Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل

Published: July 3, 2016 doi: 10.3791/54119
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

نقدم بروتوكول للتقييم الوظيفي للمكتبات موقع واحد التشبع الطفرات شاملة من البروتينات باستخدام الإنتاجية العالية التسلسل. الأهم من ذلك، يستخدم هذا النهج أزواج التمهيدي متعامدة مع تعدد بناء مكتبة والتسلسل. وتقدم ممثل النتائج باستخدام تيم-1 β-اكتاماز المختارة في جرعة ذات الصلة سريريا من الأمبيسلين.

Introduction

منذ فترة طويلة استخدمت الطفرات في المختبر لدراسة خصائص النظم البيولوجية وتطورها، وإلى إنتاج بروتينات متحولة أو الكائنات الحية مع وظائف محسنة أو جديدة. في حين اعتمدت النهج في وقت مبكر على الطرق التي تنتج الطفرات العشوائية في الكائنات الحية، وظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف تمكين الباحثين إلى إدخال تغييرات محددة على الحمض النووي بطريقة مواقع محددة، أي، الطفرات موقع الموجه 1،2. مع التقنيات الحالية، وعادة ما تستخدم أليغنوكليوتيد مطفرة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، فمن سطحي نسبيا لإنشاء وتقييم أعداد صغيرة من الطفرات (على سبيل المثال، الطفرات نقطة) في جين معين 3،4. ومن أصعب بكثير ولكن عند اقتراب الهدف، على سبيل المثال، إنشاء وتقييم كل شيء ممكن في موقع واحد (أو أكثر حسب الطلب) الطفرات.

في حين عرف الكثير من الدراسات في وقت مبكر محاولة لتقييم أعداد كبيرة من مكانت utations في الجينات التقنيات المستخدمة في كثير من الأحيان شاقة، على سبيل المثال تتطلب تقييم كل طفرة بشكل مستقل باستخدام هراء القامع سلالات 5-7، أو كانت محدودة في قدرتها الكمية نظرا لانخفاض عمق تسلسل سانجر تسلسل 8. وإلى حد كبير محل التقنيات المستخدمة في هذه الدراسات من قبل وسائل الاستفادة من الإنتاجية العالية التكنولوجيا التسلسل 9-12. هذه الطرق بسيطة من الناحية النظرية يؤدي الى ظهور مكتبة تضم عددا كبيرا من الطفرات، إخضاع المكتبة إلى الشاشة أو اختيار وظيفة، ثم أعماق تسلسل (أي، بناء على أمر من> 10 6 التسلسل يقرأ) حصلت المكتبة قبل و بعد الاختيار. في هذه الطريقة، والمظهرية أو الملاءمة آثار عدد كبير من الطفرات، ممثلة على النحو التغيير في تردد السكان في كل متحولة، يمكن تقييمها في وقت واحد وأكثر من الكمية.

قدمنا ​​سابقا المبسطة(. أي كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات) نهج جنيه لتقييم المكتبات من جميع الطفرات الأحماض الأمينية واحدة محتملة في البروتينات، التي تنطبق على الجينات مع طول أطول من التسلسل قراءة طول 11،13: أولا، كل موقف الأحماض الأمينية غير العشوائية بواسطة الموقع الموجه للطفرات PCR. وخلال هذه العملية، يتم تقسيم الجينات في مجموعات مكونة من مواقع متجاورة بطول إجمالي استيعابها عن طريق المنصة التسلسل. المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل مجموعة ثم يتم الجمع، وكل مجموعة تعرض بشكل مستقل لاختيار والتسلسل الإنتاجية العالية. من خلال المحافظة على المراسلات بين موقع الطفرات في تسلسل وطول تسلسل القراءة، وهذا النهج في الاستفادة من زيادة عمق التسلسل: في حين يمكن للمرء أن مجرد تسلسل هذه المكتبات في ويندوز قصيرة دون تقسيم إلى مجموعات (على سبيل المثال، عن طريق بندقية القياسية. نهج التسلسل)، فإن معظم القراءات التي تم الحصول عليها سيكون من النوع البري، وبالتالي مajority من الإنتاجية تسلسل يضيع (على سبيل المثال، لمكتبة التشبع الطفرات كامل البروتين من بروتين حمض أميني 500 التسلسل في 100 حمض أميني (300 بي بي) ويندوز، في الحد الأدنى 80٪ من يقرأ ستكون من النوع البري تسلسل).

هنا، يتم تقديم البروتوكول الذي يستخدم الإنتاجية العالية التسلسل لتقييم وظيفي من كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات، وذلك باستخدام النهج المذكور أعلاه (الموضحة في الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن نقدم استخدام بادئات المتعامدة في عملية الاستنساخ من المكتبة لالباركود كل مجموعة التسلسل، والذي يسمح لها أن تكون المضاعفة في مكتبة واحدة، تخضع في نفس الوقت لفحص أو اختيار، ومن ثم إزالة المضاعفة لتسلسل عميق. منذ لا يتم إخضاع الجماعات تسلسل لاختيار مستقل، وهذا يقلل من عبء العمل ويضمن أن كل طفرة يواجه نفس المستوى من الاختيار. تيم-1 β-اكتاماز، وهو الانزيم الذي يمنح مقاومة رفيع المستوى لوتستخدم المضادات الحيوية β لاكتام (على سبيل المثال، الأمبيسلين) في البكتيريا كنظام نموذج 14-16. يوصف بروتوكول لتقييم مكتبة الطفرات تشبع كامل البروتين من تيم-1 في E. القولونية تحت الاختيار في مستوى مصل تقريبي لجرعة سريرية من الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) 17،18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لمخطط من البروتوكول. تتطلب عدة خطوات والكواشف في البروتوكول تدابير السلامة (المشار إليها ب "تنبيه"). استشارة بيانات سلامة المواد قبل استخدامها. يتم تنفيذ كافة الخطوات بروتوكول في RT ما لم يرد البعض.

