Summary
Nós apresentamos técnicas simples para isolar gigantes cromossomos lampbrush transcricionalmente ativos a partir de oócitos de rãs e salamandras vivo. Nós descrevemos como observar esses cromossomos "vivo" por contraste de fase ou contraste de interferência diferencial, e como corrigi-los para hibridação in situ fluorescente ou coloração de imunofluorescência.
Abstract
Nós descrevemos métodos para estudar os cromossomos gigantes transcricionalmente ativos lampbrush (lbcs) encontrados no oócito ou ovo unlaid, de rãs e salamandras. Lbcs individuais pode ser de até 1 mm de comprimento e que residam num núcleo gigantesca, em si até 0,5 mm de diâmetro. O grande tamanho dos cromossomas permite observações inigualáveis de genes activos por microscopia óptica de luz, mas, ao mesmo tempo técnicas especiais são necessárias para o isolamento do núcleo, retirando o envelope nuclear, e espalhando os cromossomas numa lâmina de microscópio. O núcleo do oócito, também chamado de vesícula germinal (GV), é isolado num meio que permite que a gelificação parcial da actina nuclear e preserva a estrutura delicada das lbcs. Esta etapa é efectuada manualmente, sob um microscópio de dissecação com uma pinça de joalheiro. Em seguida, o envelope nuclear é removido, mais uma vez manualmente com uma pinça de joalheiro. O conteúdo nucleares são rapidamente transferidos para um meio que disperses o gel actina e permite que os lbcs não danificados para liquidar sobre uma lâmina de microscópio. Neste ponto, os lbcs e outras organelas nucleares pode ser visto por contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial, embora mais pequenos detalhes são obscurecidos por movimento browniano. Por observação microscópica alta resolução ou a análise molecular, toda a preparação é centrifugada para prender os delicados lbcs firmemente à corrediça. Uma breve fixação em paraformaldeído é seguida por coloração de imunofluorescência ou hibridação in situ. Lbcs estão em um estado transcricionalmente ativo e seu enorme tamanho permite a análise molecular ao nível do gene individual usando microscopia de super-resolução confocal ou.
Introduction
A maioria dos vertebrados, com a notável exceção de marsupiais e mamíferos placentários, produzem ovos grandes vitelinados. Apesar de seu tamanho, por vezes enorme, esses ovos são células isoladas que atingem a sua dimensão final, enquanto ainda no ovário da fêmea. Ovos do ovário são chamados de ovócitos e cada normalmente contém um único núcleo gigante, conhecido desde o início do século 19 como a vesícula germinal ou simplesmente GV. 1 oócitos de rãs de laboratório comuns, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, atingir um diâmetro máximo de 1,2 milímetros e 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Os GVs de oócitos maduros destes dois sapos são 0,3 - 0,4 mm de diâmetro (Figuras 2, 3). Salamandras normalmente têm oócitos e GVs ainda maiores. Oócitos totalmente maduros do axolotl mexicano, Ambystoma mexicanum, são mais de 2 mm de diâmetro eo GV é de cerca de 0,5 mm. Assim, estes núcleos são facilmente visíveis a olho nu e podeser manipulados de várias maneiras que são impossíveis com os núcleos das células somáticas típicas.
