Summary
私たちは、カエルやサンショウウオの卵母細胞を生きているから巨大な転写活性ランプブラシ染色体を単離するための簡単なテクニックを紹介します。私たちは、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト、およびどのようにin situハイブリダイゼーションまたは免疫蛍光染色における蛍光のためにそれらを修正することにより、「生きている」これらの染色体を観察する方法について説明します。
Abstract
私たちは、カエルやサンショウウオの卵母細胞、または埋葬されていない卵、で見つかった巨大な転写活性ランプブラシ染色体（のLBCs）を研究するための方法が記載されています。最大直径0.5mmに、自身の個々のLBCsの長さは、最大1ミリメートルとすることができ、彼らは巨大な核内に存在します。染色体のサイズが大きい光光学顕微鏡による活性遺伝子の比類のない観測を可能にするが、同時に、特別な技術は、核の単離核エンベロープを除去し、顕微鏡スライド上に染色体を拡散するために必要とされます。また、卵核胞（GV）と呼ばれる卵母細胞の核は、核アクチンの部分的なゲル化を可能にし、のLBCsの繊細な構造を保存媒体に隔離されています。このステップは、宝石商の鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で手動で行われます。次に、核膜は、宝石商の鉗子で再び手動で削除されます。核内容はすぐにdispe媒体に転写されていますアクチンゲルRSESと損傷していないのLBCsは、顕微鏡スライド上に決済することができます。細かい詳細はブラウン運動によって隠されているが、この時点でのLBCs及び他の核小器官は、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト顕微鏡で観察することができます。高解像度の顕微鏡観察や分子分析のために、製剤全体がスライドにしっかりと繊細なのLBCsを添付するために遠心分離されます。パラホルムアルデヒド中で簡単に固定が、その後免疫蛍光染色によって、またはin situハイブリダイゼーションに続いています。 LBCsは、転写活性状態にあり、それらの巨大なサイズは、共焦点又は超解像顕微鏡を使用して、個々の遺伝子レベルでの分子の分析を可能にします。
Introduction
ほとんどの脊椎動物は、有袋類および胎盤哺乳類の注目すべき例外を除いて、大規模な卵黄のような卵を産みます。その時々巨大なサイズにもかかわらず、これらの卵はまだ女性の卵巣ながら、最終寸法に達する単一細胞です。卵巣卵は卵母細胞と呼ばれ、それぞれは、典型的には、単に胚胞またはGV早ければ19 世紀から知られている単一の巨大な核を、含まれています。一般的な実験のカエル、 アフリカツメガエルやアフリカツメガエルトロピカの1卵母細胞は、それぞれ1.2ミリメートルと0.8ミリメートルの最大直径（ 図1）に達します。直径0.4ミリメートル（ 図2、図3） -これら2カエルの成熟卵母細胞からのGVは0.3です。サンショウウオは、典型的には、さらに大きく卵母細胞とのGVを持っています。メキシコアホロートル、Ambystomaのmexicanumの完全に成熟卵母細胞は、直径2 mm以上であり、GVは約0.5mmです。したがって、これらの核は、肉眼や缶に容易に表示されます典型的な体細胞の核では不可能であり、多くの方法で操作すること。
同様に顕著GV内の染色体の巨大なサイズ、19 世紀の終わりに既に認識された事実です。 Ambystomaおよび他のサンショウウオの個々の染色体の長さは最大1ミリメートル（ 図4、図5）とすることができます。 100μm以上までの長さで、彼らはほとんどの生物の典型的な体細胞の染色体を矮星が、 アフリカツメガエルのものは、小さいかなりあります。対の横方向のループの数百（ 図5） -卵母細胞染色体の重要な特徴は、それらの最も特徴的な形態学的特徴の一つにつながり、それらの異常な転写活性です。各ループは積極的にRNAを合成する1つまたは少数の転写単位から構成されています。ループは、卵母細胞は、その表面的な後に名前 "ランプブラシ"染色体につながったファジーな外観を、染色体与えます灯油ランプの煙突をきれいにするために、以前の回で使用したブラシに似ています。 2