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام ولوحات

  1. إعداد وتعقيم بواسطة التعقيم 1 لتر الماء النقي، 100 مل سوبر الأمثل مرق (SOB، الجدول 1)، 1 لتر لوريا، Bertani مرق (LB، الجدول 2) و 1 L LB أجار (الجدول 3). إعداد بشكل منفصل وتعقيم ثلاث قوارير الثقافة تحتوي كل منها على 1 لتر LB.
    ملاحظة: طوال يشير البروتوكول "المياه" لتعقيم تعقيم المياه النقية. SOB، LB وLB أجار الرجوع إلى حلول تعقيم الأوتوكلاف.
  2. إعداد 12 ملغ / مل الأسهم من تيت بحل 0.12 غرام التتراسيكلين هيدروكلوريد في 10 مل من الايثانول 70٪. تعقيم باستخدام فلتر 0.2 ميكرون وتخزينهافي 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  3. بارد LB أجار إلى 50 درجة مئوية ثم قم بإضافة 1 مل من الأسهم تيت (تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل تيت). تصب في لوحات بتري وبارد في RT محمية من الضوء. تخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.

2. بناء الجامع الجينات التشبع الطفرات مكتبة

ملاحظة: الاشعال. تقارير إنجاز المشروعات المنجزة، هضم تقييد وعملية ربط. وعينات من الحمض النووي النقاء يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