Igualmente notável é o tamanho gigantesco dos cromossomos dentro do GV, fato já reconhecido no final do século 19. Cromossomas individuais de Ambystoma e outros salamandras pode ser de até 1 mm de comprimento (Figuras 4, 5). Aqueles de Xenopus são consideravelmente menor, embora com comprimentos até 100 m ou mais, minimizam os cromossomas somáticas típicas da maioria dos organismos. Uma característica importante dos cromossomas oócito é a sua extraordinária actividade de transcrição, o que leva a um dos seus aspectos mais característicos morfológicas - centenas de malhas laterais emparelhados (Figura 5). Cada ciclo é constituído por uma ou algumas unidades de transcrição que sintetizam activamente o ARN. Os loops dar oócito cromossomos uma aparência difusa, o que levou ao nome do cromossomo "lampbrush" após a sua superficialsemelhança com as escovas usadas em épocas anteriores para limpar querosene chaminés da lâmpada. 2
O foco deste artigo é sobre o uso da GVS isoladas para estudar lbcs e organelas nucleares (nucléolo, órgãos histona de locos, e manchas). Duas técnicas bastante diferentes serão descritas. Na primeira técnica, mais comum, GVs são isolados numa solução salina utilizando uma pinça de joalheiro, brevemente enxaguados para remover gema aderente, e o envelope nuclear é removido, de novo com uma pinça de joalheiro. O conteúdo gelatinosos, contendo os lbcs e organelas nucleares, estão autorizados a resolver sobre uma lâmina de microscópio de vidro ou lamela. Tais preparações podem ser analisados directamente por microscopia de contraste de fase ou DIC. Alternativamente, as preparações podem ser centrifugadas para anexar os lbcs e organelas para o slide ou lamela. Tais preparações podem ser processadas para análise molecular detalhada de ácidos nucleicos e proteínas, principalmente por imunofluorescência e fluorescent hibridação in situ (FISH). 3-7
Uma segunda técnica envolve o isolamento de GV em óleo mineral. 8 GVs isolada-do petróleo continuam transcricionalmente ativa por muitas horas e são potencialmente úteis para estudos onde se quer o conteúdo nucleares para ser o mais realista possível. 9,10 Uma vez que o índice de refracção de o "SAP" nuclear é próxima daquela das lbcs e outros organelos nucleares (Figura 3), as técnicas de microscopia pode ser um desafio com isolado GVs-óleo.
Finalmente, por causa de seu tamanho e facilidade de manipulação, a GVS são material ideal para estudos sobre o envelope nuclear. O complexo do poro nuclear foi descrita pela primeira vez a partir de estudos de microscopia eletrônica em envelopes GV anfíbios 11 e observações SuperResolution mais recentes têm usado o mesmo material. 12,13
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Protocol
Informações gerais sobre rãs e salamandras, bem como fontes de animais, podem ser encontrados nos seguintes sites: Xenbase (http://www.xenbase.org) e Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais do Departamento de Embriologia do Instituto Carnegie para a Ciência.
1. Soluções
- Faça 10 L "sapo água": Adicionar 10 ml de 1 M de CaCl2 e 10 mL de 1 M NaHCO3 a 10 L deionizada ou H 2 O sem cloro com agitação.
- Adicione 1 L de 20% de paraformaldeído: Adicione 1 L de 4 mM de Na 2 CO 3. Num capuz química adicionar 200 g de paraformaldeído em pó, e aquecer a cerca de 80 ° C para dissolver. Cool, e filtrar através de papel de filtro. Cuidado: paraformaldeído é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Alternativamente, comprar solução de paraformaldeído comercial.
- Adicione solução anestésica anfíbio 1 L: Adicionar 1,5 g de acetato de 3-aminobenmetanossulfonato Zoate a 1 L de água sapo. Armazenar em temperatura ambiente.
- Adicione 1 L de meio de cultura de oócitos OR2 14: NaCl a 82,5 mM, KCl 2,5 mM, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de Na 2 HPO 4, HEPES 5 mM (a partir de estoque 500 mM, pH 8,3). O pH final será de cerca de pH 7,8. Adicionam-se 100 mg de ampicilina e 100 mg de estreptomicina para prevenir crescimento bacteriano.
- Adicione 1 L de solução de isolamento GV: KCl 83 mM, NaCl 17 mM, 6,5 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 1 mM de ditiotreitol (DTT). Ajustar a pH 7,0.
- Adicione 100 ml de solução de dispersão GV: KCl 20,7 mM, NaCl 4,3 mM, 1,6 mM de Na 2 HPO 4, 0,9 mM de KH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 1 mM de ditiotreitol (DTT), 0,1% de paraformaldeído. Ajustar a pH 7,0. Para facilitar a dispersão mais rápida do gel nuclear, adicionar 10-50 uM de CaCl 2.
- Faça 500 solução subbing mL. Inchar 0,5 g de gelatina comercial em dois0 mL de H 2 O durante 5 - 10 min. Adicionar 500 mL de ebulição H2O e cuidadosamente agitar para dissolver a gelatina. Arrefecer e adicionar 50 mg CRK (SO 4) 2 · 12 H 2 O. Filtro com sucção e armazenar a 4 o C.
