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Genetics

मेंढक और सैलामैंडर के लिविंग Oocytes से विशाल Lampbrush गुणसूत्रों का अलगाव

Published: December 5, 2016 doi: 10.3791/54103
Automatic Translation
1, 1
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science

Summary

हम मेंढक और सैलामैंडर के oocytes रहने से विशाल transcriptionally सक्रिय lampbrush गुणसूत्रों को अलग-थलग करने के लिए सरल तकनीक मौजूद है। हम इन गुणसूत्रों "जीवित" निरीक्षण करने के लिए कैसे चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत है, और कैसे सीटू संकरण या immunofluorescent धुंधला में फ्लोरोसेंट के लिए उन्हें ठीक करने से वर्णन है।

Abstract

हम विशाल transcriptionally सक्रिय lampbrush गुणसूत्रों (LBCs) oocyte, या unlaid अंडा, मेंढक और सैलामैंडर के में पाया अध्ययन के लिए विधियों का वर्णन। व्यक्तिगत LBCs लंबाई में अप करने के लिए 1 मिमी हो सकता है और वे एक विशाल नाभिक में व्यास में 0.5 मिमी तक रहते हैं, खुद को। गुणसूत्रों के बड़े आकार सक्रिय जीन की यात्रा करने वालों टिप्पणियों प्रकाश ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा परमिट, लेकिन एक ही समय में विशेष तकनीक नाभिक को अलग-थलग, परमाणु लिफाफा हटाने, और एक खुर्दबीन स्लाइड पर गुणसूत्रों के प्रसार के लिए आवश्यक हैं। oocyte नाभिक भी कीटाणु पुटिका (जीवी) कहा जाता है, एक माध्यम है कि परमाणु actin के आंशिक बीच बढ़िया तालमेल की अनुमति देता है और LBCs के नाजुक संरचना को बरकरार रखता है में अलग है। यह कदम जौहरी संदंश का उपयोग कर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल रूप से बाहर किया जाता है। अगले, परमाणु लिफाफा जौहरी संदंश के साथ हटा दिया जाता है, फिर मैन्युअल। परमाणु सामग्री को जल्दी से एक माध्यम है कि dispe करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैंactin जेल rses और undamaged LBCs एक खुर्दबीन स्लाइड पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है। इस बिंदु पर LBCs और अन्य परमाणु अंगों, चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखी जा सकती है, हालांकि बेहतर जानकारी ब्राउनियन गति से छिप जाते हैं। उच्च संकल्प सूक्ष्म अवलोकन या आणविक विश्लेषण के लिए, पूरी तैयारी स्लाइड के लिए मजबूती से नाजुक LBCs संलग्न करने के लिए centrifuged है। Paraformaldehyde में एक संक्षिप्त निर्धारण तो immunofluorescent धुंधला द्वारा या स्वस्थानी संकरण में पीछा किया जाता है। LBCs एक transcriptionally सक्रिय स्थिति में हैं और उनके विशाल आकार confocal या सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग व्यक्तिगत जीन स्तर पर आणविक विश्लेषण परमिट।

Introduction

सबसे रीढ़, मारसुपायल्स और अपरा स्तनधारियों की उल्लेखनीय अपवाद के साथ, बड़े yolky अंडे का उत्पादन। उनकी कभी कभी विशाल आकार के बावजूद, इन अंडों एकल कक्षों है कि महिला के अंडाशय में जबकि अभी भी उनके अंतिम आयाम तक पहुंच रहे हैं। डिम्बग्रंथि अंडे oocytes कहा जाता है और प्रत्येक आम तौर पर एक विशाल नाभिक, कीटाणु पुटिका या बस जीवी के रूप में जल्दी 19 वीं सदी के बाद से जाना जाता है शामिल हैं। आम प्रयोगशाला मेंढ़क, Xenopus laevis और Xenopus tropicalis के 1 Oocytes, 1.2 मिमी और 0.8 मिमी क्रमशः (चित्रा 1) की एक अधिकतम व्यास तक पहुँचने। व्यास में 0.4 मिमी (आंकड़े 2, 3) - ये दो मेंढ़कों के परिपक्व oocytes से जीवीएस 0.3 रहे हैं। सैलामैंडर आम तौर पर भी बड़ा oocytes और जीवीएस है। मैक्सिकन Axolotl, Ambystoma mexicanum की पूरी तरह से परिपक्व oocytes, व्यास में अधिक से अधिक 2 मिमी और जीवी 0.5 मिमी के बारे में है। इस प्रकार, इन नाभिक आसानी से नग्न आंखों और कैन में दिखाई दे रहे हैंकई मायनों में विशिष्ट दैहिक कोशिकाओं के नाभिक के साथ असंभव है कि में हेरफेर किया।

समान रूप से उल्लेखनीय जीवी, एक तथ्य यह है 19 वीं सदी के अंत में पहले से ही मान्यता प्राप्त भीतर क्रोमोसोम के विशाल आकार है। Ambystoma और अन्य सैलामैंडर के व्यक्तिगत गुणसूत्रों लंबाई में अप करने के लिए 1 मिमी (आंकड़े 4, 5) हो सकता है। Xenopus के वे काफी छोटे होते हैं, हालांकि 100 माइक्रोन या अधिक करने के लिए लंबाई के साथ, वे सबसे जीवों की ठेठ दैहिक गुणसूत्रों बौना। बनती पार्श्व छोरों के सैकड़ों (चित्रा 5) - oocyte गुणसूत्रों की एक महत्वपूर्ण विशेषता उनकी असाधारण ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि है, जो उनकी सबसे विशेषता रूपात्मक सुविधाओं में से एक की ओर जाता है। प्रत्येक लूप एक या कुछ प्रतिलेखन इकाइयों को सक्रिय रूप से synthesize कि शाही सेना के होते हैं। छोरों oocyte एक फजी उपस्थिति है, जो उनके सतही के बाद नाम "lampbrush" गुणसूत्र का नेतृत्व करने के गुणसूत्रों देनापहले के समय में इस्तेमाल मिट्टी के तेल दीपक चिमनी साफ करने के लिए ब्रश को समानता। 2