  1. تصميم الاشعال الطفرات
    1. لmutagenize كل موقف الأحماض الأمينية إلى جميع الأحماض الأمينية الممكنة، وتصميم زوج من الاشعال الطفرات التكميلية (معنى / إلى الأمام والعقاقير / عكس) لكل موقف الأحماض الأمينية مع الإرشادات التالية:
      1. استبدال كودون المقابلة لالأحماض الأمينية إلى أن mutagenized التي كتبها كالة أنباء البحرية (حيث N هو خليط من كل القواعد النوكليوتيدات أربعة وS هو خليط من السيتوزين (C) والجوانين (G)) ومركز في متزمتإيه، ويحيط بها ما يقرب من 15 النيوكليوتيدات على كل جانب.
      2. ضمان 5 'و 3' تنتهي تنتهي في C أو G وأن درجة حرارة انصهار (T م) حوالي 70 درجة مئوية 3. استخدام NNS_PrimerDesign.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) لتصميم كالة أنباء البحرية الاشعال الطفرات وفقا لهذه المبادئ التوجيهية.
    2. الاشعال أمر من مصدر تجاري. لسهولة الاستخدام، ومنهم تصنيعه في شكل لوحة 96-جيدا وقبل المخفف في الماء إلى 50 ميكرومتر، مع مجموعة واحدة من لوحات تحتوي على الاشعال الطفرات معنى وآخر الاشعال العقاقير.
    3. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 95 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. تمييع الاشعال 20 أضعاف لتصل إلى 2.5 ميكرومتر باستخدام ماصة الأقنية لنقل 5 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء.
    4. كرربروتوكول خطوة 2.1.3 لتخفيف الاشعال العقاقير الطفرات.
  2. توليف كالة أنباء البحرية مكتبات فرعية لكل موقف الأحماض الأمينية بخطوة اثنين PCR الطفرات موقع الموجه
    1. إجراء الجولة الأولى تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل التمهيدي الطفرات، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام pBR322_AvrII البلازميد كقالب والاشعال AatII_F أو AvrII_R (الاشعال الشعور الطفرات يقترن التمهيدي AvrII_R، والعقاقير الاشعال الطفرات يقترن التمهيدي AatII_F، ما مجموعه 526 تقارير إنجاز المشروعات). انظر جدول المواد للAatII_F وAvrII_R متواليات.
      1. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 4 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 15 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 10 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك طن لوحات PCR.
      2. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة.
      3. نقل لوحات PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. كرر الخطوات بروتوكول 2.2.1.1 - 2.2.1.3 لوحات 96-جيدا تحتوي على المخفف الاشعال الطفرات العقاقير.
    2. إجراء الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة. لكل وظيفة من الأحماض الأمينية، وإعداد 25 ميكرولتر تفاعل PCR باستخدام بادئات AatII_F وAvrII_R، ومختلطة والمخففة الجولة الاولى المنتجات PCR مطفرة كقالب (ما مجموعه 263 تقارير إنجاز المشروعات).
      1. ملء حوض ماصة مع المياه واستخدام ماصة الأقنية لنقل 198 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا.
      2. الجمع بين وتمييع 100 أضعاف المنتجات PCR تسبب الطفرات الوراثية لكل موقف الأحماض الأمينية باستخدام ماصة الأقنية لنقل الأول 1 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR التي تحتوي على منتجات PCR الناتجة عن الاشعال الشعور الطفرات إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات تحتوي على الماء. ثم كرر نقل للمنتجات PCR الناتجة عن الاشعال العقاقير الطفرات.
      3. إعداد PCR "مزيج الرئيسي" عن طريق إضافة الكواشف من الجدول رقم 5 لأنبوب مخروطي 15 مل. نقل إلى حوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 24 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا PCR. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من لوحات 96-جيدا تحتوي على المختلط والمخففة في الدور الاول من المنتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك في لوحات PCR.
      4. تغطية كل لوحة PCR مع 96 جيدا ختم اللوحة. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 200 x ج لمدة 2 دقيقة. لوحات نقل إلى thermocycler وتشغيل نفس البرنامج كما في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
    3. تحليل نتائج الجولة الثانية من تقارير إنجاز المشروعات مطفرة من قبل الكهربائي للهلام.التأكد من أن جميع المنتجات هي من الحجم الصحيح وتغيب تلوث المنتجات.
      1. إضافة 2 مل من 2X صبغ هلام تحميل لحوض ماصة ثم استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر إلى 263 بئرا خلال ثلاث لوحات 96-جيدا. استخدام ماصة الأقنية لنقل 6 ميكرولتر من 96-جيدا لوحات PCR يحتوي على الجولة الثانية من منتجات PCR مطفرة إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات 96-جيدا تحتوي على صبغة.
      2. إعداد agarose هلام 1.5٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. تحميل سلم الحمض النووي في الممرات الأولى والأخيرة من كل صف. ثم استخدام ماصة الأقنية لتحميل 10 ميكرولتر من عينات من البروتوكول خطوة 2.2.3.1.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 40 دقيقة وصورة على نقل transilluminator للأشعة فوق البنفسجية.
      5. كرر الخطوات من بروتوكول 2.2.3.2 - 2.2.3.4 حتى يتم تحليل جميع العينات.
    4. بدقة قياس تركيز كل منتج PCR كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
      1. تحويلحوالي 15 مل EB عازلة لحوض ماصة. استخدام ماصة الأقنية لنقل 49 ميكرولتر إلى 263 بئرا أكثر من ثلاثة، واضحة لوحات فحص أسفل السوداء الجدران 96-جيدا.
      2. استخدام ماصة الأقنية لنقل 1 ميكرولتر من كل خطوة الثانية المنتج PCR (بروتوكول خطوة 2.2.2) إلى الآبار وما شابه ذلك من لوحات فحص 96-جيدا.
      3. إعداد المنحنى القياسي تركيز الحمض النووي عن طريق تمييع امدا فج الحمض النووي ل2 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن EB 300 ميكرولتر ثم جعل عشرة التخفيفات شقين (لمجموعه 11 تركيزات). نقل 50 ميكرولتر إلى أحد عشر الأعمدة الأولى من صف واحد من لوحات 96-جيدا فحص من الخطوة السابقة والتي لا تحتوي على عينة. إلى العمود الثاني عشر إضافة 50 ميكرولتر من العازلة EB (الكاشف فارغة).
      4. إعداد dsDNA الكميات كاشف عن طريق إضافة 75 ميكرولتر من كاشف (انظر الجدول المواد) إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، ثم إضافة 15 مل من العازلة EB. مزيج من قبل قلب أنبوب، ثم نقل إلى حوض ماصة. حماية كاشف عن الضوء.
      5. استخدام ماصة الأقنية لنقل 50 ميكرولتر من استعداد dsDNA الكميات الكاشف إلى كل بئر من لوحات الفحص. مزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا. احتضان لوحات في RT لمدة 5 دقائق محمية من الضوء.
      6. قياس مضان من كل عينة باستخدام قارئ صفيحة وموجات فلوريسئين القياسية (الإثارة 485 نانومتر، وانبعاث 520 نانومتر؛ 0.1 ثانية).
      7. طرح قيمة مضان من الفراغ كاشف من جميع العينات. توليد منحنى قياسي من قياسات مضان من العينات لامدا فج. حساب تركيز كل عينة باستخدام القياسات مضان منها والمنحنى القياسي.
  3. استنساخ كالة أنباء البحرية المكتبات الفرعية في ناقلات اختيار
    1. مزيج 100 نانوغرام لكل كالة أنباء البحرية مكتبة فرعية المنتج PCR إلى خمس مجموعات فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام سالحمض النووي الكميات كاشف.
      ملاحظة: وتتكون كل مجموعة من حوالي 53 وظائف الأحماض الأمينية متجاورة متباعدة على طول تسلسل تيم-1 (مجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية المكتبة 1-5 وتتألف من المناصب 26-78، 79-132، 133-183، 184-236، و 237-290، على التوالي؛ عددهم وفقا الى Ambler وآخرون 19).
    2. إنشاء استنساخ ناقلات لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
      1. إعداد خمسة 100 تقارير إتمام المشروعات ميكرولتر وفقا للجدول رقم 6، باستخدام بادئات AvrII_F وAatII_OP1_R - AatII_OP5_R، والبلازميدات pBR322_OP1-5 كقالب (AatII_OP1_R يقترن pBR322_OP1، وما إلى ذلك).
      2. نقل إلى thermocycler وتشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 25 دورة: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية. انظر T قادرة المواد لمتواليات من AatII_R وAvrII_F.
      3. إعداد agarose هلام 1٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      4. إضافة 20 ميكرولتر من 6X صبغ هلام تحميل لكل عينة PCR. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم كل عينة، تخطي واحدة على الأقل بشكل جيد بين العينات.
      5. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة.
      6. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). شرائح المكوس التي تحتوي على المنتج PCR في ~ 3500 سنة مضت. نقل لفصل أنابيب microfuge. ويمكن تخزين شرائح جل في -20 درجة مئوية.
      7. اتباع الإرشادات الصانعين، تنقية العينات باستخدام مجموعة استخراج الهلام وتركيز قياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
    3. لكل من المجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة (بروتوكول خطوة 2.3.1) وناقلات الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3.2)، إعداد تقييد هضم مع AatII وAvrII الانزيمات وفقا لT قادرة 7 احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنظيف العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي ومن ثم قياس تركيز باستخدام quantita dsDNAنشوئها كاشف.
    4. إعداد ردود الفعل ربط التالية الجدول 8 لكل مجموعة فرعية مكتبة هضم تقييد كالة أنباء البحرية مع المشابهة هضم تقييد استنساخ ناقلات (NNS مجموعة فرعية مكتبة 1 مع pBR322_OP1، وما إلى ذلك). في احتضان RT لمدة 1 ساعة. تنظيف ردود الفعل باستخدام طقم تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أزل الحمض النووي مع 20 ميكرولتر من الماء.
    5. تحويل مجمل ردود الفعل ربط النقاء إلى كفاءة في استخدام مكتبة E. خلايا القولونية التي كتبها Electroporation لل.
      1. ذوبان electrocompetent E. خلايا القولونية ثم خلايا مكان وردود الفعل ربط النقاء على الجليد.
      2. نقل 10 ميكرولتر إذابة الخلايا لكل رد فعل ربط تنقيته ثم نقل إلى كوفيت Electroporation لل. Electroporate عند 1.8 كيلو فولت.
      3. استعادة الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 1 مل SOB. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
      4. و resuspend 10 ميكرولتر من كل ثقافة الانتعاش في 990 ميكرولتر LB. نشر 100 ميكرولتر على LB أجار لوحات جontaining 12 ميكروغرام / مل تيت. احتضان لوحات O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
      5. لكل ثقافة الانتعاش، وإعداد ثقافة قارورة 250 مل مع 50 مل LB و 50 سهم تيت ميكرولتر. نقل إلى قارورة المتبقية ~ 1 مل من ثقافة الانتعاش. احتضان O / N (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (~ 200 دورة في الدقيقة).
    6. حساب عدد من المستعمرات في كل لوحة. احسب عدد transformants ناجحة المعادلة 1 ، أين المعادلة 2 هو عدد المستعمرات، المعادلة 3 هو حجم الثقافة الاسترداد (1000 ميكرولتر) و المعادلة 4 هو حجم الثقافة الانتعاش مطلي (1 ميكرولتر).
      ملاحظة: لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات، وكقاعدة عامة يجب أن يكون عدد من transformants ناجحة ≥100 أضعاف خلال عدد من الطفرات المتوقعة. كل الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية لديها ~ 53 وظائف، وبالتالي فإن العدد المتوقع من الطفرات هو 53 وظائف × 32 الكودونات / موقف ≈ 1.7 × 10 3؛ لإعطاء حجم مكتبة ≥100 أضعاف (≥1.7 × 10 5) ينبغي أن يكون هناك ≥170 المستعمرات في كل لوحة.
    7. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من ثقافات باستخدام طقم تنقية البلازميد ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA. مزيج معا 100 نانوغرام لكل البلازميد. وهذا يخلق كامل البروتين مكتبة التشبع الطفرات النهائية.