この論文の焦点はのLBCs及び核細胞小器官（核小体、ヒストン遺伝子座体、およびスペックルを）勉強する孤立のGVの使用にあります。二つかなり異なる技術について説明します。まず、より一般的な技術では、のGVを簡単接着卵黄を除去するためにリンス、宝石商の鉗子を使用して、食塩水で単離される、および核膜を宝石商の鉗子で再び除去されます。 LBCsと核細胞小器官を含むゲル状の内容は、顕微鏡スライドガラスまたはカバーガラス上に定着させています。このような製剤は、位相コントラストやDIC顕微鏡によって直接調べることができます。また、調製物は、スライドまたはカバースリップにのLBCsや細胞小器官を添付するために遠心分離することができます。このような調製物は、その後、主に免疫蛍光及びfluorescenによって、核酸およびタンパク質の詳細な分子分析のために処理することができますin situハイブリダイゼーション（FISH） における T。 3-7
第2の技術は、鉱油中のGVの単離を含みます。 8オイル分離されたのGVは、多くの時間のための転写活性のままで、もう1つは核の内容は、できるだけ実物そっくりになりたいと思っている研究に有用である可能性があります。 9,10核「樹液」の屈折率はのLBCsと他の核内小器官（ 図3）に近いので、顕微鏡の技術は、油分離されたのGVと挑戦することができます。
最後に、それらの大きさや操作のしやすさの、のGVは核膜の研究のための理想的な材料です。核膜孔複合体は、最初の両生類のGVエンベロープ11とより最近の超解像観察に電子顕微鏡研究から説明したのと同じ材料を使用しています。 12,13
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Protocol
Xenbase（http://www.xenbase.org）およびSal-サイト（http://www.ambystoma.org）：一般的なカエルやサンショウウオの情報だけでなく、動物のソースは、以下のウェブサイトで見ることができます。このプロトコルは、カーネギー研究所の発生学の部門の動物保護ガイドラインに従っています。
1.ソリューション
- 攪拌しながら10 Lの脱イオン水または脱塩素化H 2 Oに1 MのNaHCO 3の1 MのCaCl 2および10 mLと10 mLを加え：10 L "カエルの水」を作ります。
- 1 Lの20％パラホルムアルデヒドを行います。4 mMののNa 2 CO 3の1 Lにします。化学フード内で溶解するのに約80°Cのに粉末状のパラホルムアルデヒド、および熱の200グラムを追加します。ろ紙を通してクール、フィルター。注意：パラホルムアルデヒドは毒性があり、注意して取り扱わなければなりません。また、商業パラホルムアルデヒド溶液を購入。
- 1 L両生類麻酔薬溶液を作製：エチル3- aminobenの1.5グラムを追加します。1 Lカエルの水にzoateメタンスルホン酸塩。室温で保管してください。
- する1 L卵母細胞培地OR2 14：82.5 mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、1mMの塩化カルシウム、1mMのMgCl 2、1mMののNa 2 HPO 4、5mMのHEPES（500mMのストック、pHは8.3から）。最終pHは、pH約7.8になります。細菌の増殖を防止するために、100mgのアンピシリン及び100mgのストレプトマイシンを追加します。
- 83のKCl、17 mMの塩化ナトリウム、6.5mMののNa 2 HPO 4、3.5mMのKH 2 PO 4、1mMのMgCl 2、1mMジチオスレイトール（DTT）：1のL GV分離液を作ります。 pH7.0に調整します。