इस पत्र का ध्यान केंद्रित पृथक जीवीएस के उपयोग LBCs और परमाणु अंगों (nucleoli, हिस्टोन ठिकाना निकायों, और speckles) का अध्ययन करने पर है। दो नहीं बल्कि विभिन्न तकनीकों का वर्णन किया जाएगा। पहला, अधिक आम तकनीक में, जीवीएस जौहरी संदंश का उपयोग कर एक नमकीन घोल में अलग कर रहे हैं, संक्षेप में पक्षपाती जर्दी को दूर करने के rinsed और परमाणु लिफाफा जौहरी संदंश के साथ फिर से निकाल दिया जाता है। पतला सामग्री, LBCs और परमाणु अंगों से युक्त, एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड या coverslip पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जाती है। इस तरह की तैयारी सीधे चरण विपरीत या डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, तैयारियों स्लाइड या coverslip करने के लिए LBCs और अंगों संलग्न करने के लिए centrifuged किया जा सकता है। इस तरह की तैयारी तो, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की विस्तृत आणविक विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती मुख्य रूप से immunofluorescence और fluorescen द्वारासीटू संकरण (मछली) में टी। 3-7

एक दूसरी तकनीक खनिज तेल में जी.वी. के अलगाव शामिल है। 8 तेल-पृथक जीवीएस कई घंटे के लिए transcriptionally सक्रिय रहते हैं और पढ़ाई जहां एक परमाणु सामग्री के रूप में संभव के रूप में सजीव होना चाहता है के लिए संभावित रूप से उपयोगी हैं। 9,10 क्योंकि परमाणु "एसएपी" का अपवर्तनांक LBCs और अन्य परमाणु अंगों (चित्रा 3) के करीब है, अति सूक्ष्म तकनीक तेल-पृथक जीवीएस के साथ एक चुनौती हो सकती है।

अंत में, उनके आकार और गड़बड़ी की आसानी के कारण, जीवीएस परमाणु लिफाफे पर अध्ययन के लिए आदर्श सामग्री रहे हैं। परमाणु ताकना जटिल पहले उभयचर जीवी लिफाफे 11 और अधिक हाल ही में superresolution टिप्पणियों पर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन से वर्णित एक ही सामग्री का इस्तेमाल किया है किया गया था। 12,13

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Protocol

मेंढक और सैलामैंडर के बारे में सामान्य जानकारी, साथ ही पशुओं के सूत्रों का कहना है, निम्नलिखित वेबसाइटों पर पाया जा सकता है: Xenbase (http://www.xenbase.org) और साल-साइट (http://www.ambystoma.org)। इस प्रोटोकॉल विज्ञान के लिए कार्नेगी संस्थान की भ्रूणविज्ञान विभाग के जानवरों की देखभाल के दिशा-निर्देशों का पालन करती है।

1. समाधान

  1. सरगर्मी के साथ 1 एम 2 CaCl और 10 1 एम NaHCO 3 से 10 एल विआयनीकृत या dechlorinated एच 2 ओ एमएल के 10 एमएल जोड़ें: 10 एल 'मेंढक पानी "बनाओ।
  2. 1 एल 20% paraformaldehyde बनाओ: 4 मिमी ना 2 का 1 एल 3 सीओ बनाओ। एक रासायनिक हुड में लगभग 80 ओ सी के लिए पाउडर paraformaldehyde, और गर्मी के 200 ग्राम जोड़ने भंग करने के लिए। कूल, और फिल्टर पेपर के माध्यम से फिल्टर। सावधानी: paraformaldehyde विषैला होता है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक paraformaldehyde समाधान खरीद।
  3. 1 एल उभयचर संवेदनाहारी समाधान करें: एथिल 3-aminoben के 1.5 ग्राम जोड़ें1 एल मेंढक पानी के लिए zoate methanesulfonate। कमरे के तापमान पर रखो।
  4. बनाओ 1 एल oocyte संस्कृति के माध्यम or2 14: 82.5 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 1 मिमी CaCl 2, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी ना 2 HPO 4, 5 मिमी HEPES (500 मिमी स्टॉक, पीएच 8.3 से)। अंतिम पीएच 7.8 पीएच के बारे में होगा। 100 मिलीग्राम और 100 मिलीग्राम एम्पीसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन बैक्टीरिया विकास को रोकने के लिए जोड़ें।
  5. 1 एल जीवी अलगाव समाधान करें: 83 मिमी KCl, 17 मिमी NaCl, 6.5 मिमी ना 2 HPO 4, 3.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी)। पीएच 7.0 करने के लिए समायोजित करें।
  6. 100 एमएल जीवी प्रसार समाधान करें: 20.7 मिमी KCl, 4.3 मिमी NaCl, 1.6 मिमी ना 2 HPO 4, 0.9 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 0.1% paraformaldehyde। पीएच 7.0 करने के लिए समायोजित करें। परमाणु जेल के और अधिक तेजी से प्रसार की सुविधा के लिए, जोड़ने 10-50 माइक्रोन के 2 CaCl।
  7. 500 एमएल स्थानापन्नता समाधान करें। 2 में वाणिज्यिक जिलेटिन की पक्की 0.5 ग्राम10 मिनट - 0 एमएल एच 5 के लिए 2 हे। 500 मिलीलीटर उबलते एच 2 हे और ध्यान भंग करने के लिए जिलेटिन ज़ुल्फ़। कूल और ऐड 50 मिलीग्राम CRK (एसओ 4) 2 · 12 एच 2 ओ 4 ओ सी पर सक्शन और दुकान के साथ फ़िल्टर
  8. 10 बढ़ते मध्यम एमएल बनाओ। 5 एमएल पीबीएस में 10 मिलीग्राम PHENYLENEDIAMINE भंग (135 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 4.3 मिमी ना 2 HPO 4, 1.5 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 9 पीएच को समायोजित)। 5 एमएल ग्लिसरॉल जोड़ें। -80 ओ सी पर 250 μL aliquots में स्टोर