3. اختيار من تيم-1 كامل البروتين التشبع الطفرات مكتبة لمقاومة المضادات الحيوية

  1. إعداد ثقافة الاختيار.
    1. تمييع البلازميد من البروتوكول خطوة 2.3.7 إلى 0.5 نانوغرام / ميكرولتر في الماء ونقل 20 ميكرولتر إلى أنبوب microcentrifuge. أداء التحول، وإعادةcovery، والطلاء ويا النمو / N كما هو موضح سابقا في بروتوكول خطوة 2.3.5، باستثناء نقل 1 ميكرولتر من ثقافة الانتعاش SOB إلى 999 LB. ميكرولتر
    2. حساب عدد من المستعمرات. لضمان تغطية كاملة لجميع الطفرات يجب أن يكون هناك ≥100 المستعمرات، مشيرا إلى ≥10 6 transformants الناجحة (100 × 263 × 32 وظائف الكودونات / موقف ≈ 10 6).
    3. قياس تركيز 50 مل O ثقافة / N.
      1. إعداد فارغة LB بإضافة 1 مل LB إلى كفيت معمل. قياس OD600 على معمل.
      2. تمييع O / N الثقافة 10 ضعفا عن طريق إعادة التعليق 100 ميكرولتر في 900 LB. ميكرولتر قياس OD600. طرح القراءة OD600 من الفراغ وضرب من قبل 10 لإعطاء OD600 من O / N الثقافة.
    4. قبل تسخين قوارير الثقافة ثلاثة من البروتوكول خطوة 1.1 ل~ 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمييع O / N الثقافة إلى OD600 = 0.1 وإضافة 1 مل إلى قارورة واحدة (OD600 النهائي = 0.001). تله هو "ثقافة الاختيار".
    5. احتضان "ثقافة الاختيار" عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة دورية النمو عن طريق قياس OD600 كما هو الحال في البروتوكول خطوة 3.1.3 (ليس من الضروري لتمييع الثقافة 10 أضعاف) حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة).
    6. نقل 100 مل من ثقافة الاختيار لاثنين من أنابيب مخروطية 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. اختيار المقاومة الأمبيسلين.
    1. في حين ثقافة الاختيار ويحتضنها، وإعداد 50 ملغ الأسهم / مل من الأمبير في المياه عن طريق إذابة 0.5 غرام الأمبيسلين الصوديوم في 10 مل من الماء. تعقيم باستخدام 0.2 ميكرون تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. لاثنين من قوارير أخرى، إضافة تيت إلى تركيز النهائي من 12 ميكروغرام / مل وحجم الاختيار ثقافة هذا ثا ر OD600 النهائي = 0.001. لقارورة واحدة، إضافة 1 مل أمبير، لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل - وهذا هو "ثقافة الاختيار".
    3. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية مع قوية تهز (200 دورة في الدقيقة). مراقبة نمو ثقافة التي تم إضافتها لا الأمبيسلين في الخطوة السابقة، حتى OD600 = 0.1 (~ 2.5 ساعة). في هذا الوقت، وأيضا قياس OD600 من ثقافة الاختيار.
    4. تقسيم OD600 الثقافة التحديد إلى 0.1 وضرب من قبل 100 مل. نقل هذا المجلد (~ 400 مل) إلى 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة معظم طاف والجمع في واحد 15 أنبوب مخروطي الشكل. كرر الطرد المركزي وإزالة جميع طاف.
    5. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، عزل DNA البلازميد من الاختيار (بروتوكول خطوة 3.1.6) واختيار (بروتوكول خطوة 3.2.4) الكريات خلية الثقافة ومن ثم قياس تركيزات باستخدام الكميات كاشف dsDNA.
TLE "> 4. عالية الإنتاجية تسلسل لتحديد آثار اللياقة البدنية من الطفرات