- 100mLのGVの分散液作る：20.7ミリモルのKCl、4.3 mMの塩化ナトリウム、1.6ミリモルのNa 2 HPO 4、0.9mMのKH 2 PO 4、1mMのMgCl 2、1mMジチオスレイトール（DTT）、0.1％パラホルムアルデヒド。 pH7.0に調整します。核ゲルのより急速な分散を容易にするために、10〜50μMのCaCl 2を追加します。
- 500 mLの下塗り液を作ります。 2で商業ゼラチンの0.5グラムをスウェル10分- 5 0 mLのH 2 O。 500 mLの沸騰H 2 Oを追加し、慎重にゼラチンを溶解させるために旋回。クールおよび50mg CRK 4 O℃で吸引し、ストアと（SO 4）2・12 H 2 Oフィルターを追加
- 10 mLのメディアをマウントしてください。 5 mLのPBS中に10mgのフェニレンジアミンを溶かし（135mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、4.3ミリモルのNa 2 HPO 4、1.5mMのKH 2 PO 4、pHを9に調整しました）。 5 mLのグリセロールを追加します。 C. O -80で250μLの分量を保存します
2.材料
- 下塗りしたスライドの場合は、場所3インチ×1インチのガラス顕微鏡は、市販の洗剤液にスライドし、任意の汚染物質を除去するためにそれらをこします。スライドラックに置き、次いで脱イオン水で、水道水でよくすすいでください。 、下塗り溶液中でスライドを浸し角度でドレイン、および60 O℃で一晩焼きます
- プラスチック製の正方形の場合、厚さ1mmのポリ（メタクリル酸メチル）のシートから25ミリメートルの正方形をカット。ドリル各正方形の中央に5ミリメートルの丸穴。砂の顔や正方形だけでなく、穴の周囲の縁の両方。
注：次の段落で説明したように、プラスチック製の正方形とウェルスライド自家製の代替として、 その場 PCRおよびハイブリダイゼーションチャンバー（25μL） の商業接着剤を使用しています。これは徹底的にまだとしてテストされていませんが、一つは、おそらくまた、細胞培養のための再利用可能なシリコーンアイソレータを使用することができます。 - ホットプレート上で50ミリリットルのガラスビーカーに- （57°Cの 56）パラフィンワックスの30グラム-よくスライドの場合は、20を溶かします。 20μLピペットで、下塗りスライドの中央の両側にパラフィンの1 5μL降下を広げました。パラフィンにプラスチック製の正方形を押して、ホットプレート上にスライドを配置します。パラフィンが溶けてしまうと、プラスチック製の正方形の下に均等に分散する必要があります。
- ホットプレートからスライドを削除し、それが冷まします。スライドはTABLに接触しないように、スライドの各端部の下に支援を置き冷却プロセスの間etop。パラフィンがあまりにも急速に冷却する場合には、中央の穴から引き離すことができます。 10以上ものスライドを準備し、各GV準備は新しい井戸スライドを使用しています。
- 遠心分離用のスライドキャリアのために、使用ローターのために特別に構築されたキャリアを使用しています。ウェルプラスチックプレート - いくつかのメーカーが96のためのキャリアとの遠心分離機を提供しています。これらの担体は、顕微鏡スライドを保持するために非常に簡単に適合させることができます。
卵母細胞の単離3
- 完全に動物をカバーするのに十分な麻酔薬溶液中の成人女性のカエル（ アフリカツメガエルやアフリカツメガエルトロピカ ）やサンショウウオ（Ambystomaのmexicanum）を配置します。動物が運動を停止すると、それを適当な容器内欠けた氷のベッドの上で腹アップを配置します。
- 正中線に下腹部横3センチ切開 - 手術用ハサミで2を作ります。 （第切開部の側の卵巣を見つけるために、そっと脇内臓を移動ERE 2卵巣、腹部の両側に1つずつ）があります。計画された実験のための十分な卵母細胞と卵巣の一部を切り取ります。卵母細胞の数千人が、それぞれの卵巣に存在するため、卵巣の比較的小さなピース（1〜3センチメートル）は、通常は十分であろう。
- 1または室温で大きなペトリ皿（100ミリメートル）でOR2食塩水で卵巣のいくつかの作品を配置します。破損した卵母細胞が削除された場合、卵母細胞は、数日間良好な状態で保存することができ、OR2溶液は毎日変更されます。