2. सामग्री

  1. subbed स्लाइड्स के लिए, जगह 3 इंच एक्स 1 इंच गिलास खुर्दबीन एक वाणिज्यिक डिटर्जेंट समाधान में स्लाइड और उन्हें रगड़ किसी भी दूषित पदार्थों को दूर करने के लिए। एक स्लाइड रैक में रखें और नल के पानी में अच्छी तरह कुल्ला, तो विआयनीकृत पानी में। स्थानापन्नता समाधान में स्लाइड्स डुबकी, एक कोण पर नाली, और 60 ओ सी में रात भर सेंकना
  2. प्लास्टिक वर्गों के लिए, 1 मिमी मोटी पाली (मिथाइल methacrylate) की एक चादर से 25 मिमी चौकों काटा। ड्रिल एकप्रत्येक वर्ग के केंद्र में 5 मिमी गोल छेद। रेत दोनों चेहरे और वर्ग के साथ-साथ छेद की परिधि के किनारों।
    नोट: घर का बना प्लास्टिक चौकों और अच्छी तरह से स्लाइड, अगले पैराग्राफ में वर्णित के रूप में करने के लिए एक विकल्प के रूप में, सीटू पीसीआर और संकरण कक्षों (25 μL) में वाणिज्यिक चिपकने का उपयोग करें। एक शायद इसके अलावा, सेल संस्कृति के लिए पुन: प्रयोज्य सिलिकॉन isolators का उपयोग हालांकि यह अच्छी तरह से अभी तक के रूप में परीक्षण नहीं किया गया हो सकता है।
  3. एक गर्म थाली पर एक 50 एमएल कांच बीकर में - (57 ओ सी 56) पैराफिन मोम की 30 ग्राम - अच्छी तरह से स्लाइड के लिए, 20 पिघला। एक 20 μL विंदुक के साथ, एक subbed स्लाइड के केंद्र के प्रत्येक पक्ष पर आयल के एक 5 μL बूंद फैल गया। पैराफिन में एक प्लास्टिक वर्ग प्रेस और गर्म थाली पर स्लाइड जगह। आयल पिघल जाएगा और प्लास्टिक वर्ग के तहत समान रूप से फैला चाहिए।
    1. गर्म थाली से स्लाइड निकालें और इसे ठंडा होने दें। स्लाइड के प्रत्येक के अंत के तहत एक समर्थन की जगह है, तो स्लाइड tabl संपर्क नहीं है किठंडा करने की प्रक्रिया के दौरान ETOP। पैराफिन भी तेजी से ठंडा है, यह केंद्रीय छेद से दूर खींच सकता है। 10 या अधिक अच्छी तरह से स्लाइड तैयार: प्रत्येक जीवी तैयारी एक नया अच्छी तरह से स्लाइड उपयोग करता है।
  4. centrifugation के लिए स्लाइड वाहकों के लिए, विशेष रूप से इस्तेमाल किया रोटर के लिए वाहक का निर्माण का उपयोग करें। अच्छी तरह से प्लास्टिक की प्लेटें - कई निर्माताओं के लिए 96 वाहकों के साथ सेंट्रीफ्यूज प्रदान करते हैं। इन मार्गों को खुर्दबीन स्लाइड धारण करने के लिए काफी आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

3. Oocytes का अलगाव

  1. एक वयस्क मादा मेंढक (Xenopus laevis या Xenopus tropicalis) या समन्दर (Ambystoma mexicanum) पर्याप्त संवेदनाहारी समाधान में पूरी तरह से कवर करने के लिए पशु रखें। पशु आंदोलन खत्म होता है, यह एक उपयुक्त कंटेनर में chipped बर्फ की एक बिस्तर पर पेट के ऊपर रख दें।
  2. शल्य कैंची एक 2 बनाने के साथ - पेट के निचले हिस्से में 3 सेमी चीरा midline के लिए पार्श्व। चीरा के पक्ष में अंडाशय लगाने के लिए धीरे एक तरफ आंतरिक अंगों को ले जाएँ (धअरे दो अंडाशय, पेट के प्रत्येक पक्ष पर एक) कर रहे हैं। योजना बनाई प्रयोगों के लिए पर्याप्त oocytes के साथ अंडाशय के एक हिस्से को काट दिया। के बाद से वहाँ oocytes के हजारों हर अंडाशय में हैं, अंडाशय की एक अपेक्षाकृत छोटा सा टुकड़ा (1 - 3 सेमी) आमतौर पर पर्याप्त होगा।
  3. एक या कुछ कमरे के तापमान पर एक बड़े पेट्री डिश (100 मिमी) में or2 खारा में अंडाशय के टुकड़े रखें। Oocytes, कई दिनों के लिए अच्छी हालत में संग्रहित किया जा सकता है, तो क्षतिग्रस्त oocytes हटा रहे हैं और or2 समाधान दैनिक बदल गया है।
  4. शल्य रेशम के साथ चीरा सिवनी और वसूली के लिए एक व्यक्ति कांच का कटोरा के लिए पशु वापसी। अभी पर्याप्त "मेंढक पानी" जानवर कवर करने के लिए जोड़ने जब तक यह चेतना (लगभग 15 मिनट) आएगा। पशु के बाद स्वैच्छिक आंदोलनों से पता चलता है, पानी के साथ कटोरा भरें। हालांकि ताजा पानी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, बाँझपन आवश्यक नहीं है, के रूप में उभयचर सर्जरी के बाद संक्रमित लगभग कभी नहीं बन रहा है। अगर वांछित, neomycin टांके के लिए लागू किया जा सकता है। घाव आमतौर पर एक फ़े के बाद पूरी तरह से भर देता हैडब्ल्यू दिन और एक ही जानवर के बारे में 2 महीने के बाद फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. एक कीटाणु पुटिका (जीवी) के अलगाव

