Summary
우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 생활에서 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 분리에 대한 간단한 기술을 제시한다. 우리는 위상차 또는 미분 간섭 대비하는 방법과 현장 하이브리드 또는 면역 염색에서 형광을 위해 그들을 해결하는 방법에 의해 "살아"이러한 염색체를 관찰하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 또는 unlaid 계란에서 발견 된 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 (LBCs)를 공부하는 방법을 설명합니다. 개인 LBCs의 최대 길이는 1mm 될 수 있으며 직경 0.5 mm로, 거대한 핵 자체를 상주합니다. 염색체의 크기가 커서 빛의 광학 현미경으로 활성 유전자 비할 관측을 허용하지만, 동시에 특별한 기술은 핵을 단리 핵막을 제거하고, 현미경 슬라이드 상 염색체 확산 필요하다. 또한 새싹 소포 (GV)라는 난자의 핵은 핵 굴지의 부분 겔을 허용하고 LBCs의 섬세한 구조를 보존하는 매체에 격리됩니다. 이 단계는 보석의 겸자를 사용하여 해부 현미경을 수동으로 수행된다. 다음으로, 핵 봉투는 보석의 집게 다시 수동으로 제거됩니다. 핵 내용은 신속하게 분산 외장 물감 매체로 전송굴지 젤 노변 장치 및 손상되지 않은 LBCs는 현미경 슬라이드에 정착 할 수 있습니다. 미세한 세부 사항은 브라운 운동에 의해 가려하고 있지만이 시점에서 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관은, 위상차 또는 미분 간섭 대비 현미경으로 볼 수 있습니다. 고해상도 현미경 관찰 또는 분자 분석을 위해, 전체 제조는 슬라이드에 단단히 섬세한 LBCs를 연결하는 원심 분리된다. 파라 포름 알데히드에 대한 간단한 고정 후 면역 염색으로 또는 현장 하이브리드에 따른다. LBCs는 전사적으로 활성 상태에있는 자신의 거대한 크기는 촛점 또는 초해 현미경을 사용하여 개별 유전자 수준의 분자량 분석을 허용한다.
Introduction
대부분의 척추 동물은, 유대류와 태반 포유류의 주목할만한 예외로 큰 노른자위의 계란을 생산하고 있습니다. 그들의 때로는 거대한 크기에도 불구하고,이 계란은 여성의 난소에있는 동안 아직 최종 차원에 도달 한 세포이다. 난소 계란 난자라고 각각은 일반적으로 단순히 새싹 소포 또는 GV으로 초기 19 세기부터 알려진 하나의 거대한 핵을 포함하고 있습니다. 일반 실험실 개구리, Xenopus의의 laevis의 및 Xenopus의의 tropicalis의 1 난 모세포는 1.2 mm 및 0.8 mm 각각 (그림 1)의 최대 직경에 도달한다. 직경 0.4 mm (그림 2, 3) -이 두 개구리의 성숙한 난자에서 GVS는 0.3이다. 도롱뇽은 일반적으로 더 큰 난자와 GVS 있습니다. 멕시코 아 홀로 틀, Ambystoma mexicanum의 완전히 성숙 난자는 직경이 2mm 이상이며, GV는 약 0.5 mm이다. 따라서, 이러한 핵 육안 및 캔을 쉽게 볼 수 있습니다전형적인 체세포 핵으로 불가능한 다양한 방법으로 조작 될 수있다.