- 手術用絹糸で切開を縫合し、回復のための個々のガラスボウルに動物を返します。それは意識（約15分）を回復するまで動物をカバーするだけの十分な「カエルの水 "を追加します。動物が自発的な動きを示した後、水でボウルを埋めます。新鮮な水を使用する必要がありますが、両生類では、手術後に感染することはほとんどないように、無菌性は、必要ありません。所望の場合、ネオマイシンが縫合糸に適用することができます。傷は通常、FE後に完全に治癒しますW日と同じ動物は、約2ヶ月後に再び使用することができます。
卵核胞（GV）の4.絶縁
- OR2溶液を含む小さなペトリ皿（35×10ミリメートル）で - （20大卵母細胞10）卵巣の一部を配置します。
- 子房壁に卵母細胞をつなぐ組織の薄い茎を引き裂くために＃5宝石商の鉗子の2ペアを使用して、卵巣から卵母細胞を除去します。 GV分離培地を含む別の小さなペトリ皿の中の卵母細胞を配置します。
注：のLBCsの状態は、卵母細胞のサイズ（成熟度）に依存します。 LBCsは、フルサイズよりもわずかに小さい卵母細胞において顕著なループを最大長さに達します。最も成熟した卵母細胞は、多くの場合、契約のループと短い染色体を含んでいます。 - 解剖顕微鏡（ - 20ミリメートルフィールド直径約10）の低倍率の下で次の手順を実行します。
- 動物極（暗い半球）の近くに鉗子の両方のペアとの卵母細胞をつかみ、SMを作りますすべての涙。透明な卵母細胞の核のために押し出された卵黄に見ても、卵核胞またはGVと呼ばれます。
- また、鉗子の一組と動物極の近くに大きな穴を突く、穏やかに卵黄（ 図2）と一緒にGVを絞り出します。
- 静かに卵黄のバルクからGVをロールバックします。通常GVにしっかりと付着卵黄少量のがあるでしょう。
核膜の5.取り外し
- アフリカツメガエルとX.トロピカリスのために、まだ少し付着卵黄があっても、分離の60秒以内に拡散媒体への分離媒体からGVを転送します。
注：分離媒体中に放置し、その後の工程に拡散しない場合のGVは、これら2つの種の約60秒以内に「硬化」。 アフリカツメガエル GV内容を調べるときしたがって速度が最も重要です。- 1ペアでGVの上部付近に核膜をつかみ宝石商の鉗子で、押し下げないように注意しながら。できるだけ最初に近い鉗子の第二の対で封筒をつかみます。鉗子の2ペアは互いに離れて引っ張り、GVの内容は、一方または両方の鉗子に密着する封筒のうち自由を "ポップ"になります。
- ガラスピペットまたは調整可能な20μLマイクロピペットでGV内容をピックアップ。調整可能なピペットを使用している場合は、10μLにピペットを設定し、カミソリの刃を持つプラスチックチップの先端を切り落としました。残りの5μLにGVを拾う前に、液体の5μLに描画します。
- 以前に解決策を拡散で満たされたウェルスライドの中央にはまだ、ゲル化の核で内容を転送します。カバースリップが追加されたときに気泡がトラップされないように拡散ソリューションは、凸面を有していなければなりません。
- カバースリップ（18ミリメートル）を追加し、湿室でスライドを配置します。染色体ように、60分 - 核ゲルは、ゆっくりと次の10の上に分散しますsおよび核細胞小器官は、スライドガラスの表面上に位置するようになっ。
注：サンショウウオのA.のmexicanumののGVとN. viridescensが過度に分離培地で「硬化」はありません。したがって1は、 アフリカツメガエルで1缶よりも核膜を除去しながら、よりのんびりと進むことができます。
- セクション5.1.1で説明したようサンショウウオGVからの核エンベロープを削除したが、分離培地で行います。
- ピペットを用いて、わずかにゲル化GV内容をピックアップし、拡散溶液を含むペトリ皿に移します。
- 迅速、拡散溶液中にピペットチップを洗い流し、核ゲルをピックアップして、以前のソリューションを拡散で満たされたウェルスライドの中央に配置します。 18ミリメートルカバースリップを追加し、湿ったチャンバー内でスライド全体を配置します。核樹液はゆっくりと次の10の上に分散する - 60分と染色体と核細胞小器官は、ガラス表面上に位置するようになります。 </ OL>