- Faça 10 mL de meio de montagem. Dissolve-se 10 mg de f enilenodiamina em 5 ml de PBS (NaCl 135 mM, KCl 2,5 mM, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, 1,5 mM de KH 2 PO 4, ajustada a pH 9). Adicionar 5 mL de glicerol. Loja em 250 mL alíquotas a -80 o C.
2. Materiais
- Para slides subbed, lugar de 3 polegadas x 1 polegada de vidro de microscópio desliza em uma solução de detergente comercial e esfregá-los para remover quaisquer contaminantes. Coloque em um rack lâmina e lavar bem em água da torneira, em seguida, em água deionizada. Mergulhar as lâminas na solução subbing, escorra em um ângulo, e leve ao forno durante a noite a 60 o C.
- Para quadrados de plástico, corte de 25 mm quadrados a partir de uma folha de 1 mm de espessura de poli (metacrilato de metilo). perfurar umburaco 5 mm redonda no centro de cada quadrado. Areia ambas as faces e as arestas do quadrado, bem como da circunferência do furo.
NOTA: Como alternativa ao caseiro quadrados de plástico e lâminas bem, como descrito no parágrafo seguinte, usar adesivo comercial na PCR situ e câmaras de hibridação (25 ul). Pode-se, provavelmente, também usam isoladores de silicone reutilizáveis para cultura de células, embora isto não tenha sido exaustivamente testado ainda. - Para slides bem, derreta 20 - 30 g de cera de parafina (56-57 ° C) em um copo de 50 mL de vidro em um prato quente. Com uma pipeta de 20 mL, espalhar uma gota de 5 mL de parafina de cada lado do centro de uma corrediça Substituído. Pressione um quadrado de plástico na parafina e coloque a lâmina sobre a placa quente. A parafina vai derreter e deve espalhar uniformemente sob a praça de plástico.
- Remover o slide da placa quente e deixe esfriar. Coloque um suporte em cada extremidade da lâmina, de modo que a lâmina não entrar em contato com o TABLETOP durante o processo de arrefecimento. Se a parafina arrefece muito rapidamente, pode afastar-se a partir do furo central. Prepare 10 ou mais slides assim: cada preparação GV utiliza um novo poço de slides.
- Para portadores de slides para centrifugação, use especialmente construído transportadoras para o rotor utilizado. Vários fabricantes oferecem centrífugas com as operadoras para 96 - bem pratos de plástico. Estas transportadoras pode ser adaptado facilmente para manter lâminas de microscópio.
3. Isolamento de oócitos
- Coloque um sapo adulto do sexo feminino (Xenopus laevis ou tropicalis Xenopus) ou salamandra (Ambystoma mexicanum) em solução de anestésico suficiente para cobrir o animal completamente. Quando o animal deixa o movimento, coloque-o de barriga para cima sobre uma cama de gelo lascado em um recipiente adequado.
- Com uma tesoura cirúrgica fazer de 2 - 3 centímetros incisão na parte inferior do abdómen lateral à linha mediana. Mover os órgãos internos suavemente de lado para encontrar o ovário no lado da incisão (THere são dois ovários, uma em cada lado do abdómen). Cortar uma porção do ovário com oócitos suficientes para as experiências planeadas. Desde há milhares de oócitos em cada ovário, um pedaço relativamente pequeno de ovário (1-3 cm), será normalmente suficiente.
- Coloque uma ou algumas peças de ovário em solução salina OR2 em uma grande placa de Petri (100 mm) à temperatura ambiente. Os oócitos podem ser armazenados em boas condições durante vários dias, se oócitos danificadas são removidos e a solução OR2 é trocado diariamente.
- Suturar a incisão com seda cirúrgico e retornar o animal a uma tigela de vidro individual de recuperação. Adicionar apenas o suficiente "água sapo" para cobrir o animal até que ele recupera a consciência (cerca de 15 min). Depois que o animal mostra movimentos voluntários, encher a tigela com água. Embora a água doce deve ser usado, a esterilidade não é necessário, como anfíbios quase nunca se tornam infectadas após a cirurgia. Se desejado, a neomicina pode ser aplicada às suturas. A ferida geralmente cicatriza completamente depois de um feW e dia no mesmo animal pode ser novamente utilizado depois de cerca de 2 meses.