마찬가지로 현저한은 GV, 19 세기 말에 이미 인식 사실 내 염색체의 거대한 크기이다. Ambystoma 다른 도롱뇽의 개별 염색체의 길이는 최대 1mm (그림 4, 5)이 될 수 있습니다. 100 μm의 이상 최대 길이로, 그들은 대부분의 생물의 일반적인 체세포 염색체를 난쟁이하지만 Xenopus의의 사람들은 작은 상당한 있습니다. 한 쌍의 측면 루프 백 (그림 5) - 난자의 염색체의 중요한 특징은 자신의 가장 특징적인 형태 학적 특징 중 하나에 이르게 자신의 특별한 전사 활동이다. 각 루프는 적극적으로 RNA를 합성 하나 또는 몇 전사 단위로 구성되어 있습니다. 루프는 난자가 피상적 후 이름이 "lampbrush"염색체에지도 퍼지 모양을 염색체 제공등유 램프 굴뚝을 청소하기 이전 시대에 사용 된 브러쉬에 유사. 이
이 논문의 초점은 LBCs 핵 세포 소기관 (핵소체, 히스톤 궤적 기관 및 얼룩을) 연구 고립 GVS의 사용에 있습니다. 두 아니라 다른 기술을 설명한다. 첫번째, 일반적인 기술에서, GVS 간단히 부착 난황을 제거하는 세정 보석의 집게를 이용하여 식염수에서 격리하고, 핵막은 보석의 집게 다시 제거된다. LBCs 핵 세포 소기관을 포함하는 젤라틴 내용은 유리 현미경 슬라이드 나 커버 슬립 상에 침강한다. 이러한 제제는 위상차 또는 DIC 현미경으로 직접 관찰 할 수있다. 또한, 준비는 슬라이드 또는 커버 슬립에 LBCs와 세포 기관을 연결하는 원심 분리 될 수있다. 이러한 준비 후, 주로 면역 및 fluorescen하여 핵산 및 단백질 분자의 상세한 분석을 위해 처리 될 수있다현장 하이브리드 (FISH)에서 t. 3-7
두 번째 기술은 광유에서 GV의 분리를 포함한다. 8 오일 절연 GVS는 많은 시간 동안 전사적으로 활성 상태로 유지 한 핵 내용이 가능한 한 실물되고 싶어 연구를위한 잠재적으로 유용하다. 핵 "SAP"의 굴절률이 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관 (그림 3)에 가까운이기 때문에 9, 10는, 현미경 기술은 석유 고립 GVS와 도전이 될 수 있습니다.
마지막으로, 그들의 크기와 조작의 용이성, GVS는 핵 봉투에 대한 연구에 이상적인 재료입니다. 핵 기공 단지는 최초의 수륙 양용 GV 봉투 (11)과 최근 수퍼 해상력의 관찰 전자 현미경 연구에서 설명 된 것과 동일한 재료를 사용하고 있습니다. 12, 13
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Protocol
일반 개구리와 도롱뇽에 대한 정보뿐만 아니라 동물의 소스는 다음 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다 Xenbase (http://www.xenbase.org)과 남자 이름 - 사이트 (http://www.ambystoma.org). 이 프로토콜은 과학 카네기 연구소의 발생학학과의 동물 관리 지침을 따른다.
1. 솔루션
- 교반하면서 1 M의 NaHCO3 탈 또는 탈 염소 H 2 O L (10)에 1 M CaCl2를 10 mL를 10 mL를 넣고 10 L "개구리 물"합니다.
- 1 L 20 % 파라 포름 알데히드를 확인 : 4 밀리미터 나 2의 1 L CO 3를 확인합니다. 화학 후드에서 용해 약 80 O를 C로 분말 파라 포름 알데히드 및 열 200g을 추가합니다. 여과지를 통해 냉각, 및 필터. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성 및주의하여 취급해야합니다. 대안 적으로, 상업적 파라 포름 알데히드 용액을 구입.
- 1 L 양서류 마취 용액을 에틸 3 aminoben의 1.5 g을 추가1 L 개구리 물 zoate 메탄. 실온에서 보관하십시오.
- 확인 1 L 난자 배양 배지 OR2 14 : 82.5 밀리미터의 NaCl, 2.5 밀리미터의 KCl, 1 mM의 염화칼슘 2, 1 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 나 2 HPO 4, 5 mM의 HEPES (500 MM의 주식, pH가 8.3에서). 최종 pH는 약 pH가 7.8이 될 것입니다. 세균의 성장을 방지하기 위해 100 mg을 암피실린 및 100 mg의 스트렙토 마이신을 추가합니다.
- 1 L GV 분리 솔루션이다 : 83 mM의 KCl을 17 mM의 염화나트륨, 6.5 밀리미터 나 2 HPO 4, 3.5 mM의 KH 2 PO 4, 1 ㎜의 MgCl 2, 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT). pH를 7.0으로 조정합니다.
- 100 ㎖ GV 분산 용액 확인 : 20.7 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 염화나트륨, 1.6 밀리미터 나 2 HPO 4, 0.9 mM의 KH 2 PO 4, 1 ㎜의 MgCl 2, 1 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 0.1 % 파라 포름 알데히드. pH를 7.0으로 조정합니다. 핵 젤의 더 빠른 확산을 용이하게하기 위해, 10 ~ 50 μm의 CaCl2를 추가 할 수 있습니다.
