la cámara.
- Ponga aproximadamente 1 mm 3 de vaselina en cada lado del cubreobjetos. Fundir la gelatina de petróleo con una barra de metal se calienta a aproximadamente 70-80 ° C para sellar el cubreobjetos a la plaza de plástico subyacente.
- Colocar los portaobjetos en los soportes deslizantes para centrifugación, asegurándose de que los portadores opuestos están equilibrados. Centrifugar las diapositivas a aproximadamente 4.800 xg durante 30 min - 1 h. a 4 ° C. El uso de la función de arranque lento en la centrífuga.
8. La fijación de los contenidos nucleares
- Para la mayoría de los procedimientos posteriores, fijar los contenidos nucleares con paraformaldehído.
- Ponga una rejilla deslizante en un plato estándar de tinción del portaobjetos del microscopio y luego colocar las diapositivas individualmente en el bastidor. Añadir suficiente fijador para cubrir las diapositivas (2-4% de paraformaldehído en OR2 o PBS).
- Con un par de pinzas romas, empujar el cubre lateralmente, recogerlo y desecharlo en la basura copa adecuada.Deja diapositivas en el fijador durante al menos 15 - 30 min. Para la hibridación in situ y manchas más anticuerpos, períodos más largos de fijación (H o D) son permisibles.
- Para quitar el cuadrado de plástico, se desliza lugar de uno en uno en hielo frío OR2 o PBS en una placa de tinción. Inserte una hoja de afeitar afilada en el borde de la plaza de plástico y haga palanca suelta.
NOTA: Lo ideal sería que el plástico que vienen de forma limpia, dejando toda la cera de parafina en la diapositiva. La cera sirve para un propósito útil: ya que rodea la pequeña zona central donde los contenidos nucleares se unen a la corredera, que actúa como una presa que permitan trabajar con volúmenes pequeños (5-10 mu l) de reactivos para la inmunotinción, etc. Las diapositivas se llevará a cabo de forma indefinida en OR2 fría o PBS.
9. La inmunotinción de LBC y orgánulos nucleares
- Retirar una preparación GV fijo de almacenamiento en OR2 o PBS. Limpie el exceso de líquido y el lugar en los soportes en una cámara húmeda. Un chamb convenienteer es un plato de 90 mm x 15 Petri que contiene un círculo de 90 mm de papel de filtro húmedo.
NOTA: En este punto los contenidos nucleares están perfectamente acoplados a la diapositiva en un área circular de 5 mm libre de cera de parafina. Debido a que la cera es repelente al agua, uno puede cambiar las soluciones mediante la adición y la eliminación de pequeños volúmenes de líquido al borde de la zona central con una pipeta de 20 mL. La principal precaución es evitar tocar la zona libre de cera con la punta de la pipeta. - Llevar a cabo la inmunotinción con volúmenes pequeños (10 - 20 l) de los reactivos. Debido a que los cromosomas y orgánulos nucleares son muy pequeñas y en contacto inmediato con los reactivos añadidos, protocolos de tinción puede ser corto. veces la tinción de anticuerpos primarios y secundarios pueden ser tan cortos como 1 hr o menos. No incluya detergente en cualquier etapa, ya que esto causa un daño a la preparación. Si se desea, la preparación manchar con DAPI (1 mg / ml) durante 10 - 20 min para acentuar los ejes de los LBC.
- Monte en glicerol o un montaje comercialing medio adecuado para inmunofluorescencia. Para evitar atrapar una burbuja de aire durante la etapa de montaje, proceda de la siguiente manera.
- Tire 15 l de medio de montaje en la punta de una pipeta de 20 mL. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible de la zona contigua a la propagación nuclear "mecha" apagado con un trozo de papel de filtro (corte en la forma de un triángulo muy delgada de un círculo de 90 mm de # 1 papel de filtro).
- Pipeta de la mayor parte del medio de montaje en la preparación, teniendo cuidado de no tocar la superficie de la propagación nuclear. Coloque los últimos 1 l o menos de medio de montaje en el centro de un cubreobjetos de 22 mm (espesor # 1.5). Invertir el cubreobjetos sobre la preparación y colocar cuidadosamente en su lugar.