LBCsとオルガネラの6予備的観察
- 拡散チャンバー内の核内容の分散した後、低倍率で位相コントラスト（従来正立顕微鏡）でのLBCsと核細胞小器官を表示します。 （ - 10X 5X）チャンバーは、約1ミリメートルの深さと核内容は下部にあるので、長作動距離と低倍率の対物レンズを使用しています。
注：この時点で準備を調べるための主な理由は、それが次の手順を運ぶ価値があるかどうかを判断することです。良い準備では染色体が壊れていないで、チャンバーの底に沈殿しています。これは、スライドにランプブラシ染色体ループの最適な取り付けを確実にするよう、準備を作る時間以内に遠心分離ステップに進みます。
原子力内容の7.遠心分離
- カバースリップ上に濾紙を置き、下に押しチャンバーから余分な液体を除去します。
- カバーガラスの両側にワセリンの約1mm 3を置きます。根底にあるプラスチック製の正方形の上にカバーグラスをシールするために80°Cの -約70まで加熱された金属棒でワセリンを溶かします。
- 反対側のキャリアがバランスしていることを確認して、遠心分離用スライドキャリアにスライドを置きます。 1時間 - 30分間、約4800×gでスライドを遠心。 4 O℃で遠心分離にスロースタート機能を使用します。
8.原子力内容を修正
- ほとんどのその後の手順については、パラホルムアルデヒドとの核内容を修正します。
- 標準的な顕微鏡スライド染色皿にスライドラックを配置し、ラックに個別にスライドを配置します。 （ - OR 2またはPBS中の4％パラホルムアルデヒド2）スライドをカバーするのに十分な固定剤を追加します。
- 鈍鉗子のペアで、横方向にカバースリップを押して、それを拾うし、適切なガラスゴミ箱にそれを捨てます。30分 - 少なくとも15のための固定液にスライドしたままにします。 in situハイブリダイゼーション、ほとんどの抗体汚れでは、固定（Hまたはd）の長い期間が許容されます。
- プラスチック製の正方形を削除するには、場所は染色皿に氷冷OR2またはPBSに一度に1をスライドさせます。プラスチック製の正方形の端に鋭利なカミソリの刃を挿入し、緩い、それを取り外します。
注：理想的には、プラスチックは、スライド上のすべてのパラフィンワックスを残し、きれいに外れます。ワックスは、有用な目的を果たす：それは核の内容がスライドに取り付けられた小さな中央領域を取り囲んでいるので、それは1つが、少量（5から10μL）で動作することを可能にするダムとして機能する免疫染色用試薬等の。スライドは冷たいOR2またはPBSで無期限に保持することができます。
9.のLBCsの免疫染色及び核オルガネラ
- OR2またはPBS中のストレージから固定GVの準備を削除します。余分な液体を拭き取り、湿ったチャンバー内で支持体上に配置します。便利CHAMBerは湿った濾紙の90ミリメートルの円を含む90×15ミリメートルのペトリ皿です。
注：この時点で、核内容がしっかりとパラフィンワックスの自由な5ミリメートルの円形領域内のスライドに取り付けられています。ワックスは、撥水性であるため、一つは追加、20μLピペットで中央領域の縁に少量の液体を除去することにより溶液を変更することができます。主な予防措置は、ピペットチップでワックスフリーエリアに触れないようにすることです。 - 試薬の - （20μL10）、少量で免疫染色行います。染色体と核細胞小器官は非常に小さく、追加の試薬と直接接触しているので、染色プロトコルを短くすることができます。一次および二次抗体染色時間は1時間以下と短くすることができます。これは準備に損傷を引き起こすとして、いずれかの段階で洗剤を含めないでください。 LBCsの軸を強調するために20分 - 希望の場合は、10のためのDAPI（1μg/ ml）で準備を染色。
- グリセロールでマウントまたは商業マウント免疫蛍光法に適した培地をる。実装工程中に気泡をトラップ回避するには、次のように進みます。