- 500 ML의 하도 솔루션을합니다. (2) 상업 젤라틴의 팽창 0.5 g10 분 - 5 0 mL의 H 2 O. 500 ㎖ 끓는 H 2 O를 추가하고 조심스럽게 젤라틴을 용해 소용돌이 친다. 시원하고 추가 50 mg을 CRK (SO 4) 2 · 12 H 2 O. 4 O C.에 흡입 및 저장소와 필터
- 매체를 장착 10 mL로. 5 ㎖의 PBS에 10 mg을 페닐 렌 디아민을 용해 (135 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 4.3 mM의 나 2 HPO 4, 1.5 mM의 KH 2 PO 4, pH를 9로 조정). 5 ML의 글리세롤을 추가합니다. C. O를 -80에서 250 μL 씩에 보관
2. 재료
- 자막도 슬라이드를 들어, 장소 3 인치 × 1 인치 유리 현미경은 상업 세제 용액에 슬라이드 및 오염 물질을 제거하도록 문질러. 슬라이드 랙에 위치하게 한 후, 탈 이온수, 수돗물에 잘 헹구어. 상기 하도 용액 슬라이드를 담근 각도 드레인 60 O C.에서 밤새 구워
- 플라스틱 사각형 들어, 1mm 두께의 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 시트로부터 25mm의 정사각형으로 잘랐다. 드릴각 사각형의 중심에 5mm 둥근 구멍. 모래 얼굴 사각형뿐만 아니라, 구멍의 둘레의 가장자리 양쪽 모두.
주 : 다음 단락에 설명 된 것처럼 플라스틱 사각형 및 웰 슬라이드 제의 대안으로, PCR 원위치 혼성화 챔버 (25 μL) 상용 접착제를 사용한다. 이 철저 아직대로 테스트되지 않았습니다 있지만 하나는 아마도, 세포 배양을위한 재사용 가능한 실리콘 절연체를 사용할 수 있습니다. - 핫 플레이트에 50 mL 유리 비커에 - (57 O를 C 56) 파라핀 왁스 30g - 잘 슬라이드를 들어, 20 용융. 20 μL 피펫하는 자막도 슬라이드의 중심의 각 측면에 하나의 파라핀 5 μL 강하를 확산. 파라핀에 플라스틱 광장을 누르고 핫 플레이트에 슬라이드를 배치합니다. 파라핀이 녹아 및 플라스틱 광장에서 균일하게 확산한다.
- 핫 플레이트에서 슬라이드를 제거하고 냉각 할 수 있습니다. 슬라이드의 각 끝에서 지원을 배치, 그래서 슬라이드는 TABL 접촉하지 않습니다냉각 과정 etop. 파라핀이 너무 빨리 냉각하면, 거리 중심 홀에서 풀 수있다. 10 개 이상의 잘 슬라이드를 준비 : 각 GV 준비는 새로운 잘 슬라이드를 사용합니다.
- 원심 분리를위한 슬라이드 사업자의 경우, 특별히 사용되는 로터에 대한 캐리어를 제작 사용합니다. 잘 플라스틱 판 - 여러 제조 업체는 96 캐리어와 함께 원심 분리기를 제공합니다. 이러한 담체는 현미경 슬라이드를 보유하는 것은 매우 용이하게 적용 할 수있다.
난 모세포 3. 분리
- 완전히 동물을 커버하기에 충분한 마취 용액의 성인 여성 개구리 (Xenopus의의 laevis의 또는 Xenopus의의 tropicalis) 또는 도롱뇽 (Ambystoma의 mexicanum)를 놓습니다. 동물이 운동을 중단 할 때, 그것을 적당한 용기에 부서진 얼음의 침대에 배 업을 배치합니다.
- 수술 가위는 2 -로 - 하복부에서 3cm의 절개를 정중선 측 방향. (제 절개 측의 난소를 찾는 부드럽게 따로 내장 이동감수 두 개의 난소, 복부의 각 측면에 하나)입니다. 계획된 실험에 대한 충분한 난자와 난소의 일부를 잘라. 난자 수천 각 난소 있기 때문에, 난소의 비교적 작은 부분 (1~3cm)는 대개 충분할 것이다.
- 하나 실온에서 큰 페트리 접시 (100mm)에 OR2 식염수에 난소의 몇 가지를 놓습니다. 손상된 난자가 제거되면 난자는 며칠 동안 양호한 상태로 저장 될 수 있고, OR2 용액을 매일 변경된다.
- 수술 실크 절개를 봉합 및 복구를 위해 개별 유리 그릇에 동물을 반환합니다. 이 의식 (약 15 분)을 회복 할 때까지 동물을 충당하기 위해 충분한 "개구리 물"을 추가합니다. 동물이 자발적인 움직임을 표시 한 후, 물 그릇을 채우십시오. 신선한 물을 사용해야하지만 양서류 수술 후 감염되고 거의 절대로, 불임은 필요하지 않습니다. 원한다면, 네오 마이신은 봉합사에 적용될 수있다. 상처는 일반적으로 철 후 완전히 치유w 일 같은 동물 약 2 개월 후에 다시 사용할 수있다.