4. Isolamento de uma vesícula germinal (GV)
- Coloque uma porção do ovário (10 - 20 oócitos grandes) numa pequena placa de petri (35 x 10 mm) contendo solução OR2.
- Remover um oócito do ovário usando dois pares de pinças de joalheiro # 5 para rasgar a haste fina de tecido que liga o oócito para a parede do ovário. Coloque o oócito em outra pequena placa de Petri contendo meio de isolamento GV.
NOTA: O estado da lbcs depende do tamanho (maturidade) do oócito. Lbcs chegar comprimento máximo com loops proeminentes em oócitos que são um pouco menos de tamanho completo. Os ovócitos mais maduros, muitas vezes contêm cromossomos curtas com loops contratados. - Execute as seguintes etapas em pequeno aumento de um microscópio de dissecação (diâmetro de campo, aproximadamente, 10 - 20 mm).
- Segure o ovócito com dois pares de fórceps perto do polo animal (hemisfério escuro) e fazer uma smtoda lágrima. Olhe na gema extrudido para o núcleo do ovócito transparente, também chamada de vesícula germinal ou GV.
- Alternativamente, picar um grande buraco perto do pólo animal com um par de fórceps e aperte suavemente o GV, juntamente com gema (Figura 2).
- Agite-GV longe da maior parte da gema. Geralmente, haverá uma pequena quantidade de gema firmemente aderente ao GV.
5. A remoção do envelope nuclear
- Para X. laevis e X. tropicalis, transferir o GV a partir do meio de isolamento para o meio de propagação dentro de 60 s de isolamento, mesmo se há ainda um pouco aderente gema.
NOTA: GVs destas duas espécies "endurecer" dentro de cerca de 60 s, se deixada no meio de isolamento e não vai se espalhar em etapas subsequentes. Portanto velocidade é de extrema importância quando se examina o conteúdo Xenopus GV.- Segure o envelope nuclear perto do topo da GV com um parde fórceps de joalheiro, tomando cuidado para não pressionar para baixo. Agarrar o envelope com um segundo par de fórceps o mais próximo do primeiro quanto possível. Retire os dois pares de forceps para longe uma da outra e os conteúdos GV "POP" para fora livre do envelope, que adere firmemente a um ou ambos os fórceps.
- Pegar o conteúdo GV em uma pipeta de vidro ou um ajustável 20 mL micropipeta. Se usando uma pipeta ajustável, definir a pipeta de 10 uL e cortar a extremidade da ponta de plástico com uma lâmina de barbear. Desenhar em 5 mL de líquido antes de pegar o GV nos restantes 5 mL.
- Transferir o conteúdo nucleares ainda gelificados para o centro de uma corrediça bem previamente cheio com uma solução de espalhamento. A solução espalhando deve ter uma superfície convexa de modo a que uma bolha não fica preso quando a lamela é adicionado.
- Adicionar uma lamela (18 mm) e coloque o slide em uma câmara úmida. O gel nuclear vai dispersar-se lentamente ao longo do próximo 10-60 minutos, de modo que o cromossomas e organelas nucleares vir a mentir sobre a superfície da lâmina de vidro.
NOTA: GVS do salamandras A. mexicanum e N. viridescens não "endurecer" indevidamente no meio de isolamento. Portanto pode-se proceder mais calma com a remoção do envelope nuclear de uma lata com Xenopus.
- Remova o envelope nuclear a partir de um GV salamandra como descrito no ponto 5.1.1, mas fazê-lo no meio de isolamento.
- Pegar o conteúdo GV ligeiramente gelificada com uma pipeta e transferir para uma placa de Petri contendo solução de propagação.