  1. एक छोटे से पेट्री डिश (35 x 10 मिमी) or2 समाधान युक्त - (20 बड़े oocytes 10) अंडाशय के एक हिस्से को रखें।
  2. अंडाशय # 5 जौहरी संदंश के दो जोड़े का उपयोग ऊतक की पतली डंठल अंडाशय की दीवार को oocyte जोड़ता है कि करने के लिए आंसू से एक oocyte निकालें। जीवी अलगाव मध्यम युक्त एक और छोटा सा पेट्री डिश में oocyte रखें।
    नोट: LBCs के राज्य oocyte के आकार (परिपक्वता) पर निर्भर करता है। LBCs oocytes कि पूर्ण आकार की तुलना में थोड़ा कम कर रहे हैं में प्रमुख छोरों के साथ अधिक से अधिक लंबाई तक पहुँचने। सबसे परिपक्व oocytes अक्सर अनुबंधित छोरों के साथ कम क्रोमोसोम होते हैं।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप (- 20 मिमी व्यास क्षेत्र लगभग 10) की कम बढ़ाई के तहत निम्न चरणों का प्रदर्शन।
    1. पशु ध्रुव (अंधेरे गोलार्द्ध) के पास संदंश के दोनों जोड़े के साथ oocyte समझ और एक एस.एम. बनानासभी आंसू। पारदर्शी oocyte नाभिक के लिए extruded की जर्दी में देखो, यह भी कीटाणु पुटिका या जीवी बुलाया।
    2. वैकल्पिक रूप से, संदंश की एक जोड़ी के साथ पशु ध्रुव के पास एक बड़ा छेद प्रहार और धीरे जर्दी (चित्रा 2) के साथ-साथ जीवी बाहर निचोड़।
    3. धीरे जीवी की जर्दी के थोक से दूर रोल। आमतौर पर कसकर जीवी के अनुयायी जर्दी की एक छोटी राशि नहीं होगा।

5. परमाणु लिफाफा का हटाया

  1. एक्स laevis और एक्स tropicalis के लिए, अलगाव के 60 एस के भीतर फैल रहा मध्यम करने के लिए मध्यम अलगाव से जीवी हस्तांतरण, वहाँ अभी भी एक छोटे पक्षपाती जर्दी है, भले ही।
    नोट: जीवीएस इन दो प्रजातियों के बारे में 60 एस के भीतर "कड़ा" यदि अलगाव माध्यम में छोड़ दिया और बाद के चरणों में फैल नहीं होगा। इसलिए गति जब Xenopus जीवी सामग्री का परीक्षण अत्यंत महत्व का है।
    1. एक जोड़ी के साथ जीवी के शीर्ष के पास परमाणु लिफाफा काबूजौहरी संदंश की, देखभाल करने के लिए नीचे प्रेस करने के लिए नहीं। के रूप में संभव के रूप में पहली करने के लिए करीब संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ लिफाफा समझ। संदंश के दो जोड़े एक दूसरे को और जीवी सामग्री "पॉप" होगा लिफाफा, जो एक या दोनों संदंश को कसकर पालन करता है से बाहर मुक्त से दूर खींच।
    2. एक गिलास पिपेट में जी.वी. सामग्री या एक समायोज्य 20 μL micropipette उठाओ। एक समायोज्य पिपेट का उपयोग करते हैं, तो 10 μL विंदुक सेट और एक रेजर ब्लेड के साथ प्लास्टिक की टिप के अंत काट दिया। शेष 5 μL में जी.वी. उठा से पहले तरल के 5 μL में ड्रा।
    3. एक अच्छी तरह से स्लाइड पहले समाधान के प्रसार के साथ भरा के केंद्र के लिए अभी भी gelled परमाणु सामग्री हस्तांतरण। इतना है कि एक बुलबुला जब coverslip जोड़ा जाता फंस नहीं है प्रसार के समाधान के लिए एक उत्तल सतह होना चाहिए।
    4. एक coverslip (18 मिमी) जोड़ें और एक नम कक्ष में स्लाइड जगह। परमाणु जेल धीरे-धीरे अगले 10 से अधिक फैलाने जाएगा - 60 मिनट, इतना है कि गुणसूत्रs और परमाणु अंगों गिलास स्लाइड की सतह पर झूठ बोलने के लिए आते हैं।
      नोट: सैलामैंडर ए mexicanum की जीवीएस और एन viridescens "कठोर" नहीं है अलगाव माध्यम में अनावश्यक रूप से। इसलिए एक Xenopus के साथ एक कर सकते हैं की तुलना में परमाणु लिफाफा को हटाने के साथ और अधिक आराम से आगे बढ़ सकते हैं।
  2. खंड 5.1.1 में वर्णित के रूप में एक समन्दर जीवी से परमाणु लिफाफा निकालें, लेकिन अलगाव माध्यम में ऐसा करते हैं।
    1. एक विंदुक के साथ थोड़ा gelled जीवी सामग्री उठाओ और प्रसार के समाधान युक्त एक पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
    2. जल्दी, प्रसार के समाधान में पिपेट टिप बाहर कुल्ला परमाणु जेल उठा, और एक अच्छी तरह से स्लाइड पहले समाधान के प्रसार के साथ भरा के केंद्र में जगह है। एक 18 मिमी coverslip जोड़ें और एक नम कक्ष में पूरे स्लाइड जगह है। परमाणु एसएपी धीरे-धीरे अगले 10 से अधिक फैलाने जाएगा - 60 मिनट और क्रोमोसोम और परमाणु अंगों कांच की सतह पर झूठ बोलने के लिए आ जाएगा।
      3. </ राजभाषा>

    6. LBCs और अंगों की प्रारंभिक अवलोकन

    1. प्रसार के चैम्बर में परमाणु सामग्री के प्रसार के बाद LBCs और कम बढ़ाई चरण विपरीत (पारंपरिक ईमानदार माइक्रोस्कोप) द्वारा परमाणु अंगों देखें। (- 10X 5X) क्योंकि चैम्बर लगभग 1 मिमी गहरी है और परमाणु सामग्री के नीचे हैं, एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एक कम बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करें।
      नोट: इस समय में तैयारी की जांच के लिए प्रमुख कारण निर्धारित करने के लिए कि क्या यह अगले कदम के माध्यम से ले जाने के लायक है। एक अच्छी तैयारी में गुणसूत्रों अटूट हैं और चैम्बर के नीचे करने के लिए तय हो चुका है। , तैयारी कर रही है के एक घंटे के भीतर centrifugation कदम आगे बढ़ना के रूप में इस स्लाइड के लिए lampbrush गुणसूत्र छोरों का इष्टतम लगाव सुनिश्चित करेगा।