  1. إعداد عينات للتسلسل عالية الإنتاجية
    1. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر للتخلص من تعدد الجماعات كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة مع الاشعال المتعامدة
      1. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9؛ نقل 23 ميكرولتر إلى عشرة أنابيب PCR.
      2. إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر النقي DNA البلازميد من ثقافة الاختيار لPCR أنابيب 1-5 ومن ثقافة الاختيار لأنابيب 6-10.
      3. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر إلى الأمام الاشعال المتعامدة OP1_F - OP5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال المتعامدة OP1_R - OP5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر إلى أنابيب PCR 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل OP1_F - OP5_F وOP1_R - OP5_R.
      4. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 20 دورات: 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 °؛ مئوية لمدة 20 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. عقد في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر لعزل كل من مجموعات مكتبة فرعية كالة أنباء البحرية
      1. تمييع 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.1.4 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. مزيج معا 50 ميكرولتر من 50 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام Group1_F - Group5_F مع فيما يخصه عكس الاشعال Group1_R - Group5_R. في نفس النظام، ونقل 1 ميكرولتر PCR أنابيب 1-5 و 6 - 10. انظر جدول المواد للتسلسل Group1_F - Group5_F وGroup1_R - Group5_R.
      3. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR. نقل أنابيب PCR لthermocycler. تشغيل البرنامج نفسه كما هو الحال في البروتوكول خطوة 2.2.1.3.
    3. تنفيذ النهائية 25 تقارير إنجاز المشروعات ميكرولتر إضافة تسلسل الفهرسة
      1. ديالعود 100 أضعاف تقارير إنجاز المشروعات عشر من البروتوكول خطوة 4.1.2.3 عن طريق نقل 1 ميكرولتر من كل فصل أنابيب PCR وإضافة 99 ميكرولتر من الماء. المزيج، ثم ماصة من 99 ميكرولتر وتجاهل.
      2. إعداد مزيج الرئيسي PCR وفقا للجدول 9، ونقل 23 ميكرولتر إلى كل أنبوب PCR.
      3. لأنابيب مع قالب القادمة من المجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية 1-5، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب الاشعال إلى الأمام 501_F - 505_F على التوالي. لأنابيب مع قالب الناجمة عن الاختيار والانتقاء الثقافات، ونقل 0.5 ميكرولتر في أنبوب عكس الاشعال 701_R و702_R، على التوالي. انظر جدول المواد للتسلسل 501_F - 505_F، و701_R و702_R.
      4. نقل أنابيب PCR إلى thermocycler وتشغيل البرنامج من الخطوة 2.2.1.3.
    4. خلط وتنقية عينات
      1. تركيزات القياس باستخدام الكميات كاشف dsDNA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. مزيج 100 نانوغرام لكل كثافة المنتج PCRالزراعة العضوية أنبوب microcentrifuge واحد.
      2. إعداد agarose هلام 2٪ مع 0.2 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (تنبيه).
      3. إضافة 6X صبغ هلام تحميل لالمختلطة PCR المنتجات عينة. تحميل المسار الأول من الجل مع سلم الحمض النووي. تحميل كامل حجم العينة.
      4. تشغيل هلام في 100 فولت لمدة 50 دقيقة. تصور هلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية إضاءة طويلة الطول الموجي (تنبيه). المكوس شريحة تحتوي على المنتج PCR في ~ 360 نقطة أساس. نقل إلى microfuge أنبوب. هلام شريحة يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
      5. بعد تعليمات الشركة الصانعة، وتنقية العينة باستخدام مجموعة استخراج الهلام وقياس تركيز باستخدام الكميات كاشف dsDNA. هذه هي العينة النهائية لتسلسل عالية الإنتاجية.
    5. تسلسل على منصة التسلسل الإنتاجية العالية (انظر جدول المواد للمنصة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. حساب تركيز العينة في نانومتر كما المعادلة 5 هو تركيز العينة في نانوغرام / ميكرولتر و المعادلة 7 هو طول سلسلة من عينة من الحمض النووي (~ 360 سنة مضت). تمييع العينة إلى 4 نانومتر في المخزن EB.
      2. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لتفسد العينة وتضعف إلى 21:00 في المخزن التهجين.
      3. تحميل 600 ميكرولتر من العينة إلى خرطوشة كاشف. التسلسل التالي تعليمات الشركة الصانعة والمطالبات التي تظهر على الشاشة.
  2. تحليل تسلسل البيانات
    1. تحميل فلاش (سريع طول تعديل قصيرة قراءة) 20، وضع في مجلد مع الملفات fastq.gz تم الحصول عليها من التسلسل.
    2. استخدام فلاش للانضمام الى ملفات fastq.gz المقابلة لنهاية يقترن يقرأ لكل زوج من المؤشرات (إلى الأمام وعكس يقرأ في كل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية للالاختيار والانتقاء الثقافات). افتح موجه الأوامر وتغيير الدليل إلى مجلد في البروتوكول خطوة 4.2.1. تاريخ كل زوج من يقرأ باستخدام الأوامر: فلاش <mates1.fastq.gz> <mates2.fastq.gz>، حيث mates1.fastq.gz وmates2.fastq.gz هي الملفات التي تحتوي على الأمام وعكس يقرأ، على التوالي.
  3. بعد انضمام كل زوج من يقرأ، ووضع ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq في مجلدات منفصلة عن النتائج من الاختيار أو التحديد الثقافات. إعادة تسمية ملف الإخراج out.extendedFrags.fastq وفقا لمجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية التي كان مطابقا (أي، 1.fastq، 2.fastq، وما إلى ذلك).
  4. تشغيل NNS_DataAnalyzer.m النصي الحاسوبية (انظر الرمز التكميلي ملف) من كل مجلد لحساب التهم لكل طفرة حمض أميني واحد، والتهم لمن النوع البري، لكل مجموعة فرعية مكتبة كالة أنباء البحرية.
  5. حساب تأثير اللياقة البدنية المعادلة 8 كل طفرة معادلة 10 كقاعدة عشرة وغاريتم نسبة من التهم التي تم الحصول عليها في اختيار ( معادلة 11 ) مقابل الاختيار ( معادلة 12 ) حالة، نسبة إلى البرية من نوع:
    معادلة 13 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر - (pBR322_OP5 pBR322_OP1) في الشكل 2A خريطة البلازميد لخمسة البلازميدات pBR322 المعدلة تحتوي على مواقع فتيلة المتعامدة. لاختبار ما إذا الاشعال المتعامدة محددة، أجريت تقارير إتمام المشروعات باستخدام كل زوج من الاشعال المتعامدة على حدة، جنبا إلى جنب مع جميع البلازميدات pBR322_OP1-5 خمسة، أو مع كل البلازميدات ناقص البلازميد مطابقة الزوج التمهيدي متعامد. تم الحصول على المنتج الصحيح فقط عندما أدرج البلازميد مطابقة، وحصلت أي منتج من أي حجم في غيابها (الشكل 2B).

تم إجراء التجربة التمثيلية التالية بروتوكول وصفها في هذا النص (الشكل 1). وبعد تجهيز (قسم البروتوكول 4.2)، 6.2 × 10 6 يقرأ من حالة الاختيار و 6.3 × 10 6 يقرأ من 50 ميكروغرام / مل conditi اختيار الأمبيسلينعلى تم الحصول عليها. التهم التي تم الحصول عليها عن كل الأمينية الطفرة حمضية ناتجة عن حالة الاختيار عرض مميز لوغاريتمي عادي توزيع (الشكل 3A) 13. ما لا يقل عن تهمة واحدة من تسلسل ثقافة الاختيار عن 98.9٪ من الطفرات (58 ليس لديه التهم)، وأكبر من 100 التهم 91.2٪ (465 وأقل من 100 التهم) التي تم الحصول عليها. الشكل 3B يصور تأثير اللياقة البدنية النسبي () لكل طفرة في كل موقف من تيم-1؛ توزيع هو مبين في الشكل 3C. تحت الاختيار في 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، معظم الطفرات لها تأثير اللياقة البدنية محايد أو ما يقرب من محايد (≈ 0، الموافق بكسل البيضاء في الشكل 3B وذروة كبيرة في الشكل 3C). جزء صغير من الطفرات في هذا التركيز يكون لها آثار كبيرة على اللياقة البدنية (<< 0 الموافق بكسل الزرقاء في الشكل 3B والذيل الأيسر في الشكل 3C)؛ إكسب ectedly، وتشمل هذه الطفرات داخل بقايا الموقع النشطة الحفظ جدا (S70، K73، S130، D131، N132، K234 و G236) 13،14. في المقابل، بعض الطفرات تزيد إلى حد كبير لياقة بدنية على أن من تيم-1 (0 >> الموافق بكسل الحمراء في الشكل 3B)، كما كان متوقعا منذ تيم-1 هو كفاءة عالية في التحلل الأمبيسلين ( معادلة 14 ≈ 10 7 م -1 ق -1) 14.