어린 싹 소포 (GV) 4. 분리
- OR2 솔루션을 포함하는 작은 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)에서 - (20 대 난자 10) 난소의 일부를 놓습니다.
- 난소 벽에 난자를 연결하는 조직의 얇은 줄기를 찢어 # 5 보석의 포셉 두 쌍을 이용하여 난소에서 난자를 제거합니다. GV 분리 매체를 포함하는 다른 작은 배양 접시에서 난자를 놓습니다.
참고 : LBCs의 상태는 난자의 크기 (만기)에 따라 달라집니다. LBCs 전체 크기보다 약간 작은 난자에 눈에 띄는 루프와 최대 길이에 도달합니다. 가장 성숙한 난자는 종종 계약 루프 짧은 염색체가 포함되어 있습니다. - 해부 현미경 (- 20mm 필드 직경 약 10)의 낮은 배율에서 다음 단계를 수행하십시오.
- 동물 극 (어두운 반구) 근처 포셉의 두 쌍 난자를 잡고 및 SM을모든 눈물. 투명 난자 핵의 압출 노른자에서 봐, 또한 새싹 소포 또는 GV했다.
- 또한, 포셉 한 쌍의 동물 극 근처에 큰 구멍을 찌를 부드럽게 노른자 (그림 2)와 함께 GV을 짠다.
- 부드럽게 떨어져 노른자의 대부분에서 GV를 굴립니다. 일반적으로 GV에 단단히 부착 노른자의 작은 금액이있을 것이다.
핵 봉투 5. 제거
- X.의 laevis의 및 X. tropicalis를 들어, 여전히 약간의 난황 부착이 있어도, 절연 60 초 이내에 분산 매질에 분리 매체로부터 GV 옮긴다.
주 : 절연 매체에 좌측 및 후속 단계에 확산하지 않을 경우 GVS 이들 두 종의 약 60 초 이내에 "경화". 제노 GV 내용을 살펴보면 때문에 속도가 매우 중요하다.- 한 쌍과 GV의 상단에있는 핵 봉투를 잡고보석의 집게의주의하면서 아래로 누릅니다 없습니다. 가능한 첫번째에 근접 포셉 번째 쌍 봉투를 잡고. 멀리 서로와 GV 내용이 하나 또는 두 집게로 단단히 부착 봉투, 중 무료 "팝업"됩니다에서 집게의 두 쌍을 당깁니다.
- 유리 피펫의 GV 내용 또는 조정 20 μL의 마이크로 피펫을 선택합니다. 조정 피펫을 사용하는 경우, 10 μL에 피펫을 설정하고 면도날과 플라스틱 팁의 끝을 잘라. 나머지 5 μL에서 GV를 따기 전에 액체의 5 μL에 그립니다.
- 이전에 솔루션을 확산 가득 잘 슬라이드의 중심에 정지 겔화 핵 내용을 전송합니다. 커버 슬립을 첨가하면 기포가 트랩되지 않도록 분산 용액 볼록면을 가져야한다.
- 커버 슬립 (18mm)를 추가하고 촉촉한 챔버에서 슬라이드를 배치합니다. 핵 젤은 천천히 다음 10 위에 분산합니다 - 60 분 그래서 염색체S 핵 소기관 유리 슬라이드 표면에 놓여왔다.
참고 : 도롱뇽 A를 mexicanum의 GVS와 N. viridescens이 과도하게 격리 매체에 "강화"하지 않습니다. 따라서 하나는 Xenopus의 하나보다 핵 봉투의 제거에 더 여유롭게 진행할 수 있습니다.
- 5.1.1 절에 설명 된대로 도롱뇽 GV에서 핵 봉투를 제거하지만, 절연 매체에 그렇게.
- 피펫으로 약간 겔화 GV 내용을 선택하고 확산 솔루션을 포함하는 배양 접시에 전송합니다.