- 20μLピペットの先端に取り付けメディアの15μLを引き出します。ろ紙（＃1濾紙の90ミリメートルの円からの非常に薄い三角形の形状でカット）の作品でそれを「ウィッキング」により、直ちに核広がり周囲の領域から可能な液体だけを削除します。
- 核の広がりの部分に触れないように注意しながら、準備への実装メディアのほとんどをピペット。最後の1μLを置くか、22ミリメートルのカバーガラス（厚さ＃1.5）の中心にメディアを装着するようにします。準備の上にカバースリップを反転し、所定の位置に慎重にドロップします。
- 一時的なマウントの場合、数日までに、50％グリセロール中に1mg / mLのフェニレンジアミンを使用します。永久マウントの場合、特に超解像研究のために、約1.46の屈折率に硬化する低蛍光媒体を使用しています。
in situハイブリダイゼーション（FISH）のLBCsの原子力細胞小器官10.蛍光
- FISHプロトコルは、通常、高温での工程を必要とするので、準備からパラフィンワックスを除去します。手順が面倒であり、準備の偶発的な損傷につながることができますが、慎重に、かみそりの刃でこすり。ダイヤモンドポイントとスライドの背面の準備の領域をマークするのに便利です。
- 代替的に、キシレンでパラフィンワックスを溶解します。コプリンジャーまたは含有する染色ディッシュ一連の設定：30％、50％、70％、95％、および100％エタノールを、キシレンの3の容器; 100％エタノールと1アセトンの2以上の容器。
- （攪拌される場合でも短い時間）各5分濃度に - スライドキャリアにスライドを置き、3スライドを残して、エタノール系列でそれらを脱水。
- キシレン3容器を通してスライドを通過させることによってパラフィンワックスを溶解し、約5分毎に攪拌場合。削除します2 100％のエタノールを通過することにより、キシレン、最後にアセトンでエタノールを除去。アセトンからスライドを取り出し、乾燥させるためにそれらを傾けます。
- 任意の標準的なプロトコルを使用して、in situハイブリダイゼーションを行います。 15,16
石油の下でGVの11の単離
- できるだけ周囲の組織を含む、宝石商の鉗子でOR2溶液から卵母細胞をピックアップ。 ＃1ろ紙の小片に卵母細胞を置きます。過剰OR2溶液は、液体のほぼ自由卵母細胞を残し、ろ紙に転送されます。 「ドライ」卵母細胞をピックアップし、小さなペトリ皿（35×10ミリメートル）で軽量鉱物油（パラフィン油）の表面の下に置きます。
- 細かいタングステン針や鉗子の1タインにより、暗い動物極に近い卵母細胞に小さな穴を突きます。鉗子の1組（ヒントを避ける）と卵母細胞をピックアップし、軽く絞ります。 GVは、より小さなまたはlと一緒に押し出しますその表面に卵黄のarger量（ 図3）。
- 優しく鉗子の側でGVを掃引して、できるだけ多くの卵黄を削除してください。ほとんどの場合、卵黄のすべてを除去することは困難になります。しかしながら、ほとんどの目的のために卵黄少量の問題ではありません。
- GV内容を観察するために、多かれ少なかれGVを平ら。
- ウェルスライドからプラスチックの正方形を削除し、パラフィンオイルのための浅い容器として残りのパラフィンワックスを使用します。 10 20μLピペットでパラフィン油と一緒にGVをピックアップし、パラフィン領域の中心に移します。カバースリップを追加して、部分的に平坦化GVの内容を確認します。この技術はのLBCsが損傷を受けることはありません。
- また、核内小器官の観察のために10μm程度の厚さにGVを平ら。
- 鋭利なかみそりの刃でプラスチック製ピペットチップの最終的な1ミリメートルをカット。 GVを吸います鉱物油の正確に5μLとともに先端。 22ミリメートルのガラスカバースリップの中央にGV、すべての油を押し出します。
- それだけで油滴に触れるまでゆっくりと標準3 "×1"スライドガラスを下げます。ドロップすると、カバーガラスは、毛細管現象により上昇され、油がカバーガラスの端に広がっていきます。ドロップが完全に広がっている場合には、油は、約10ミクロンの厚さになります。 LBCsが破損され、大規模な核小体がわずかに圧縮されますが、彼らは無傷のGV（ 図3）に存在するように小さい核細胞小器官のほとんどは、多かれ少なかれ表示されます。
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Representative Results
巨大なランプブラシ染色体を調べるために1は、カエルやサンショウウオの卵母細胞を単離することによって開始します。 図1はカエル、 アフリカツメガエルの卵巣から除去した後の緩衝溶液中で成熟した卵母細胞の集団を示しています。このような卵母細胞は、室温で日間良好な状態で残っています。核（または卵核胞）を、食塩水（ 図2）又は油のいずれかで宝石商の鉗子（ 図3）を有する卵母細胞から除去されます。油分離された核の核内容物を穏やかに核を潰し、位相コントラストまたは微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡により観察することにより調べることができます。食塩水に分離された核の内容を調べるためには、まず宝石商の鉗子との核エンベロープを削除し、内容物を顕微鏡スライド上にセトリングできるようにする必要があります。準備はその後トンを取り付けるために遠心分離され、彼は、染色体は、抗体（ 図4）で染色またはインサイチュハイブリダイゼーションに供することができ、その後スライドにしっかり染色体。サンショウウオのランプブラシ染色体はカエル（ 図5）のものよりもはるかに大きいです。両方の場合において、個々の転写ユニット（遺伝子）は、染色体軸から横方向に突出したクロマチンのループと見なすことができます。
図1： カエルの X.トロピカリス から成熟した卵母細胞 。成熟した女性のカエルの卵巣は成熟の異なる段階での卵母細胞の数千人が含まれています。最小は、体細胞の大きさであり、すでに第一減数分裂の前期に達しています。卵母細胞が成長するにつれて、それは徐々に細胞に不透明な白い外観を与える、卵黄を蓄積します。最大のマットここに示されているURE卵母細胞は、メラニン色素の蓄積による暗いキャップを獲得します。アホロートルのものは巨大な2.2ミリメートルでありながらX.トロピカリスの最大の卵母細胞は、直径が約0.8ミリメートル、 アフリカツメガエルのものは約1.4ミリメートルです。サイズを除いて、すべての3つは一般的な外観が似ています。スケールバー= 1ミリメートル。
図 2：X.トロピカリス の卵母細胞からGVの除去 。 左。小さな穴は、卵母細胞の暗い動物極に宝石商の鉗子で作られたとGVを静かに押し出しました。それは卵母細胞から出てきたように、この例ではGVは卵黄のほぼ自由でした。接着卵黄はGV自体の直径よりもわずかに大きいに先端径のピペットからGVを吸引によって除去することができます。 右。 TX.トロピカリスのHREEのGV。これらのGVは、核膜が離れてゲル化し、核内容から膨潤させ、わずかに酸性媒体（pHを5.8に調整GV分離液）、中に数分間放置しました。このように処理されたのGVは、細胞学的検査のために広がりません。しかし、そのようなのGVは、分子分析のために理想的である：エンベロープは、細胞質汚染の完全自由核内容のサンプルを提供する、宝石商の鉗子を用いて除去することができます。 17,18スケールバー= 0.5ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： オイルに分離された X.トロピカリス のGV。 左。小さな穿刺は、暗い動物の経口近く卵母細胞で作られた後ル、GVは押し出すようになりました。この場合、GVはほとんど付着卵黄で出てきました。 中間。 GVは現在、卵母細胞の細胞質から完全に無料です。このようなのGVは、時間のRNAを転写し続けます。 右。 GVを穏やかにカバースリップの下で油に押しつぶされた後、核内小器官は、ここに示されているように、DICによって見、または位相コントラストにより得ることができます。全体GVは、ここに示されている小面積よりもはるかに大きいです。 HLBは、その表面上の3つのスペックルとヒストン遺伝子座体を=。最初の二つのパネルのためのスケールバー= 0.5ミリメートル、第三のために10μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： ランプブラシ染色体（のLBCs）アホロートルAで mexicanum から 。 左。 右。同製剤は、暗視野照明によって観察しました。一つは、今、多数の未染色の増幅された核小体を見ることができます。スケールバー=250μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ウーパールーパーの A.のmexicanum とカエル X.トロピカリス からのシングルLBC、 同じ倍率で。これらの画像は、サンショウウオやカエル（挿入図）ののLBCs間の極端な大きさの違いを示しています。サイズdifferenceは（X.トロピカリスのための1.7ポンド対 A.のmexicanumでは約30ポンド）のゲノムの全DNA含有量と相関します。個々の横ループ（転写単位）はカエルよりもはるかに長いサンショウウオでもあります。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
カエルやサンショウウオの手孤立のGVから「生きている」のLBCsの最初の観測は、蛍光免疫染色の前に、およびFISHの前に、アメリカの生物学者ウィリアム・Duryee、位相コントラストやDIC顕微鏡の導入前の19で、ほぼ80年前に作られました。リアルな方法でそれらを修正するために、その基本的な形態を破壊することなく、分子技術を適用するために、ガラススライドにのLBCsを取り付けるための技術の個々の遺伝子レベル必要な開発で染色体構造および転写の詳細を調査するためのLBCsの利点。これらの目標を達成するために、ほぼすべての技術は、調査中の種とリアルな保全と分子特性の間にいくつかの妥協にいくつかの適応を必要とします。例えば、のGVと尾両生類ののLBCsは、その巨大なサイズとGV内容が適切な媒体中に分散しやすさので動作するように非常に簡単です。 Until最近、しかし、非常に少ないことが困難な分子の詳細と細胞学的特徴の富を相関すること、彼らのゲノミクスについては知られていました。逆に、 アフリカツメガエルののLBCsは、尾両生類（ 図5）に比べて非常に小さいですが、X.トロピカリス及びアフリカツメガエルの両方のゲノムが配列決定されていると合理的に注釈を付けています。
最初の両生類のGVを用いたものについては、主要な課題は、GVを分離し、のLBCsに損傷を与えることなく、核膜を除去することになります。今日まで、誰もが宝石商の鉗子で手による場合を除いて、エンベロープを削除する方法を発見していません。道は「溶解」または封筒を「ダイジェスト」が、損傷を受けていない染色体および他の核細胞小器官を残すことが判明した場合は、主要な技術的進歩となるであろう。このような技術は、分子生物学的研究のためにも同様に有用であろう。核および細胞質RNA上の私たちの研究では、我々はにそれが不可欠発見しました核RNA（ 図2）の分析の前に核膜を除去します。封筒が削除されていない場合17,18は 、核RNA少量の封筒の外側に付着した細胞質RNAを汚染さに圧倒されています。
もう一つの大きな改善は、顕微鏡スライドにより緊密のLBCsを取り付けるためのいくつかの方法の発見であろう。準備の遠心分離は重要であるが、それでも長時間の遠心分離（4500×gで1時間）は、添付ファイルを保証するものではありません。 LBCsはよく培地拡大し、位相コントラストでそれらを調べることによって接続されている場合一つは、通常、伝えることができます。まあ付染色体が全くブラウン運動を示しません。ループのいずれかのブラウン運動が検出された場合、その後の免疫染色またはFISHプロトコルは、大規模な損傷や材料の損失につながります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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