    7. परमाणु सामग्री की centrifugation

    1. coverslip पर फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा रखें और नीचे प्रेसकक्ष से अतिरिक्त तरल हटा दें।
    2. Coverslip के प्रत्येक पक्ष पर पेट्रोलियम जेली के बारे में 1 मिमी 3 रखो। एक धातु की छड़ के बारे में 70 पर गरम साथ पेट्रोलियम जेली पिघला - 80 ओ सी अंतर्निहित प्लास्टिक वर्ग पर coverslip सील करने के लिए।
    3. centrifugation के लिए स्लाइड वाहक में जगह स्लाइड, यकीन है कि विपरीत वाहक संतुलित कर रहे हैं। 1 एच - 30 मिनट के लिए 4,800 के बारे में XG पर स्लाइड अपकेंद्रित्र। 4 ओ सी का प्रयोग करें सेंट्रीफ्यूज पर धीमी गति से शुरू सुविधा पर।

    8. परमाणु सामग्री फिक्सिंग

    1. सबसे बाद में प्रक्रियाओं के लिए, paraformaldehyde के साथ परमाणु सामग्री को ठीक।
    2. एक मानक खुर्दबीन स्लाइड धुंधला डिश में एक स्लाइड रैक रखो और फिर रैक में व्यक्तिगत रूप से स्लाइड जगह है। (- Or2 या पीबीएस में 4% paraformaldehyde 2) स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त लगानेवाला जोड़ें।
    3. कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ, coverslip laterally धक्का, इसे लेने के लिए, और उचित कांच कचरे में त्यागें।30 मिनट - कम से कम 15 के लिए लगानेवाला में स्लाइड्स छोड़ दें। के लिए सीटू संकरण और सबसे एंटीबॉडी दाग में, निर्धारण की लंबी अवधि (ज या डी) अनुमेय हैं।
    4. प्लास्टिक वर्ग को निकालने के लिए जगह बर्फ में एक समय ठंड or2 या पीबीएस एक धुंधला डिश में से एक स्लाइड। प्लास्टिक वर्ग के किनारे पर एक तेज धार डालें और यह ढीला जिज्ञासा।
      नोट: आदर्श रूप में प्लास्टिक की सफाई से बाहर आ जाएगा, स्लाइड पर सभी पैराफिन मोम जा रही है। मोम एक उपयोगी उद्देश्य से कार्य करता: चूंकि यह छोटे केंद्रीय क्षेत्र है जहां परमाणु सामग्री स्लाइड से जुड़े होते हैं चारों ओर से घेरे है, यह एक बांध एक छोटे संस्करणों के साथ काम करने की अनुमति देता है कि के रूप में कार्य करता है - immunostaining, आदि के लिए अभिकर्मकों के (5 से 10 μL)। स्लाइड ठंड or2 या पीबीएस में अनिश्चित काल के लिए आयोजित किया जा सकता है।

    9. LBCs और परमाणु अंगों की Immunostaining

    1. Or2 या पीबीएस में भंडारण से एक निश्चित जीवी तैयारी निकालें। एक नम कक्ष में अतिरिक्त तरल और समर्थन करता है पर जगह से साफ कर लें। एक सुविधाजनक chambएर एक 90 x 15 मिमी पेट्री नम फिल्टर पेपर के एक 90 मिमी चक्र युक्त पकवान है।
      नोट: इस बिंदु पर परमाणु सामग्री को मजबूती से एक 5 मिमी परिपत्र क्षेत्र पैराफिन मोम का मुफ्त में स्लाइड से जुड़े होते हैं। क्योंकि मोम पानी से बचाने वाली क्रीम है, एक जोड़ने और एक 20 μL पिपेट साथ केंद्रीय क्षेत्र के किनारे करने के लिए तरल की छोटी मात्रा को हटाने के द्वारा समाधान बदल सकते हैं। प्रमुख एहतियात विंदुक टिप के साथ मोम-मुक्त क्षेत्र को छू से बचने के लिए है।
    2. अभिकर्मकों की - (20 μL 10) छोटे संस्करणों के साथ immunostaining बाहर ले। क्योंकि गुणसूत्रों और परमाणु अंगों बहुत छोटी है और कहा अभिकर्मकों के साथ तत्काल संपर्क में हैं, धुंधला प्रोटोकॉल कम हो सकता है। प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला बार 1 घंटा या उससे कम के रूप में के रूप में कम हो सकता है। , किसी भी कदम में डिटर्जेंट शामिल रूप में इस तैयारी के लिए नुकसान का कारण बनता है मत करो। LBCs की कुल्हाड़ियों दबाव का चिह्न के लिए 20 मिनट - अगर वांछित, 10 के लिए DAPI के साथ तैयारी (1 माइक्रोग्राम / एमएल) दाग।
    3. ग्लिसरॉल में माउंट या एक वाणिज्यिक माउंटimmunofluorescence के लिए मध्यम उपयुक्त हैैं। बढ़ते चरण के दौरान एक हवाई बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए इस प्रकार के रूप में आगे बढ़ें।
      1. एक 20 μL पिपेट की नोक में बढ़ते मध्यम के 15 μL खींचो। द्वारा यह (# 1 फिल्टर पेपर के एक 90 मिमी चक्र से एक बहुत पतली त्रिकोण के आकार में कटौती) फिल्टर कागज के एक टुकड़े के साथ "बाती" बंद परमाणु प्रसार के चारों ओर तुरंत क्षेत्र से जितना संभव हो उतना तरल निकालें।
      2. तैयारी पर बढ़ते मध्यम के सबसे पिपेट, परमाणु प्रसार के क्षेत्र को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा। पिछले 1 μL जगह या एक 22 मिमी coverslip (मोटाई # 1.5) के केंद्र में बढ़ते मध्यम के इतने। तैयारी से अधिक coverslip पलटना और जगह में ध्यान से ड्रॉप।
      3. अस्थायी mounts के लिए, कुछ दिनों के लिए, का उपयोग 50% ग्लिसरॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल PHENYLENEDIAMINE। स्थायी mounts के लिए, विशेष रूप से superresolution के अध्ययन के लिए, एक कम प्रतिदीप्ति माध्यम है कि 1.46 के बारे में एक अपवर्तनांक को मज़बूत बनाता का उपयोग करें।

    10 फ्लोरोसेंट LBCs की स्वस्थानी संकरण (मछली) और परमाणु organelles में

    1. क्योंकि मछली प्रोटोकॉल आमतौर पर ऊंचा तापमान पर एक कदम की आवश्यकता होती है, तैयारी से पैराफिन मोम को हटा दें। ध्यान से, एक धार के साथ परिमार्जन हालांकि प्रक्रिया कठिन है और तैयारी के आकस्मिक नुकसान हो सकता है। यह एक हीरे बिंदु के साथ स्लाइड की पीठ पर तैयारी के क्षेत्र चिह्नित करने के लिए उपयोगी है।
      1. वैकल्पिक रूप से, xylene साथ पैराफिन मोम भंग। Coplin जार या धुंधला युक्त व्यंजनों की एक श्रृंखला सेट अप: 30%, 50%, 70%, 95%, और 100% इथेनॉल; xylene के 3 कंटेनरों; 100% इथेनॉल और एक एसीटोन के 2 अधिक कंटेनर।
      2. स्लाइड वाहक में स्लाइड्स प्लेस और उन्हें इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलीकरण, 3 स्लाइड छोड़ने - प्रत्येक एकाग्रता में 5 मिनट (छोटा बार अगर उत्तेजित)।
      3. xylene के 3 कंटेनरों के माध्यम से स्लाइड से गुजर रहा पैराफिन मोम भंग के बारे में 5 मिनट प्रत्येक उत्तेजित हैं। हटाएदो 100% ethanols माध्यम से गुजर द्वारा xylene, और अंत में एसीटोन के साथ इथेनॉल को हटा दें। एसीटोन से स्लाइड ले लो और सुखाने के लिए उन्हें झुकाव।
    2. किसी भी मानक प्रोटोकॉल का उपयोग सीटू संकरण में बाहर ले। 15,16

    11. तेल के तहत एक जीवी का अलगाव

    1. जौहरी संदंश के साथ or2 समाधान से एक oocyte उठाओ, जितना संभव हो कम आसपास के ऊतक भी शामिल है। # 1 फिल्टर पेपर के एक छोटे से टुकड़े पर oocyte रखें। अतिरिक्त or2 समाधान फिल्टर पेपर के लिए स्थानांतरण होगा, तरल के लगभग मुफ्त oocyte जा रही है। "सूखी" oocyte उठाओ और एक छोटे से पेट्री डिश (35 x 10 मिमी) में हल्के वजन खनिज तेल (आयल के तेल) की सतह के नीचे जगह है।
      1. ठीक एक टंगस्टन सुई या संदंश की एक शाखा के साथ, अंधेरे पशु ध्रुव के पास oocyte में एक छोटा सा छेद प्रहार। संदंश (टिप्स परहेज) की एक जोड़ी के साथ oocyte उठाओ और धीरे से दबाओ। जीवी एक छोटे या एल के साथ बाहर निकालना होगाइसकी सतह पर जर्दी के arger राशि (चित्रा 3)।
      2. धीरे संदंश के पक्ष के साथ जीवी व्यापक द्वारा जितना संभव हो उतना जर्दी निकालें। ज्यादातर मामलों में यह जर्दी के सभी दूर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा। हालांकि, ज्यादातर प्रयोजनों के लिए जर्दी की एक छोटी राशि के लिए एक समस्या नहीं है।
    2. जीवी सामग्री का निरीक्षण करने के लिए, एक अधिक से अधिक या कम हद तक जीवी समतल।
      1. एक अच्छी तरह से स्लाइड से प्लास्टिक वर्ग निकालें और आयल के तेल के लिए एक उथले गोदाम के रूप में शेष पैराफिन मोम का उपयोग करें। 10 को एक 20 μL पिपेट में आयल के तेल के साथ-साथ जीवी उठाओ और आयल क्षेत्र के केंद्र के लिए स्थानांतरण। एक coverslip जोड़ें और आंशिक रूप से चपटा जीवी की सामग्री को निरीक्षण करते हैं। इस तकनीक LBCs नुकसान नहीं करता है।
    3. वैकल्पिक रूप से, परमाणु अंगों के अवलोकन के लिए लगभग 10 माइक्रोन मोटाई के लिए जीवी समतल।
      1. एक तेज धार के साथ एक प्लास्टिक विंदुक टिप के अंतिम 1 मिमी काट दिया। में जी.वी. चूसोखनिज तेल के ठीक 5 μL के साथ टिप। एक 22 मिमी गिलास coverslip के केंद्र पर जीवी और सभी तेल बाहर निकालना।
      2. एक मानक 3 "x 1" गिलास स्लाइड धीरे धीरे कम जब तक यह सिर्फ तेल बूंद छू लेती है। बूंद और coverslip केशिकत्व से हटा लिया जाएगा और तेल coverslip के किनारों में फैल जाएगा। जब ड्रॉप पूरी तरह से फैल गया है, तेल लगभग 10 माइक्रोन मोटी हो जाएगा। LBCs क्षतिग्रस्त हो जाएगा और बड़े nucleoli थोड़ा संकुचित हो जाएगा, लेकिन छोटे परमाणु अंगों के सबसे अधिक या कम दिखाई देगा के रूप में वे बरकरार जीवी में मौजूद हैं (चित्रा 3)।

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Representative Results

विशाल lampbrush गुणसूत्रों की जांच करने के लिए एक एक मेंढक या समन्दर से oocytes अलग से शुरू होता है। चित्रा 1 मेंढक, Xenopus के अंडाशय से हटाने के बाद एक बफर नमकीन घोल में परिपक्व oocytes के एक समूह से पता चलता है। इस तरह के oocytes कमरे के तापमान पर दिनों के लिए अच्छी हालत में रहते हैं। नाभिक (या कीटाणु पुटिका) तो (चित्रा 3) या तो एक नमकीन घोल (चित्रा 2) में या तेल में जौहरी संदंश के साथ एक oocyte से निकाल दिया जाता है। एक तेल-पृथक नाभिक की परमाणु सामग्री को धीरे नाभिक squashing और चरण विपरीत या अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी द्वारा देख कर जांच की जा सकती है। एक नाभिक है कि एक नमकीन घोल में अलग-थलग कर दिया गया है की सामग्री की जांच करने के लिए, एक पहले जौहरी संदंश के साथ परमाणु लिफाफा हटाने और सामग्री को एक खुर्दबीन स्लाइड पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति मिलनी चाहिए। तैयारी तो टी संलग्न करने के लिए centrifuged हैवह स्लाइड, जिसके बाद गुणसूत्रों एक एंटीबॉडी (चित्रा 4) के साथ दाग जा सकता है या स्वस्थानी संकरण में के अधीन करने के लिए मजबूती से गुणसूत्रों। सैलामैंडर के lampbrush गुणसूत्रों मेंढ़कों (चित्रा 5) के उन लोगों की तुलना में काफी बड़े होते हैं। दोनों ही मामलों में अलग-अलग इकाइयों प्रतिलेखन (जीन) गुणसूत्र धुरी से laterally पेश क्रोमेटिन के छोरों के रूप में देखा जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: मेंढक एक्स tropicalis से परिपक्व oocytes। एक परिपक्व महिला मेंढक के अंडाशय परिपक्वता के विभिन्न चरणों में oocytes के हजारों शामिल हैं। छोटी से छोटी दैहिक कोशिकाओं के आकार के होते हैं और पहले से ही पहले अर्धसूत्रीविभाजन के प्रोफेज़ पहुँच चुके हैं। oocyte बढ़ता है, यह धीरे-धीरे जर्दी जम जाता है, जो सेल एक अपारदर्शी सफेद उपस्थिति देता है। सबसे बड़ा चटाईUre oocytes, यहाँ दिखाया गया है, मेलेनिन वर्णक के संचय के कारण एक गहरे रंग की टोपी के अधिग्रहण। एक्स tropicalis का सबसे बड़ा oocytes, व्यास में 0.8 मिमी के बारे में हैं एक्स के उन लोगों के बारे में 1.4 मिमी laevis, जबकि Axolotl के उन लोगों के लिए एक विशाल 2.2 मिमी हैं। आकार के लिए छोड़कर, सभी तीन सामान्य दिखने में समान हैं। स्केल बार = 1 मिमी।

चित्र 2
चित्रा 2: एक्स tropicalis की एक oocyte से जीवी का हटाया। बाएं। एक छोटा सा छेद एक oocyte के काले जानवर पोल में जौहरी संदंश के साथ बनाया गया था और जीवी धीरे निकाला गया था। इस उदाहरण में जी.वी. के रूप में यह oocyte से बाहर आया जर्दी के लगभग मुक्त किया गया था। पक्षपाती जर्दी एक टिप व्यास सिर्फ जीवी खुद के व्यास से थोड़ा बड़ा है साथ में और एक पिपेट से बाहर जीवी चूसने से हटाया जा सकता है। सही। टीhree एक्स tropicalis की जीवीएस। ये जीवीएस एक थोड़ा अम्ल मध्यम (जीवी अलगाव समाधान पीएच 5.8 करने के लिए समायोजित) है, जो परमाणु लिफाफा gelled परमाणु सामग्री से दूर प्रफुल्लित करने का कारण बनता में कुछ मिनट के लिए छोड़ दिया गया। इस तरह से इलाज जीवीएस कोशिकाविज्ञान परीक्षा के लिए प्रसार नहीं होगा। हालांकि, इस तरह जीवीएस आणविक विश्लेषण के लिए आदर्श होते हैं: लिफाफा परमाणु सामग्री cytoplasmic संदूषण से पूरी तरह मुक्त करने का एक नमूना उपलब्ध कराने, जौहरी संदंश के साथ हटाया जा सकता है। 17,18 स्केल बार = 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक्स tropicalis तेल में पृथक की जीवी। बाएं। के बाद एक छोटे पंचर अंधेरे जानवर पुलिस के पास oocyte में बनाया गया थाle, जीवी बाहर निकालना शुरू कर दिया। इस मामले में जीवी लगभग कोई पक्षपाती की जर्दी के साथ बाहर आया था। मध्य। जीवी अब oocyte कोशिका द्रव्य से पूरी तरह से मुक्त है। इस तरह के जीवीएस घंटे के लिए आरएनए टाइप करने के लिए जारी है। सही। बाद जीवी धीरे एक coverslip के तहत तेल में कुचल है, परमाणु अंगों डीआईसी द्वारा, जैसा कि यहाँ दिखाया चरण विपरीत द्वारा देखी जा सकती है, या। पूरे जीवी यहाँ दिखाया छोटे से क्षेत्र से भी बड़ा है। HLB इसकी सतह पर तीन speckles के साथ = हिस्टोन ठिकाना शरीर। स्केल बार पहले दो पैनलों के लिए = 0.5 मिमी, तीसरे के लिए 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: Lampbrush गुणसूत्रों (LBCs) Axolotl ए mexicanum से। बाएं। सही। एक ही तैयारी darkfield रोशनी द्वारा देखी। एक अब कई बेदाग परिलक्षित nucleoli देख सकते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: Axolotl ए mexicanum और मेंढक एक्स tropicalis से एक भी एलबीसी, एक ही बढ़ाई। इन छवियों को एक समन्दर की LBCs और एक मेंढक (इनसेट) के बीच चरम आकार अंतर को दर्शाते हैं। आकार एडवेंचर्ससीई कुल डीएनए जीनोम की (लगभग 30 पाउंड ए mexicanum के लिए बनाम 1.7 जीबीपी एक्स tropicalis के लिए) सामग्री के साथ संबद्ध। व्यक्तिगत पार्श्व छोरों (ट्रांसक्रिप्शन इकाइयों) मेंढक की तुलना में बहुत लंबे समय तक समन्दर में भी कर रहे हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मेंढक और सैलामैंडर के हाथ-पृथक जीवीएस से "जी" LBCs की टिप्पणियों के पहले अमेरिकी जीवविज्ञानी विलियम Duryee, 19 चरण विपरीत और डीआईसी माइक्रोस्कोपी की शुरूआत से पहले से लगभग 80 साल पहले किए गए थे, फ्लोरोसेंट immunostaining से पहले, और मछली से पहले। गिलास स्लाइड के लिए LBCs संलग्न करने के लिए तकनीक का व्यक्तिगत जीन स्तर की आवश्यकता के विकास पर गुणसूत्र संरचना और प्रतिलेखन के विवरण की जांच कर रही है, एक सजीव ढंग से उन्हें ठीक करने के लिए, और उनके मूल आकृति विज्ञान नष्ट करने के बिना आणविक तकनीक लागू करने के लिए LBCs के फायदे। इन लक्ष्यों को पूरा करने के लिए लगभग हर तकनीक जांच के तहत प्रजातियों और सजीव संरक्षण और आणविक लक्षण वर्णन के बीच कुछ समझौता करने के लिए कुछ अनुकूलन की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, जीवीएस और पूंछ उभयचरों की LBCs उनके विशाल आकार और कितनी आसानी से जीवी सामग्री उचित माध्यम में फैलाने की वजह से साथ काम करने के लिए असामान्य रूप से आसान कर रहे हैं। यूntil हाल ही में, तथापि, बहुत कम उनकी जीनोमिक्स के बारे में जाना जाता था, यह मुश्किल आणविक विवरण के साथ कोशिकाविज्ञान सुविधाओं का धन सहसंबंधी कर रही है। इसके विपरीत, Xenopus की LBCs पूंछ उभयचर (चित्रा 5) के उन लोगों की तुलना में काफी छोटे हैं, लेकिन दोनों एक्स tropicalis और एक्स laevis के जीनोम अनुक्रम किया गया है और काफी अच्छी तरह से एनोटेट कर रहे हैं।

उन उभयचर जीवीएस पहला प्रयोग करने के लिए, प्रमुख चुनौती जीवी अलग और LBCs को नुकसान पहुँचाए बिना परमाणु लिफाफा को दूर करने के लिए किया जाएगा। तिथि करने के लिए, कोई भी जौहरी संदंश के साथ हाथ से लिफाफा छोड़कर दूर करने के लिए एक रास्ता खोज की है। यह एक प्रमुख तकनीकी अग्रिम हो सकता है अगर एक तरह से "भंग" या "पचा" लिफाफा लेकिन undamaged क्रोमोसोम और अन्य परमाणु अंगों छोड़ पाया गया होगा। इस तरह की एक तकनीक आणविक अध्ययन के लिए समान रूप से उपयोगी होगा। परमाणु और cytoplasmic आरएनए पर हमारी जांच में हम यह करने के लिए आवश्यक पायापरमाणु शाही सेना (चित्रा 2) के विश्लेषण से पहले परमाणु लिफाफा निकाल दें। 17,18 लिफाफा नहीं हटाया जाता है, तो परमाणु शाही सेना की छोटी राशि cytoplasmic आरएनए कि लिफाफे के बाहरी का पालन करता है contaminating से अभिभूत है।

एक अन्य प्रमुख सुधार किसी तरह एक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए और अधिक मजबूती LBCs संलग्न करने के लिए की खोज के लिए किया जाएगा। तैयारी की centrifugation के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन फिर भी लंबे समय तक centrifugation (1 ज 4500 XG) लगाव सुनिश्चित नहीं करता है। एक आम तौर पर जब LBCs उन्हें अच्छी तरह से मध्यम बढ़ाई तहत चरण विपरीत साथ परीक्षण करके जुड़े होते हैं बता सकते हैं। खैर संलग्न गुणसूत्रों सब पर कोई ब्राउनियन गति दिखा। छोरों के किसी भी ब्राउनियन गति का पता लगता है, तो बाद में immunostaining या मछली प्रोटोकॉल व्यापक क्षति या सामग्री के नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) Sigma-Aldrich P6148-500G Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich A5040-100G Sometimes referred to as MS-222
Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures VWR  95057-000
Paraplast (paraffin wax) Sigma-Aldrich P3558-1KG
p-Phenylenediamine Sigma-Aldrich P6001
Gelatin Grocery Store Commercial Knox gelatin works fine
ProLong Gold antifade mountant ThermoFisher Scientific P10144
Gold Seal cover glass  22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) Electron Microscopy Sciences 63786-01 These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy
Dumont forceps #5 Electron Microscopy Sciences 72700-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx
Paraffin oil (light)  EMD Chemicals PX0047-1 For isolating GVs in oil
Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) BioRad Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers
Silicone isolators Grace-Biolabs select from catalog link http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html
Coplin jars and staining dishes Electron Microscopy Sciences select from catalog link http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx

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References

  1. Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
  2. Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
  3. Callan, H. G. Lampbrush Chromosomes. 36, Springer-Verlag. (1986).
  4. Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Kay, B. K., Peng, H. B. Vol. 36 Methods in Cell Biology , Academic Press. 149-166 (1991).
  5. Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
  6. Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
  7. Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
  8. Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
  9. Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
  10. Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
  11. Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
  12. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
  13. Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
  14. Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
  15. Bridger, J. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111.111-111.136 (1998).
  16. Singer, R. H. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. 3, Cold Spring Harbor Press. 111-116 (1998).
  17. Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C. Jr, Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
  18. Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
  19. Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).

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आनुवंशिकी अंक 118 कीटाणु पुटिका (जीवी) हिस्टोन ठिकाना शरीर lampbrush गुणसूत्र परमाणु लिफाफा परमाणु बिंदु न्यूक्लियस oocyte प्रतिलेखन
मेंढक और सैलामैंडर के लिविंग Oocytes से विशाल Lampbrush गुणसूत्रों का अलगाव
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Gall, J. G., Nizami, Z. F. Isolation … More

Gall, J. G., Nizami, Z. F. Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders. J. Vis. Exp. (118), e54103, doi:10.3791/54103 (2016).

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