- lavar rapidamente a ponta da pipeta na solução espalhando, pegar o gel nuclear, e colocá-lo no centro de um slide bem previamente preenchido com solução espalhando. Adicionar uma lamela 18 mm e coloque todo o slide em câmara úmida. A seiva nuclear lentamente vai se dispersar ao longo dos próximos 10-60 min e os cromossomos e organelas nucleares virá a mentir sobre a superfície de vidro. </ Ol>
6. Observação preliminar de lbcs e organelas
- Ver as lbcs e organelas nucleares por contraste de fase (microscópio vertical convencional) com pequeno aumento após a dispersão dos conteúdos nucleares na câmara de propagação. Porque a câmara é de cerca de 1 mm de profundidade e os conteúdos nucleares estão na parte inferior, utilize uma objectiva de baixa ampliação com uma longa distância de trabalho (5X - 10X).
NOTA: A principal razão para examinar a preparação neste momento é determinar se vale a pena levar a cabo os passos seguintes. Em uma boa preparação dos cromossomas são contínua e ter assentado no fundo da câmara. Avance para o passo de centrifugação dentro de uma hora de tornar a preparação, tal como isso vai garantir a fixação óptima das alças lampbrush cromossómicas na lâmina.
7. centrifugação do conteúdo nuclear
- Coloque um pedaço de papel de filtro sobre a lamela e pressionepara remover o excesso de líquido da câmara.
- Coloque cerca de 1 mm 3 de vaselina em cada lado da lamela. Derreta a geléia de petróleo, com uma haste de metal aquecido a cerca de 70 - 80 o C para selar a lamela para a praça de plástico subjacente.
- Colocar as lâminas em portadores de slides para centrifugação, certificando-se de que as transportadoras opostas são equilibradas. Centrifugar os slides em cerca de 4.800 g durante 30 min - 1 h. a 4 o C. Use o recurso de partida lento na centrífuga.
8. Fixação dos Conteúdos Nucleares
- Para a maioria dos procedimentos subsequentes, fixar os conteúdos nucleares com paraformaldeído.
- Coloque um rack de slides em um prato padrão de coloração de lâmina de microscópio e, em seguida, coloque as lâminas individualmente no rack. Adicionar fixador suficiente para cobrir as lâminas (2 - 4% de paraformaldeído em PBS ou OR2).
- Com um par de fórceps sem corte, empurre a lamela lateralmente, pegá-lo, e descartá-lo no lixo de vidro apropriado.Deixar lâminas no fixador durante pelo menos 15 - 30 min. Para hibridação in situ e manchas mais anticorpos, longos períodos de fixação (h ou d) são permitidas.
- Para remover o quadrado de plástico, lugar desliza um de cada vez em gelo frio OR2 ou PBS em um prato de coloração. Inserir uma lâmina afiada na extremidade da praça de plástico e soltá-la.
NOTA: O ideal é que o plástico vai sair de forma limpa, deixando toda a cera de parafina no slide. A cera serve uma finalidade útil: uma vez que rodeia a pequena área central em que o conteúdo nucleares estão associadas à corrediça, que actua como uma represa que permite que se trabalhe com volumes pequenos (5-10 ul) de reagentes para a imunocoloração, etc. Slides podem ser mantidos indefinidamente em OR2 frio ou PBS.
9. A imunocoloração de lbcs e organelas nucleares
- Retirar uma preparação GV fixo de armazenamento em OR2 ou PBS. Limpe o excesso de líquido e coloque em suportes em câmara úmida. A chamb convenienteer é um mm placa de Petri 90 x 15 contendo um círculo de 90 mm de papel de filtro húmido.
NOTA: Neste ponto os conteúdos nucleares estão firmemente ligado ao slide em uma 5 mm Área circular livre de cera de parafina. Uma vez que a cera é repelente de água, pode-se alterar soluções por adição e remoção de pequenos volumes de líquido para a borda da área central com uma pipeta de 20 mL. A principal precaução é para evitar tocar a área livre de cera com a ponta da pipeta. - Realizar imunocoloração com pequenos volumes (10 - 20 ul) de reagentes. Porque os cromossomos e organelas nucleares são muito pequenas e em contacto imediato com reagentes adicionados, protocolos de coloração pode ser curto. tempos de coloração de anticorpos primários e secundários podem ser tão curto quanto 1 hora ou menos. Não incluem detergente em qualquer etapa, pois isso provoca danos à preparação. Se desejado, a preparação manchar com DAPI (1 ug / ml) durante 10 - 20 minutos para acentuar os eixos dos lbcs.