شكل 1
يتم عرض الشكل 1. مخطط كامل البروتين التشبع بروتوكول الطفرات لتيم-1 β-اكتاماز تحت الأمبيسلين التحديد. تطبيقات كما هو موضح في بروتوكول بالخط العريض. وتظهر الخطوات البروتوكول مرقمة في اليسار، للإشارة إلى النص الرئيسي.ك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التحقق من متعامد الاشعال الموقع البلازميد المتجهات. خريطة (A) البلازميد لخمسة البلازميدات pBR322 المعدلة تحتوي على مواقع فتيلة المتعامدة (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). وأشار موقع واتجاه مواقع فتيلة المتعامدة. وصفت مواقع عدة مواقع قيود. يتم استنساخ كامل البروتين مكتبة التشبع الطفرات تيم-1 (الذي يشمل كامل تيم-1 الجينات والمروج) في الفترات الفاصلة بين تقييد مواقع AatII وAvrII. الاختصارات: تيت مقاومة التتراسيكلين الجينات، أوري أصل التكرار (ب) تم اختبار كل زوج من الاشعال المتعامدة (OP1-OP5) في PCR يحتوي على جميع البلازميدات pBR322_OP1-5 خمسة (+)، أو مع كل البلازميدات ناقص البلازميد منها (. ˗). يظهر هو بروميد إيثيديومهلام الاغاروز الملون (1٪ ث / ت) محملة كل رد فعل PCR، حجم مفصولة الكهربائي. المنتج حجم المتوقع هو 1628 سنة مضت. المسار الأول هو سلم ال DNA، والمقاسات من المعايير ذات الصلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. نتائج تيم-1-β اكتاماز كامل البروتين التشبع تجربة. (A) رسم بياني يوضح توزيع التهم لكل طفرة الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من التسلسل الإنتاجية العالية للمكتبة من حالة الاختيار. للبساطة، وتظهر الطفرات مع صفر التهم (53 الطفرات) وجود العد من واحد. آثار (B) للياقة البدنية لجميع الطفرات حمض أميني واحد في تيم-1 تحت الاختيار في 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. المعروض البيانات مصفوفة تحتوي على تأثير اللياقة البدنية النسبي () يصور colorimetrically مع الأزرق يمثل تأثير ضار، أحمر له أثر إيجابي والأبيض أي تأثير اللياقة البدنية بالنسبة إلى النوع البري. يتم تلوين الطفرات التي تم الحصول عليها لا تهم من ثقافة الاختيار الأسود. الصفوف تصور مواقع على امتداد سلسلة الابتدائي والأعمدة تشير إلى طفرة في واحد وعشرين الأحماض الأمينية أو وقف كودون (المشار إليها رمز حرف واحد، * هو وقف كودون)؛ وأشار هيكل الثانوي من تيم-1 في الزخارف الحفظ جدا اليسرى وعدة داخل موقع نشط يشار في الحق. (C) الرسم البياني يظهر توزيع الآثار اللياقة البدنية النسبية. أظهرت هي نتائج تلك الطفرات مع> 100 التهم التي تم الحصول عليها من تسلسل ثقافة الاختيار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الآثار البيئية، مع next.within صفحة = "دائما">
كاشف كتلة أو حجم التعليق
Typtone 2 ز
خلاصة الخميرة 0.5 غرام
كلوريد الصوديوم 0.06 ز
كلوريد البوتاسيوم 0.02 ز
كبريتات المغنيسيوم 0.24 ز
الماء المقطر 100 مل

الجدول 1. سوبر الأمثل مرق (سوب). أسماء الكاشف والكميات المستخدمة في إعداد 100 مل سوب (بروتوكول خطوة 1.1).

كاشف كتلة أو المجلدأوميا التعليق
Typtone 10 ز
خلاصة الخميرة 5 ز
كلوريد الصوديوم 10 ز
الماء المقطر 1 L

الجدول 2. لوريا، Bertani مرق (LB). أسماء الكاشف والكميات المستخدمة في إعداد 1 لتر LB (بروتوكول خطوة 1.1).

كاشف كتلة أو حجم التعليق
Typtone 10 ز
خلاصة الخميرة 5 ز
كلوريد الصوديوم 10 ز
أجار 15 ز
الماء المقطر 1 L

أسماء الكاشف الجدول 3. LB أجار. والكميات المستخدمة في إعداد LB أجار (بروتوكول خطوة 1.1).

كاشف الصوت التعليق
عازلة 5X PCR 1450 ميكرولتر
PCR المضافة 1450 ميكرولتر
2 مم dNTPs 725 ميكرولتر 2 مم كل النوكليوتيدات
AatII_F 50 ميكرومتر أو AvrII_R التمهيدي 145 ميكرولتر
1 نانوغرام / ميكرولتر البلازميد pBR322_AvrII 145 ميكرولتر
2 وحدة / ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي 72.5 ميكرولتر
ماء 363 ميكرولتر

الجدول 4. الأولى على مدار الطفري PCR ميكس ماجستير. أسماء الكاشف وكميات لإعداد مزيج الرئيسي للجولة الأولى مطفرة PCR (بروتوكول خطوة 2.2.1). مجموع كمية كافية ل290 25 التفاعلات ميكرولتر.

كاشف الصوت التعليق
عازلة 5X PCR 1450 ميكرولتر
PCR المضافة 1450 ميكرولتر
2 مم dNTPs 725 ميكرولتر 2 مم كل النوكليوتيدات
50 ميكرومتر AatII_F التمهيدي 145 ميكرولتر
50 ميكرومتر AvrII_R التمهيدي 145 ميكرولتر
2 وحدة / ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي 72.5 ميكرولتر
ماء 2973 ميكرولتر

الجدول 5. الجولة الثانية الطفري PCR ميكس ماجستير. أسماء الكاشف وكميات لإعداد مزيج الرئيسي للجولة الثانية مطفرة PCR (بروتوكول خطوة 2.2.2). مجموع كمية كافية ل290 25 التفاعلات ميكرولتر.