- 신속하게 확산 용액에 피펫 팁을 씻어 핵 젤을 선택하고, 이전에 솔루션을 확산 가득 잘 슬라이드의 중앙에 배치합니다. 18 밀리미터 커버 슬립을 추가하고 촉촉한 챔버에 전체 슬라이드를 배치합니다. 핵 수액은 천천히 다음 10을 통해 분산됩니다 - 60 분, 염색체 핵 세포 소기관은 유리 표면에 거짓말을 올 것이다. </ OL>
LBCs 소기관 6. 예비 관측
- 확산 실에서 핵 내용의 분산 후 낮은 배율에서 위상차 (기존의 직립 현미경)에 의해 LBCs 핵 세포 기관을 볼 수 있습니다. (- 10X 5X)는 챔버가 약 1mm 깊이 핵 내용 하단 때문에 긴 작동 거리와 저배율 대물 렌즈를 사용한다.
주 :이 때의 제조 검사의 주요 이유는 다음 단계를 수행 할 가치가 있는지 여부를 결정하는 것이다. 좋은 대비하여 염색체 단절하고 상기 챔버의 바닥에 침전했다. 이 슬라이드에 lampbrush 염색체 루프의 최적의 부착을 보장하는 바와 같이, 제제의 제조 시간 이내에 원심 분리 단계로 진행.
핵 내용의 7 원심 분리
- 커버 슬립에 필터 종이를 놓고 눌러챔버에서 초과 액체를 제거합니다.
- 커버 슬립의 각 측면에 석유 젤리 약 1mm 3을 넣습니다. 기본 플라스틱 광장에 커버 슬립을 밀봉하기 위해 80 O를 C - 70로 가열 금속 막대와 석유 젤리 용융.
- 장소 원심 분리를위한 슬라이드 캐리어에 슬라이드를 만드는 확실히 그 반대 캐리어는 균형이다. 1 시간 - 30 분 동안 약 4800 XG에 슬라이드를 원심 분리기. 4 O C. 사용하여 원심 분리기에 슬로우 스타트 기능에서.
8. 핵 내용 수정
- 대부분의 후속 절차, 파라 포름 알데히드와 핵 내용을 수정합니다.
- 표준 현미경 슬라이드 염색 접시로 슬라이드 랙을 넣고 다음 랙에 개별적으로 슬라이드를 배치합니다. (- OR2 또는 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 2) 슬라이드를 커버하기에 충분한 정착액을 추가합니다.
- 무딘 포셉 한 쌍으로, 횡 방향으로 커버 슬립을 밀어, 그것을 선택하고 적절한 유리 쓰레기통에 버리십시오.30 분 - 최소 15 정착액에 슬라이드를 둡니다. 위해 현장 하이브리드 대부분의 항체 얼룩에, 고정의 긴 기간 (시간 또는 d)는 허용된다.
- 플라스틱 사각형을 제거하려면, 장소는 염색 접시에 얼음에 한 번 감기 OR2 또는 PBS에 하나의 슬라이드. 플라스틱 광장의 가장자리에 날카로운 면도날을 삽입하고 느슨한을 올립니다.
참고 : 이상적으로 플라스틱, 깨끗하게 벗겨 슬라이드에있는 모든 파라핀 왁스를 떠날 것입니다. 왁스 유용한 목적을 제공 : 그것은 핵 내용이 상기 슬라이드에 부착 된 작은 중앙 영역을 둘러싸고 있기 때문에, 그것은 하나의 작은 부피에서 작동 할 수 있도록하는 댐의 역할 - 등 면역 염색 용 시약 (5-10 μL). 슬라이드는 차가운 OR2 또는 PBS에 무기한으로 유지 될 수있다.
LBCs 및 핵 소기관 9. 면역 염색
- OR2 또는 PBS 스토리지에서 고정 GV 준비를 제거합니다. 촉촉한 챔버에 지원에 과량의 액체과 장소를 닦아냅니다. 편리한 chambER은 습윤 여과지 90mm 원을 함유하는 90 X 15mm 페트리 접시.
주 :이 시점에서 핵 내용 단단히 파라핀 왁스 프리 5mm의 원형 영역에서 상기 슬라이드에 부착된다. 왁스 발수성이므로, 하나의 첨가 : 20 μL 피펫 중앙 영역의 가장자리에 액체의 소량을 제거하여 솔루션을 변경할 수있다. 주요주의 사항은 피펫 팁과 왁스없는 영역에 손이 닿지 않도록하는 것입니다. - 시약 - (20 μL 10) 작은 볼륨으로 면역 염색을 실시하고 있습니다. 염색체와 핵 세포 소기관이 매우 작고 추가 시약과 직접 접촉하기 때문에, 염색 프로토콜은 짧은 될 수 있습니다. 일차 및 이차 항체 염색 시간이 1 시간 이하로 짧게 할 수있다. 이 준비 손상의 원인으로, 어떤 단계에서 세제를 포함하지 마십시오. LBCs의 축들을 강조하기 위해 20 분 - 경우에 따라, 10 DAPI와 제조 (1 μg의 / ml)로 염색.
- 글리세롤 마운트 또는 상업적 마운트면역에 대한 매체에 적합한 보내고. 설치 단계에서 기포를 트래핑 방지하려면 다음을 수행하십시오.
- 20 μL 피펫의 끝으로 매체를 장착 15 μL를 당깁니다. (# 1 여과지의 90mm 원에서 매우 얇은 삼각형 모양의 컷) 여과지로 오프 "위킹"바로 핵 확산 주변에서 많은 액체 최대한 제거한다.
- 핵 확산의 영역을 만지지 않도록 조심하면서, 준비에 장착 매체의 대부분을 피펫. 지난 1 μL를 놓거나 22mm의 coverslip에 (두께 # 1.5)의 중심에 매체를 장착 그래서. 준비를 통해 커버 슬립을 반전 제자리에 조심스럽게 놓습니다.
- 임시 탑재 들어 몇 일까지 50 %의 글리세롤을 1 ㎎ / ㎖의 페닐 렌을 사용한다. 고정 마운트를 들어, 수퍼 해상도 특히 연구를 들어 약 1.46의 굴절율을 경화 낮은 형광 매질을 사용한다.
제자리 교잡 (FISH) LBCs의 원자력 소기관 10. 형광
- FISH 프로토콜은 일반적으로 높은 온도에서 단계를 필요로하기 때문에, 준비에서 파라핀 왁스를 제거합니다. 절차가 지루과 준비의 우발적 인 손상을 초래할 수 있지만, 조심스럽게, 면도날로 긁어. 다이아몬드 포인트 슬라이드 뒷면의 준비의 영역을 표시하는 데 유용합니다.
- 대안 적으로, 자일 렌과 파라핀을 용해. 코 플린 항아리 또는 함유 염색 요리 시리즈 셋업 : 30 %, 50 %, 70 %, 95 %, 100 % 에탄올; 자일 렌의 3 용기; 100 % 에탄올과 하나 아세톤의 2 이상의 컨테이너.
- (교반 경우 짧은 시간) 5 분 각각의 농도 - 슬라이드 캐리어에 슬라이드를 놓고 3 슬라이드를 떠나, 에탄올 시리즈를 탈수.
- 자일 렌의 3 컨테이너를 통해 슬라이드를 전달하여 파라핀 왁스를 녹여, 약 5 분 각 교반합니다. 제거이 100 % 에탄올을 통과하여 자일 렌, 그리고 마지막으로 아세톤과 에탄올을 제거합니다. 아세톤에서 슬라이드를 타고 건조를 기울이십시오.
- 표준 프로토콜을 사용하여 현장 하이브리드에 실시한다. (15, 16)
오일 아래 GV 11. 분리
- 가능한 한 적은 주변 조직을 포함하여 보석의 집게와 OR2 용액으로부터 난자를 선택합니다. # 1 여과지의 작은 조각에 난자를 놓습니다. 과량 OR2 용액 액체 거의없는 난자두고 여과지로 전송된다. "가공"난자를 들고 작은 페트리 접시 (35 × 10 ㎜)에 경량 미네랄 오일 (파라핀 오일)의 표면 아래에 배치합니다.
- 미세 텅스텐 바늘이나 집게의 한 가지로, 어두운 동물 극 근처의 난자에 작은 구멍을 찌를. (팁을 피할 수) 포셉 한 쌍의 난자를 들고 가볍게 짠다. GV가 작거나 L을 따라서 돌출 할표면에 노른자의 arger 금액 (그림 3).
- 부드럽게 포셉의 측면과 함께 GV를 청소하여 가능한 한 많은 노른자를 제거합니다. 대부분의 경우, 난황을 모두 제거하기 어렵다. 그러나, 대부분의 용도 노른자 소량의 문제가 아니다.
- GV 컨텐츠를 관찰하기 위해, 더 많거나 적은 정도로 GV 평탄화.
- 잘 슬라이드에서 플라스틱 사각형을 제거하고 파라핀 오일 얕은 용기로 남아있는 파라핀 왁스를 사용합니다. 10 : 20 μL 피펫 파라핀 오일과 함께 GV을 픽업 파라핀 영역의 중심에 옮긴다. 커버 슬립을 추가하고 부분적으로 평평 GV의 내용을 관찰합니다. 이 기술은 LBCs에 손상을주지 않습니다.
- 또한, 핵 세포 기관의 관찰 약 10 μm의 두께로 GV를 평평하게.
- 날카로운 면도날 플라스틱 피펫 팁의 최종 1mm 잘라. 에 GV를 빨아미네랄 오일 정확히 5 μL와 함께 팁. 22 밀리 유리 커버 슬립의 중심 상 GV 모든 오일 돌출.
- 그냥 기름 방울에 닿을 때까지 천천히 표준 3 "× 1"유리 슬라이드를 낮 춥니 다. 드롭 및 커버 슬립은 모세관 현상에 의해 해제되고 오일은 커버 슬립의 가장자리에 전파됩니다. 드롭이 완전히 확산되면 석유는 약 10 μm의 두께 될 것입니다. LBCs가 손상되고 큰 핵소체가 약간 압축됩니다,하지만 그들은 그대로 GV에서 (그림 3) 존재하는 작은 핵 세포 기관의 대부분은 더 많거나 적게 나타납니다.
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Representative Results
거대한 lampbrush 염색체를 검사하려면 하나는 개구리 나 도롱뇽에서 난 모세포를 분리하는 것으로 시작한다. 도 1은 개구리 제노의 난소 제거 후 완충 식염수 성숙한 난자들의 그룹을 나타낸다. 이러한 난자는 실온에서 일하기 좋은 상태로 남아 있습니다. 핵 (또는 새싹 소포는) 다음 중 하나 식염수 (그림 2) 또는 기름에, 보석상의 집게와 난자에서 (그림 3)을 제거한다. 오일 고립 된 핵의 핵 내용은 부드럽게 핵을 부수 및 위상 대비 또는 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경으로 관찰하여 조사 할 수있다. 식염수에서 격리 된 핵의 내용을 검사하기 위해, 하나는 제 보석의 집게 핵막을 제거하고 내용물을 현미경 슬라이드 상에 정착 할 수 있도록한다. 제조는 다음 t를 연결하는 원심 분리그는 염색체가 항체 (그림 4)로 염색 또는 현장 하이브리드에 실시 할 수있는 후 슬라이드에 단단히 염색체. 도롱뇽의 lampbrush 염색체 개구리 (그림 5)보다 훨씬 크다. 두 경우에서 개별 전사 단위 (유전자) 염색체 축으로부터 측 방향으로 돌출 염색질의 루프로 볼 수있다.
그림 1 : 개구리 X를 tropicalis에서 성숙한 난 모세포. 성숙한 여성의 개구리의 난소가 성숙의 다른 단계에서 난자의 수천을 포함하고 있습니다. 가장 작은 체세포의 크기이며, 이미 첫 번째 감수 분열의 의향에 도달했습니다. 난자가 성장함에 따라, 점차 셀을 불투명 한 흰색 외관을주는, 노른자를 축적한다. 가장 큰 매트여기에 표시된 URE 난자는 인해 멜라닌 색소의 축적에 어두운 캡을 획득. X. tropicalis의 가장 큰 난자는 홀로 틀의 사람들은 거대한 2.2 mm 인 반면 X.들 약 1.4 mm를 laevis의 직경이 약 0.8 mm이다. 크기를 제외하고, 세 가지 일반적인 모양이 비슷합니다. 스케일 바 = 1mm.
그림 2 : X를 tropicalis의 난자에서 GV의 제거. 왼쪽. 작은 구멍이 난자의 어두운 동물 극에서 보석상의 집게로 만든하고 GV 부드럽게 압출 하였다. 는 난자에서 나온이 예에서는 GV는 노른자의 거의 무료이다. 접착 난황은 GV 자체의 직경보다 단지 약간 더 큰 팁 직경과 피펫 밖으로 GV를 흡인하여 제거 할 수있다. 권리. 티X.의 tropicalis의 GVS HREE. 이 GVS는 핵 봉투가 떨어져 겔화 핵 내용에서 팽창하도록하는 약간 산 배지 (pH를 5.8로 조정 GV 분리 솔루션)에서 몇 분 남았다. 이 방식으로 처리 GVS는 세포 학적 검사를 위해 전파되지 않습니다. 그러나, GVS 분자 분석에 이상적입니다 : 봉투는 세포질 오염의 완전 무료 핵 내용의 샘플을 제공, 보석상의 집게로 제거 할 수 있습니다. 17, 18 스케일 바 = 0.5 mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 기름에 고립 된 X를 tropicalis의 GV. 왼쪽. 작은 구멍이 어두운 동물 포 근처 난자에서 만든 후제작은 GV가 돌출하기 시작했다. 이 경우 GV는 거의 자기편 노른자로 나왔다. 중간. GV 이제 난자의 세포질에서 완전 무료입니다. 이러한 GVS 시간 동안 RNA를 전사하는 것을 계속한다. 권리. GV가 부드럽게 커버 슬립에 따라 기름에 숙청 된 후, 핵 세포 소기관은 다음과 같이, DIC 볼, 또는 위상차에 의해 할 수있다. 전체 GV는 여기에 표시된 작은 영역보다 훨씬 크다. HLB는 그 표면에 3 얼룩 무늬 히스톤 궤적 체 =. 스케일 바 처음 두 패널 = 0.5 mm, 제 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Lampbrush 염색체 (LBCs)이 홀로 틀 A를 mexicanum에서. 왼쪽. 권리. 같은 준비는 암시 야 조명 볼. 하나는 지금 수많은 흠 증폭 핵소체를 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 250 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 동일한 배율에서 홀로 틀 A에 mexicanum와 개구리 X를 tropicalis에서 단일 LBC. 이러한 이미지는 도롱뇽의 LBCs와 개구리 (삽입) 사이의 극단적 인 크기 차이를 보여줍니다. differen 크기CE 마크는 (X를 tropicalis 1.7 GBP 대 A.의 mexicanum 약 30 GBP) 게놈의 전체 DNA의 내용과 상관 관계. 개인 측면 루프 (전사 단위) 개구리보다 훨씬 더 도롱뇽에도 있습니다. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
개구리와 도롱뇽의 손으로 고립 GVS에서 "생활"LBCs의 첫 번째 관찰은 형광 면역 염색 전에 FISH 전에 미국의 생물 학자 윌리엄 Duryee, 위상차 및 DIC 현미경의 도입 전에 (19)에 의해 거의 80 년 전에 만들어졌다. 실제와 방식으로이를 해결하기 위해, 그들의 기본 형태를 파괴하지 않고 분자 기술을 적용, 유리 슬라이드에 LBCs를 연결하는 기술의 개별 유전자 레벨에 필요한 개발에서 염색체 구조와 전사의 세부 사항을 조사하는 LBCs의 장점. 이러한 목표를 달성하기 위해 거의 모든 기술은 조사에서 종과 실물 보존 및 분자 특성 사이에 타협에 약간의 적응이 필요합니다. 예를 들어, GVS 및 꼬리 양서류 LBCs이 때문에 거대한 크기와 GV 내용을 적절한 매질에 분산되는 용이성과 작업 할 비정상적 쉽다. 유ntil 그러나 최근 약간 어려운 분자 세부 세포 학적 기능의 부의 상관 관계를 만들고, 자신의 게놈에 대한 알려져있다. 반대로, Xenopus의의 LBCs은 꼬리 양서류 (그림 5)의에 비해 아주 작은, 그러나 모두 X를 tropicalis 및 X를 laevis의의 게놈은 서열화되어 있고 합리적으로 잘 주석있다.
그 첫 번째 사용 수륙 양용 GVS를 들어, 주요 과제는 GV를 분리하고 LBCs을 손상시키지 않고 핵 봉투를 제거하는 것입니다. 지금까지 아무도 보석상의 집게 손 제외 봉투를 제거하는 방법을 발견하지 않았다. 방법은 "용해"또는 봉투를 "소화"하지만 손상되지 않은 염색체와 다른 핵 세포 기관을 떠나 발견 된 경우는 주요 기술 사전 될 것이다. 이러한 기술은 분자 연구에 동등하게 유용 할 것이다. 핵 및 세포질 RNA에 대한 우리의 연구에서 우리는하는 것이 필수적 발견핵 RNA (그림 2)의 분석하기 전에 핵 봉투를 제거합니다. 엔벨로프가 제거되지 않는 경우 (17, 18)은 핵 RNA의 소량 봉투의 외부에 부착 세포질 RNA 오염 압도된다.
또 다른 주요 개선 현미경 슬라이드에 더 밀접하게 LBCs을 첨부 할 수있는 방법의 발견이 될 것이다. 준비의 원심 분리가 중요하지만, 심지어 장시간 원심 분리 (1 시간 XG 4500에서) 첨부 파일을 확인하지 않습니다. LBCs 잘 매체 확대에 따라 위상차로를 검사하여 장착하면 하나는 일반적으로 알 수 있습니다. 염색체가 전혀 브라운 운동을 표시하지 잘 붙어 있습니다. 루프의 브라운 운동이 검출 될 경우, 이후의 면역 염색 또는 FISH 프로토콜은 광범위한 손상이나 재료의 손실을 초래할 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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