- Mount em glicerol ou uma montagem comercialing meio adequado para imunofluorescência. Para evitar a captura de uma bolha de ar durante a etapa de montagem, proceder da seguinte forma.
- Retire 15 uL de meio de montagem para a ponta de uma pipeta de 20 mL. Remover o máximo de líquido possível da área imediatamente em torno da disseminação nuclear por "wicking"-a com um pedaço de papel de filtro (corte na forma de um triângulo muito fina de um círculo 90 mm de # 1 papel de filtro).
- Pipeta a maior parte do meio de montagem para a preparação, tomando cuidado para não tocar na área da expansão nuclear. Coloque o último 1 ml ou menos de meio de montagem no centro de uma lamela de 22 mm (espessura # 1.5). Inverta a lamela sobre a preparação e soltar cuidadosamente no lugar.
- Para montagens temporárias, até alguns dias, usar 1 mg / mL de f enilenodiamina em 50% de glicerol. Para montagens permanentes, especialmente para estudos SuperResolution, utilizar um meio de baixa fluorescência que endurece para um índice de refracção de cerca de 1,46.
10. fluorescente in situ fluorescente (FISH) de lbcs e organelas Nuclear
- Como os protocolos de FISH geralmente exigem um passo a temperatura elevada, remover a cera de parafina a partir da preparação. Cuidadosamente raspar com uma lâmina de barbear, e embora o processo é tedioso e pode conduzir a danos acidentais da preparação. É útil para marcar a área da preparação na parte posterior da lâmina com uma ponta de diamante.
- Como alternativa, dissolver a cera de parafina com xileno. Defina-se uma série de frascos ou pratos de coloração Coplin contendo: 30%, 50%, 70%, 95%, e 100% de etanol; 3 recipientes de xileno; mais 2 recipientes de etanol a 100% e uma acetona.
- Coloque os slides no suporte de slides e desidratar-los na série de etanol, deixando lâminas 3-5 minutos em cada concentração (tempos mais curtos se agitado).
- Dissolve-se a cera de parafina, passando as lâminas através dos 3 recipientes de xileno, cerca de 5 minutos cada um, se agitado. Remova oxileno por passagem através de dois etanóis 100%, e finalmente remover o etanol, com acetona. Tome os slides a partir de acetona e incliná-los para secar.
- Levar a cabo a hibridação in situ usando qualquer protocolo padrão. 15,16
11. O isolamento de um óleo sob GV
- Pegar um óvulo a partir da solução OR2 com uma pinça de joalheiro, incluindo tão pouco tecido circundante possível. Coloque o ovócito em um pequeno pedaço de # 1 papel de filtro. solução OR2 excesso irá transferir para o papel de filtro, deixando o ovócito quase livre de líquido. Pegar o oócito "seca" e colocá-lo sob a superfície de óleo de peso mineral leve (óleo de parafina) em uma pequena placa de Petri (35 x 10 mm).
- Com uma agulha de tungstênio fino ou um dente do fórceps, picar um pequeno buraco no oócito perto do pólo animais escuro. Pegar o ovócito com um par de fórceps (evitando as pontas) e aperte suavemente. O GV vai extrudir juntamente com uma menor ou LArger quantidade de gema na sua superfície (Figura 3).
- Remover o máximo possível de gema varrendo suavemente GV com o lado das pinças. Na maioria dos casos, será difícil remover todo da gema. No entanto, para a maioria dos fins de uma pequena quantidade de gema não é um problema.
- Para observar o conteúdo GV, achatar a GV em maior ou menor grau.
- Remova o quadrado de plástico de um slide bem e usar a cera de parafina restante como um receptáculo raso por óleo de parafina. 10 Pick up the GV juntamente com óleo de parafina em uma pipeta de 20 mL e transferir para o centro da área de parafina. Adicionar uma lamela e observe o conteúdo do GV parcialmente achatada. Esta técnica não danificar os lbcs.
- Alternativamente, achatar a GV a aproximadamente 10 m de espessura para a observação de organelas nucleares.
- Corte as finais 1 mm de uma ponta de pipeta de plástico com uma lâmina afiada. Sugar o GV para oponta, juntamente com exatamente 5 mL de óleo mineral. Extrude GV e todo o óleo para o centro de uma lamela de vidro de 22 mm.
- Reduzir um slide 3 "x 1" de vidro padrão lentamente até tocar a gota de óleo. A lamela gota e será levantada por capilaridade e o óleo se espalhar para os bordos da lamela. Quando a queda de se espalhou completamente, o óleo será de aproximadamente 10 mm de espessura. Os lbcs será danificado e grandes nucléolos será ligeiramente comprimida, mas a maioria das organelas nucleares menores aparece mais ou menos como elas existem no GV intacta (Figura 3).
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Representative Results
Para examinar os cromossomos lampbrush gigantes começa isolando oócitos de uma rã ou salamandra. A Figura 1 mostra um grupo de oócitos maduros em uma solução salina tamponada, após remoção a partir do ovário da rã, Xenopus. Tais oócitos permanecem em boas condições para dias à temperatura ambiente. O núcleo (ou vesícula germinal) é então removido a partir de um ovócito com um fórceps de joalheiro, quer numa solução salina (Figura 2) ou em óleo (Figura 3). O conteúdo nuclear de um núcleo isolado de óleo pode ser examinado por esmagar delicadamente o núcleo e de observação, contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Para examinar o conteúdo de um núcleo que tem sido isolado de uma solução salina, deve-se primeiro retirar o envelope nuclear com uma pinça de joalheiro e permitir que o conteúdo para assentar sobre uma lâmina de microscópio. A preparação é então centrifugada para anexar tele cromossomas firmemente à corrediça, após o que os cromossomas podem ser coradas com um anticorpo (Figura 4) ou sujeitos a hibridação in situ. Os cromossomos lampbrush de salamandras são muito maiores do que os dos sapos (Figura 5). Em ambos os casos, as unidades de transcrição individuais (genes) podem ser vistos como laçadas de cromatina que se projectam lateralmente a partir do eixo cromossoma.
Figura 1: oócitos maduros a partir do X. tropicalis Frog. O ovário de uma rã fêmea madura contém milhares de oócitos em diferentes estágios de maturação. O menor é o tamanho das células somáticas e já atingiram prófase da primeira divisão meiótica. À medida que o oócito cresce, ele acumula gradualmente gema, que fornece à célula uma aparência branca opaca. O maior matoócitos Ure, mostradas aqui, adquirir uma tampa mais escura, devido à acumulação de pigmento melanina. Os maiores ovócitos de X. tropicalis são cerca de 0,8 mm de diâmetro, aqueles de X. laevis de cerca de 1,4 mm, enquanto que as do axolotl são um enorme 2,2 mm. Excepto para o tamanho, todos os três são semelhantes na aparência geral. Escala da barra = 1 mm.
Figura 2: A remoção do GV a partir de um óvulo de X. tropicalis. Esquerda. Um pequeno buraco foi feito com uma pinça de joalheiro no pólo animais mais escuro de um ovócito e do GV foi gentilmente extrudado. Neste exemplo, o GV estava quase livre de gema de como ele saiu do oócito. gema aderente pode ser removido por sucção o GV dentro e para fora de uma pipeta de ponta com um diâmetro apenas ligeiramente superior ao diâmetro da própria GV. Certo. Três GVs de X. tropicalis. Estes GVs foram deixados alguns minutos em um (solução GV isolamento ajustado a pH 5,8) ligeiramente ácido meio, o que faz com que o envelope nuclear a inchar de distância a partir do conteúdo nucleares gelificados. GVs tratados desta forma não vai se espalhar para exame citológico. No entanto, tais GVs são ideais para análise molecular: o envelope pode ser removido com uma pinça joalheiro, proporcionando uma amostra de conteúdo nucleares completamente livres de contaminação citoplasmática. 17,18 Barra de escala = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: GV de X. tropicalis isoladas no óleo. Esquerda. Depois de um pequeno furo foi feito no oócito perto do po animais escurole, o GV começou a extrudir. Neste caso, o GV saiu com quase nenhuma gema aderente. Meio. O GV está agora completamente livre do citoplasma do oócito. Tais GVs continuar a transcrever ARN por hora. Certo. Após o GV é suavemente esmagadas em óleo sob uma lamela, organelas nucleares podem ser vistos por DIC, como mostrado aqui, ou por contraste de fase. Toda a GV é muito maior do que a pequena área mostrada aqui. HLB = corpo histona lugar com três manchas em sua superfície. Barra de escala = 0,5 mm para os dois primeiros painéis, 10 mm para o terceiro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: lampbrush Chromosomes (lbcs) do Axolotl A. mexicanum. Esquerda. Certo. A mesma preparação visto pela iluminação de campo escuro. Agora pode-se ver as inúmeras nucléolo amplificados não coradas. Barra de escala = 250 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A LBC single do Axolotl A. mexicanum e os tropicalis sapo X., com a mesma ampliação. Estas imagens ilustram a diferença de tamanho extrema entre lbcs de uma salamandra e uma rã (inserção). O tamanho difece se correlaciona com o conteúdo de DNA total dos genomas (cerca de 30 libras esterlinas para A. mexicanum vs 1,7 libras para X. tropicalis). alças laterais individuais (unidades de transcrição) são também muito mais tempo na salamandra do que no sapo. Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As primeiras observações de lbcs "vivos" de GVs isolado mão de rãs e salamandras foram feitas quase 80 anos pelo biólogo norte-americano William Duryee, 19 antes da introdução de contraste de fase e microscopia DIC, antes de imuno fluorescente, e antes de FISH. As vantagens de lbcs para investigar detalhes da estrutura dos cromossomas e transcrição ao nível do gene indivíduo necessário desenvolvimento de técnicas para prender os lbcs para lâminas de vidro, para corrigi-los de uma forma realista, e aplicar técnicas moleculares sem destruir sua morfologia básica. Quase todas as técnicas para atingir esses objetivos exige alguma adaptação às espécies sob investigação e algum compromisso entre a preservação natural e caracterização molecular. Por exemplo, a GVS e lbcs de anfíbios atados são excepcionalmente fácil de trabalhar por causa do seu enorme tamanho e a facilidade com que o conteúdo GV dispersar no meio adequado. vocêté recentemente, no entanto, muito pouco se sabia sobre as suas genômica, o que torna difícil relacionar a riqueza de características citológicas com detalhes moleculares. Por outro lado, lbcs de Xenopus são bastante pequenos em comparação com aqueles dos anfíbios cauda (Figura 5), mas os genomas de ambas X. tropicalis e X. laevis foram sequenciados e são razoavelmente bem anotada.
Para aqueles que utilizam primeiro GVs de anfíbios, o maior desafio será o de isolar o GV e retire o envelope nuclear sem danificar as lbcs. Até o momento, ninguém descobriu uma maneira de remover o envelope excepto à mão com uma pinça de joalheiro. Seria um grande avanço técnico se uma maneira foram encontrados para "dissolver" ou "digerir" o envelope, mas deixam os cromossomas e outros organelos nucleares intactos. Uma tal técnica poderia ser igualmente útil para estudos moleculares. Em nossas investigações sobre RNA nuclear e citoplasmática descobrimos que é essencial pararemover o envelope nuclear antes da análise de ARN nucleares (Figura 2). 17,18 Se o envelope não for removido, a pequena quantidade de RNA nuclear é oprimido por contaminar RNA citoplasmático que adere ao exterior do envelope.
Outra grande melhoria seria descoberta de alguma forma para anexar lbcs mais firmemente a uma lâmina de microscópio. A centrifugação da preparação é crítico, mas, mesmo prolongado centrifugação (1 h a 4500 xg), não permite anexo. Pode-se geralmente dizer quando lbcs estão bem ligados, examinando-as com contraste de fase sob ampliação média. Bem-inscritos cromossomos mostram nenhum movimento browniano em tudo. Se qualquer movimento Browniano das alças é detectável, imunocoloração ou peixe protocolos subsequentes irá levar a danos ou perda de material extensa.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µL) | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
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