كاشف الصوت التعليق
عازلة 5X PCR 20 ميكرولتر
PCR المضافة 20 ميكرولتر
2 مم dNTPs 10 ميكرولتر 2 مم كل النوكليوتيدات
50 ميكرومتر AvrII_F التمهيدي 2 ميكرولتر
AatII_OP1_R 50 ميكرومتر - AatII_OP5_R التمهيدي 2 ميكرولتر التمهيدي واحد في رد الفعل، وإرفاقها مع البلازميد منها
1 نانوغرام / ميكرولتر pBR322_OP1-5 البلازميد 2 ميكرولتر البلازميد واحد في رد الفعل
2 وحدة / ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي 1 ميكرولتر
ماء 43 ميكرولتر

الجدول 6. الاستنساخ ناقل PCR. أسماء الكاشف وكميات لإعداد PCR لجعل ناقلات الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3.2).

كاشف الصوت التعليق
10X العازلة انزيم التقييد 5 ميكرولتر
4 وحدات / AvrII ميكرولتر 2.5 ميكرولتر
20 وحدة / AatII ميكرولتر 0.5 ميكرولتر
الحمض النووي لتقييد هضم حجم 500 نانوغرام
ماء 50 اجمالى حجم ميكرولتر

يساعد على هضم الجدول 7. تقييد. أسماء الكاشف وكميات لهضم تقييد ناقلات الاستنساخ والمجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية (بروتوكول خطوة 2.3.3).

كاشف الصوت التعليق
عازلة يغاز 10X T4 DNA 5 ميكرولتر
المنقى كالة أنباء البحرية الفرعية مكتبة DNA مجموعة هضم تقييد حجم لمدة 48 نانوغرام
المنقى هضم تقييد ناقلات استنساخ الحمض النووي حجم 52 نانوغرام
400 وحدة / T4 ميكرولتر يغاز الحمض النووي 1 ميكرولتر
ماء 20 اجمالى حجم ميكرولتر

الجدول 8. عملية ربط أسماء الكاشف وكميات لعملية ربط ناقلات الاستنساخ مع المجموعات الفرعية مكتبة هضم تقييد كالة أنباء البحرية في 1: ناقلات 3: إدراج نسبة المولي (بروتوكول خطوة 2.3.4).

كاشف الصوت التعليق
عازلة 5X PCR 55 ميكرولتر
PCR المضافة 55 ميكرولتر
2 مم dNTPs 27.5 ميكرولتر 2 مم كل النوكليوتيدات
2 وحدة / ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي 2.75 ميكرولتر
ماء 113 ميكرولتر

الجدول 9. PCR الكواشف لإعداد عينات للتسلسل عالية الإنتاجية. أسماء الكاشف وكميات لإعداد يمزج سيد PCR تستخدم لإزالة مضاعفة مع الاشعال المتعامدة (4.1.1)، وعزل المجموعات الفرعية مكتبة كالة أنباء البحرية (بروتوكول خطوة 4.1.2) واضاف تسلسل الفهرسة (بروتوكول خطوة 4.1.3). مجموع كمية كافية لمدة 11 25 التفاعلات ميكرولتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا يوصف بروتوكول للأداء التقييم الوظيفي لكامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات، وذلك باستخدام تكنولوجيا التسلسل الإنتاجية العالية. جانب هام من جوانب هذه الطريقة استخدام بادئات المتعامدة خلال عملية الاستنساخ. لفترة وجيزة، وعشوائية في كل موقف من الأحماض الأمينية التي مطفرة PCR، ومختلطة معا في مجموعات من المواقف التي جنبا إلى جنب تسلسل طول واستيعابها من قبل التسلسل الإنتاجية العالية. يتم استنساخ هذه المجموعات في ناقلات البلازميد التي تحتوي على أزواج من المواقع فتيلة المتعامدة، ويخلط معا وتعرض للاختيار، ثم نزع المضاعفة باستخدام بادئات المتعامدة، وبعد ذلك التسلسل عميق. منذ تقتصر الطفرات في تسلسل قراءة الحد طول، وهذا النهج يزيد من عدد من المفيد يقرأ تحتوي على طفرات الجينات من حجم أطول من التسلسل قراءة طول. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا الأسلوب يسمح لل"، دفعة واحدة" الاختيار في وقت واحد أو من mutatio كاملمكتبة نال، والحد من عبء العمل فضلا عن إمكانية أن الطفرات تجربة مستويات مختلفة من الاختيار. عمليا، والخطوات الحاسمة في البروتوكول المنظمة عن قلقها إلى حد كبير: خلال عملية الاستنساخ (بروتوكول خطوة 2.3) يجب على المرء أن ضمان خلط الصحيح من المنتجات PCR مطفرة إلى مجموعات والاستنساخ في وقت لاحق في الصحيح ناقلات متعامد الموقع فتيلة. أثناء إعداد العينة لتسلسل (بروتوكول خطوة 4.1)، الاشعال المتعامدة الصحيحة، فضلا عن التمهيدي لعزل كل مجموعة من المجموعات كالة أنباء البحرية الفرعية المكتبة وإضافة تسلسل الفهرسة، يجب أن تستخدم.

الخطوات الرئيسية الثلاثة للبروتوكول - بناء مكتبة، والاختيار، وتسلسلها - يمكن تعديل في عدة جوانب. خلال بناء مكتبة واحدة يمكن أن يعرض الطفرات باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات، على سبيل المثال، عرضة للخطأ PCR، أو عن طريق بناء الجين باستخدام أليغنوكليوتيد] توليفها من المنشطات في جزء صغير من النوكليوتيدات البديلةق 21. يمكن للمرء أن بناء مكتبة لتشمل الطفرات مزدوجة أو العليا في أجزاء من البروتين (أي الجماعات كالة أنباء البحرية الفرعية المكتبة)، أو في الخلفيات الوراثي بديلة 22. الأهم من ذلك، كافة التعديلات إلى الخطوة بناء مكتبة ولكن لابد من استيفاء المعيار أن المراسلات بين موقع الطفرات في تسلسل وتتابع قراءة الحفاظ طول. وبالتالي يستبعد هذا المعيار في تطبيق البروتوكول نحو دراسات شاملة للطفرات متعددة عبر بروتين. وتشمل تعديلات على الجزء الثاني من البروتوكول شروط اختيار البديل: (على سبيل المثال، درجة الحرارة، ومستويات المغذيات) مختلف أنواع β لاكتام (أو مجموعات) وتركيز، وظروف الإجهاد الخارجية، نوع المضيف (على سبيل المثال، وأنواع مختلفة من البكتيريا)، أو أوقات لأخذ العينات المختلفة (ساعات إلى أيام). على سبيل المثال، في أعمال سابقة درسنا آثار اللياقة البدنية لجميع الطفرات حمض أميني واحدفي تيم-1 تحت تركيزات مختلفة من الأمبيسلين، وتحت الجيل الثالث سيفالوسبورين سيفوتاكسيم 13. وفيما يتعلق الخطوة الثالثة من البروتوكول، ونحن حاليا لا ننصح بالخروج من اختيار منصة تسلسل المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد). بينما تتابع قراءة أطوال هي في الواقع حاليا تعد في منصات أخرى، وعدد من يقرأ الحصول عليها أقل بكثير في الوقت الراهن؛ في عام دقة الذي تأثير طفرة يمكن تحديد يتناسب مع عدد القراءات التي تم الحصول عليها (انظر المعادلة في البروتوكول خطوة 4.2.5).