- Para montajes temporales, hasta unos pocos días, utilizar 1 mg fenilendiamina / ml en 50% de glicerol. Para montajes permanentes, sobre todo para los estudios de superresolución, utilizar un medio de baja fluorescencia que se endurece con un índice de refracción de aproximadamente 1,46.
10. La hibridación in situ fluorescente (FISH) de LBC y orgánulos Nuclear
- Debido a que los protocolos de FISH por lo general requieren una etapa a temperatura elevada, quitar la cera de parafina a partir de la preparación. Raspar cuidadosamente con una cuchilla de afeitar, aunque el procedimiento es tedioso y puede conducir a un daño accidental de la preparación. Es útil para marcar el área de la preparación en la parte posterior de la corredera con una punta de diamante.
- Como alternativa, disolver la cera de parafina con xileno. Configurar una serie de frascos de Coplin o platos de tinción que contienen: 30%, 50%, 70%, 95% y 100% de etanol; 3 envases de xileno; 2 contenedores más de 100% de etanol y una acetona.
- Colocar los portaobjetos en el soporte de diapositivas y deshidratar en la serie de etanol, dejando diapositivas 3 - 5 de minutos en cada concentración (tiempos más cortos si se agitan).
- Disolver la cera de parafina que pasa por las correderas a través de los 3 contenedores de xileno, aproximadamente 5 min cada uno si agitado. Eliminar elxileno mediante el paso a través de dos 100% etanoles, y finalmente eliminar el etanol con acetona. Tome las diapositivas a partir de acetona y la inclinación que se sequen.
- Llevar a cabo la hibridación in situ utilizando cualquier protocolo estándar. 15,16
11. El aislamiento de un aceite bajo GV
- Recoger a un ovocito de la solución OR2 con unas pinzas de joyero, incluyendo menor cantidad de tejido circundante como sea posible. Coloque el ovocito en un pequeño trozo de papel de filtro # 1. El exceso de solución OR2 transferirá al papel de filtro, dejando el ovocito casi libre de líquido. Recoger el ovocito "seca" y colocarla debajo de la superficie del aceite mineral ligero (aceite de parafina) en una pequeña placa de Petri (35 x 10 mm).
- Con una aguja de tungsteno fino o una púa del fórceps, meter un pequeño agujero en el ovocito cerca del polo animal oscuro. Recoger el ovocito con un par de pinzas (evitando las puntas) y apretar suavemente. El GV se extruir junto con un pequeño o lArger cantidad de yema en su superficie (Figura 3).
- Eliminar la mayor cantidad de yema como sea posible mediante el barrido suavemente la GV con el lado de la pinza. En la mayoría de los casos, será difícil de eliminar toda la yema. Sin embargo, para la mayoría de los propósitos una pequeña cantidad de yema de huevo no es un problema.
- Para observar el contenido GV, aplanar la GV en mayor o menor medida.
- Retire el cuadrado de plástico de una diapositiva y así utilizar la cera de parafina que queda como un recipiente poco profundo de aceite de parafina. 10 Recoge la GV junto con el aceite de parafina en una pipeta de 20 l y traslado al centro de la zona de parafina. Añadir un cubreobjetos y observar el contenido de la GV parcialmente aplanada. Esta técnica no daña los LBC.
- Alternativamente, aplanar la GV a aproximadamente 10 micras de espesor para la observación de los orgánulos nucleares.
- Cortar los finales de 1 mm de una punta de pipeta de plástico con una hoja de afeitar afilada. Chupar la GV en ella punta junto con exactamente 5 l de aceite mineral. Extruir la GV y todo el aceite en el centro de un cubreobjetos de vidrio 22 mm.
- Bajar un tobogán de 3 "x 1" vidrio estándar lentamente hasta que toque la gota de aceite. La caída y el cubreobjetos se levantarán por capilaridad y el aceite se extienda a los bordes del cubreobjetos. Cuando la caída se ha extendido completamente, el aceite será de aproximadamente 10 micras de espesor. Los LBC serán dañados y grandes nucleolos se comprimen ligeramente, pero la mayoría de los orgánulos nucleares más pequeñas van a aparecer más o menos, tal como existen en el GV intactos (Figura 3).
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Representative Results
Para examinar los cromosomas gigantes lampbrush se comienza por aislar ovocitos de rana o una salamandra. La figura 1 muestra un grupo de oocitos maduros en una solución salina tamponada después de la eliminación de los ovarios de la rana, Xenopus. Tales ovocitos se mantienen en buen estado durante varios días a temperatura ambiente. El núcleo (o vesícula germinal) se retira entonces de un ovocito con unas pinzas de joyero, o bien en una solución salina (Figura 2) o en aceite (Figura 3). El contenido nuclear de un núcleo de aceite aislado pueden ser examinadas por aplastando suavemente el núcleo y de observación mediante microscopía de contraste de fase o contraste diferencial de interferencia (DIC). Para examinar el contenido de un núcleo que ha sido aislado en una solución salina, hay que quitar primero la envoltura nuclear con unas pinzas de joyero y permitir que los contenidos se asientan sobre un portaobjetos de microscopio. La preparación se centrifugó entonces para unir tél cromosomas firmemente a la corredera, después de lo cual los cromosomas se pueden teñir con un anticuerpo (Figura 4) o sometidos a hibridación in situ. Los cromosomas lampbrush de salamandras son mucho más grandes que los de las ranas (Figura 5). En ambos casos, las unidades de transcripción individuales (genes) pueden ser vistos como bucles de cromatina que se proyectan lateralmente desde el eje cromosoma.
Figura 1: Los ovocitos maduros de la rana X. tropicalis. El ovario de una rana hembra madura contiene miles de ovocitos en diferentes etapas de maduración. Los más pequeños son el tamaño de las células somáticas y ya han llegado a la profase de la primera división meiótica. A medida que el ovocito crece, se acumula gradualmente yema de huevo, que da a la célula un aspecto blanco opaco. La estera más grandeovocitos Ure, que se muestran aquí, adquieren una tapa más oscuro debido a la acumulación de pigmento melanina. Los mayores ovocitos de X. tropicalis son alrededor de 0,8 mm de diámetro, los de X. laevis alrededor de 1,4 mm, mientras que las del axolotl son un enorme 2,2 mm. Excepto por el tamaño, los tres son similares en apariencia general. Barra de escala = 1 mm.
Figura 2: Extracción de la GV de un ovocito de X. tropicalis. Izquierda. Un pequeño agujero se hizo con unas pinzas de joyero en el polo animal más oscuro de un ovocito y la GV se extruyó suavemente. En este ejemplo, la GV estaba casi libre de yema como salió del ovocito. yema adherente puede retirarse por succión la GV dentro y fuera de una pipeta con un diámetro de la punta ligeramente mayor que el diámetro de la propia GV. Derecha. Three Planos generales de X. tropicalis. Estos GVs quedaron unos pocos minutos en un (solución GV aislamiento ajustado a pH 5,8) ligeramente ácido medio, lo que hace que la envoltura nuclear se hinche lejos de los contenidos nucleares gelificados. Planos generales tratados de esta manera no se extenderán para el examen citológico. Sin embargo, tales GVs son ideales para el análisis molecular: el sobre se puede quitar con los joyeros fórceps, proporcionar una muestra de los contenidos nucleares completamente libre de contaminación citoplasmática. 17,18 Barra de escala = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: GV de X. tropicalis aislado en aceite. Izquierda. Después de una pequeña punción se realizó en el ovocito, cerca de la po animales oscurale, la GV empezó a extruir. En este caso la GV salió con casi ninguna yema adherente. Medio. El GV es ahora completamente libre del citoplasma del ovocito. Tales Planos generales siguen transcribir ARN durante horas. Derecha. Después de la GV se aplasta suavemente en el aceite bajo un cubreobjetos, orgánulos nucleares pueden ser vistos por DIC, como se muestra aquí, o por contraste de fase. Toda la GV es mucho más grande que el área pequeña que se muestra aquí. HLB = cuerpo histona locus con tres manchas en su superficie. Barra de escala = 0,5 mm para dos primeros paneles, 10 micras para el tercero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: lampbrush cromosomas (LBC) del Axolotl A. mexicanum. Izquierda. Derecha. La misma preparación vista por la iluminación de campo oscuro. Ahora uno puede ver los numerosos nucleolos amplificados sin teñir. Barra de escala = 250 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Un LBC individual del Axolotl A. mexicanum y los tropicalis rana X., con el mismo aumento. Estas imágenes ilustran la diferencia de tamaño entre LBC extrema de una salamandra y una rana (recuadro). El tamaño diference se correlaciona con el contenido total de ADN de los genomas (alrededor de 30 libras esterlinas para A. mexicanum frente al 1,7 libras esterlinas para X. tropicalis). bucles laterales individuales (unidades de transcripción) son también mucho más tiempo en la salamandra que en la rana. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las primeras observaciones de LBC "vivos" de Planos generales aislado a mano de ranas y salamandras se hicieron hace casi 80 años por el biólogo estadounidense William Duryee, 19 antes de la introducción de contraste de fases y microscopía DIC, antes de la inmunotinción fluorescente, y antes de FISH. Las ventajas de LBC para investigar los detalles de la estructura cromosómica y la transcripción en el desarrollo necesario nivel de genes individuales de técnicas para la fijación del LBC a portaobjetos de vidrio, para solucionarlos de una manera realista, y aplicar técnicas moleculares sin destruir su morfología básica. Casi todas las técnicas para lograr estos objetivos se requiere cierta adaptación a las especies objeto de la investigación y un cierto compromiso entre la preservación natural y caracterización molecular. Por ejemplo, GVs y LBC de anfibios de cola son inusualmente fácil de trabajar debido a su enorme tamaño y la facilidad con la que el contenido de GV se dispersan en el medio apropiado. Tasta hace poco, sin embargo, muy poco se sabe acerca de sus genómica, lo que hace difícil correlacionar la cantidad de características citológicas con los detalles moleculares. A la inversa, LBC de Xenopus son bastante pequeñas en comparación con los de los anfibios de cola (Figura 5), pero los genomas de ambos X. tropicalis y X. laevis se han secuenciado y están razonablemente bien anotado.
Para aquellos que utilizan primera Planos generales de los anfibios, el reto más importante será para aislar la GV y quitar la envoltura nuclear sin dañar las LBC. Hasta la fecha, nadie ha descubierto una manera de quitar la envoltura, excepto a mano con unas pinzas de joyero. Sería un avance técnico importante si se encontrara una forma de "disolver" o "digerir" el sobre, pero dejan los cromosomas y otros orgánulos nucleares sin daños. Tal técnica sería igualmente útil para los estudios moleculares. En nuestras investigaciones sobre el ARN nuclear y citoplasmática encontramos que es esencialquitar la envoltura nuclear antes del análisis de ARN nuclear (Figura 2). 17,18 Si no se elimina el sobre, la pequeña cantidad de ARN nuclear es abrumado por la contaminación de ARN citoplásmico que se adhiere al exterior de la envolvente.
Otra mejora importante sería el descubrimiento de alguna manera de unir más estrechamente a LBC un portaobjetos de microscopio. La centrifugación de la preparación es crítica, pero incluso centrifugación prolongado (1 h a 4.500 xg) no garantiza la fijación. por lo general se puede decir cuando LBC están bien unidos mediante el examen con contraste de fase con una lupa medio. Bien unidos cromosomas no muestran movimiento browniano en absoluto. Si cualquier movimiento browniano de los bucles es detectable, protocolos de inmunotinción o pescado posteriores se llevan a grandes daños o pérdidas de material.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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