إلى حد كبير عن البساطة، يستخدم بروتوكول تيم-1 β-اكتاماز كنظام نموذج، ولكن منهجية الموصوفة هنا يمكن أن تمتد إلى غيرها من النظم التي مجموعة مختارة الإنتاجية العالية أو فحص فحص في مكان. بناء مثل هذه المقايسات غير أنه في كثير من الأحيان غير تافهة: أولا، يجب وضع استراتيجية للتجزئة الجين (الطفرة) والبروتين معاعلى سبيل المثال داخل الخلية، قطرات سائلة (كما هو الحال في منصة على microfluidics)، أو عن طريق عرض فج. ثانيا، والأهم من ذلك، اتصال الكمي بين وظيفة البروتين والنمط الظاهري للاختيار، أو لياقة بدنية، يجب أن تنشأ. لالأنزيمات المشاركة في التمثيل الغذائي أو المقاومة للمضادات الحيوية، وقدرة الخلايا على النمو في المغذيات التسرب أو وسائل الإعلام المضادات الحيوية غالبا ما تكون وظيفة مباشرة النشاط الأنزيمي. ويمكن استخدام نهج أكثر الاصطناعية في الأنظمة الأخرى، على سبيل المثال من خلال ربط البروتين البروتين تقارب ملزمة لالجيني مراسل (على سبيل المثال، البروتين الفلوري) في التعبير البكتيريا أو الخميرة 11،23، أو باستخدام الركيزة انزيم الفلورة في microfluidics نظام 24 . وأخيرا، يجب أن يكون مثل هذا الفحص للتحجيم، لمعالجة حجم مكتبة الطفرات كامل البروتين.

وخلاصة القول، النهج القائم على التسلسل الإنتاجية العالية لتقييم وظيفي من كامل البروتين المكتبات التشبع الطفرات هو أن described هنا. الوسطى إلى النهج هو بناء مكتبة الطفرات في أجزاء على طول الجين، واستخدام الباركود التمهيدي متعامدة مع علامة كل قطعة لمضاعفة ودي المتنوعة المكتبة. ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقها بسهولة إلى البروتينات الأخرى التي تم وضع الإختيار الأفضل الإنتاجية العالية أو الشاشة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Typtone Research Products Intl. Corp. T60060-1000.0
Yeast extract Research Products Intl. Corp. Y20020-500.0
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333-500G
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506-500G
Agar Fisher Scientific BP1423-500
Tetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich T7660-5G
Petri plates Corning 351029
MATLAB  Mathworks http://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos 25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrII available upon request pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5 available upon request five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491L includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tube Corning 430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) Eppendorf
PCR plate, 96 well Fisher Scientific 14230232
96 well plate seal Excel Scientific F-96-100
Veriti 96-well thermal cycler Applied Biosystems 4375786
6x gel loading dye New England Biolabs B7024S
Agarose Research Products Intl. Corp. 20090-500.0
Ethidium bromide Bio-Rad 161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) Fotodyne Inc. http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB buffer Qiagen 19086
96-well black-walled, clear bottom assay plates Corning 3651
Lambda phage DNA New England Biolabs N3011S
PicoGreen dsDNA reagent Invitrogen P7581 dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate reader PerkinElmer
DNA purification kit Zymo Research D4003
Microcentrifuge tubes Corning 3621
Long-wavelength UV illuminator Fisher Scientific FBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction buffer Zymo Research D4001-1-100
AatII New England Biolabs R0117S
AvrII New England Biolabs R0174L
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
EVB100 electrocompetent E. coli Avidity EVB100
Electroporator (E. coli Pulser) Bio-Rad 1652102
Electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) Amersham Biosciences 80211237
50 ml conical tubes Corning 430828
Plasmid purification kit Macherey-Nagel 740588.25
8 well PCR strip tubes Axygen 321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32854 dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
Qubit fluorometer Invitrogen Q32866
Ampicillin sodium salt Akron Biotechnology 50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) Illumina MS-102-2003
MiSeq desktop sequencer Illumina http://www.illumina.com/systems/miseq.html alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh software John Hopkins University - open source http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_F GATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_R CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_F CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R ACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R ACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R ACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R ACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_F GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R CGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_F ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_F TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F AGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_R TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F ACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R GTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_F AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_R CAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_R CAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  2. Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
  3. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
  4. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  5. Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
  6. Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
  7. Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
  8. Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
  9. Fowler, D. M., et al. High-resolution mapping of protein sequence-function relationships. Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).
  10. Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
  11. McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
  12. Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
  13. Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
  14. Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
  15. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  16. Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
  17. Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
  18. Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
  19. Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
  20. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  21. Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
  22. Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
  23. Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
  24. Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 113، الطفرات والتشبع الطفرات، الجيل القادم التسلسل، وارتفاع التسلسل الإنتاجية، تيم-1 بيتا لاكتاماز، المقاومة للمضادات الحيوية، الاشعال المتعامدة
بروتوكول لالتقييم الوظيفي من كامل البروتين التشبع الطفرات المكتبات الاستفادة من الإنتاجية العالية التسلسل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stiffler, M. A., Subramanian, S. K., … More

Stiffler, M. A., Subramanian, S. K., Salinas, V. H., Ranganathan, R. A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (113), e54119, doi:10.3791/54119 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter