Summary
אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.
Introduction
Mutagenesis הועסק ארוך במעבדה כדי ללמוד את המאפיינים של מערכות ביולוגיות האבולוציה שלהם, ועל מנת לייצר חלבונים או אורגניזמים מוטנטים עם פונקציות משופרות או רומן. בעוד גישות מוקדם הסתמכו על שיטות אשר מייצרים מוטציות אקראיות באורגניזמים, הופעתו של טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי אפשרה לחוקרים להציג שינויים בחר DNA באופן אתר ספציפי, כלומר., 1,2 mutagenesis באתר ביים. בעזרת טכניקות נוכחיות, בדרך כלל באמצעות oligonucleotides מוטגנים ב תגובת שרשרת פולימראז (PCR), הוא יחסית קליל ליצור ולהעריך מספר קטן של מוטציות (למשל., מוטציות נקודתיות) בגן מסוים 3,4. זה הרבה יותר קשה אולם כאשר גישות המטרה, למשל, יצירה וההערכה של כל האתר היחיד האפשרי (או מסדר גבוה) מוטציות.
בעוד הרבה כבר למדו מן המחקרים המוקדמים מנסה להעריך במספרים גדולים של מ 'utations בגנים, הטכניקות המשמשות היו לעתים קרובות מייגעות, למשל המחייב את הערכה של כל מוטציה באמצעות מדכא שטויות עצמאי זני 5-7, או היו מוגבלים ביכולת הכמותית שלהם בשל עומק הרצף הנמוך של סנגר רצף 8. הטכניקות בשימוש במחקרים אלה כבר החליפו במידה רבה על ידי שיטות ניצול טכנולוגית רצף תפוקה גבוהה 9-12. גישות פשוטות מושגית אלה כרוכים יצירת ספרייה הכוללת מספר רב של מוטציות, משעבדת את הספרייה למסך או מבחר לתפקוד, ולאחר מכן-רצף עמוק (כלומר., בסדר גודל של> 10 6 רצף כניסות) הספרייה שהושגה לפני לאחר הבחירה. בדרך זו, את ההשפעות פנוטיפי או התאמה של מספר רב של מוטציות, ייצגו כשינוי בתדירות אוכלוסייה של כל מוטציה, ניתן להעריך בו זמנית ועוד כמותית.
בעבר הצגנו פתי(. כלומר, ספריות mutagenesis הרוויה כולה חלבון) הגישה le להערכת ספריות של כל המוטציות חומצה אמינית אחת אפשרית חלבונים, החלים על גנים עם אורך זמן רב יותר מאשר רצף לקרוא אורך 11,13: ראשית, כל עמדה חומצות אמיניות הוא אקראי על ידי אתר מכוון PCR מוטגנים. במהלך תהליך זה, גן מחולק קבוצות המורכבות עמדות רציפות באורך כולל לאכלס ידי פלטפורמת הרצף. מוצרי PCR מוטגנים לכל קבוצה מצורפים יחד, וכל קבוצה נתונה עצמאי בחירת רצף תפוקה גבוהה. על ידי שמירה על התכתבות בין המיקום של מוטציות ברצף והאורך לקריאת הרצף, גישה זו יש את היתרון של עומק רצף למקסם: בעוד אחד יכול פשוט רצף ספריות כאלה בחלונות קצרים ללא פיצול לקבוצות (למשל, על ידי רובה רגיל. גישת רצף), רוב הקורא המתקבל יהיה סוג-פרא ולכן מajority של תפוקת רצף המבוזבזת (למשל, עבור ספריית mutagenesis רווי כולה חלבון של חלבון חומצת אמינו 500 רצף ב 100 חומצות אמיניות (300 חלונות נ"ב), לכל הפחות 80% של הקורא יהיה רצף wild-type).
כאן, פרוטוקול מוצג אשר מנצל רצף תפוקה גבוהה עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי כולה חלבון, בגישה לעיל (המתואר באיור 1). חשוב לציין, אנחנו מציגים את השימוש של פריימרים מאונכים בתהליך שיבוט הספרייה ברקוד כל קבוצת רצף, אשר מאפשרת להם להיות מרובבות לתוך ספרייה אחד, נתון בו זמנית כדי הקרנה או בחירה, ולאחר מכן דה-מרובב על רצף עמוק. מאחר שקבוצות הרצף אינן חשופות בחירה באופן עצמאי, זה מפחית את עומס העבודה ומבטיח שכל מוטציה חווה את אותה רמת בחירה. TEM-1 β-lactamase, אנזים אשר מקנה עמידות גבוהה ברמהβ-לקטם אנטיביוטיקה (למשל., אמפיצילין) בחיידקים משמשת כמערכת מודל 14-16. פרוטוקול מתואר להערכת ספריית mutagenesis רווי כולה החלבון של TEM-1 ב E. coli תחת בחירה ברמה בסרום משוערת עבור מנה קלינית של אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ראה איור 1 עבור קווי המתאר של הפרוטוקול. צעדים ריאגנטים כמה בפרוטוקול דורשים אמצעי בטיחות (מסומנים עם "זהירות"). התייעץ גיליונות נתוני בטיחות חומרים לפני השימוש. כל צעדי הפרוטוקול מבוצעים ב RT אלא אם כן זה צביעה.
1. כן מדיה התרבות צלח
- הכן לעקר ידי מעוקר 1 L מים מטוהרים, 100 מ"ל סופר אופטימל מרק (SOB; טבלה 1), 1 ליטר לוריא- Bertani מרק (LB; טבלה 2) ו -1 L LB-אגר (לוח 3). הכן בנפרד לעקר שלוש צלוחיות תרבות כל LB. 1 L המכיל
הערה: לאורך כל הפרוטוקול "המים" מתייחסים חיטוי מעוקר מים מטוהרים; SOB, LB ו LB-אגר מתייחסים הפתרונות מעוקרות החיטוי. - הכינו מלאי 12 מ"ג / מ"ל של ט על ידי המסת hydrochloride טטרציקלין 0.12 גרם ב 10 מ"ל של אתנול 70%. לעקר באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסןב 4 ° C מוגן מפני אור.
- LB-אגר מצננים 50 ° C ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של המניה ט (ריכוז סופי של 12 מיקרוגרם / מ"ל ט). יוצקים לתוך צלחות פטרי וקריר ב RT מוגן מפני אור. חנות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
2. בניית-גן הפריטים בספריית mutagenesis רוויה
הערה: Primers; PCRs הושלמה, מעכל ו קשירת הגבלה; ניתן לאחסן דגימות DNA מטוהרים ב -20 ° C.
- עיצוב פריימרים mutagenesis
- כדי mutagenize כל עמדת חומצות אמיניות לכל חומצות אמינו האפשריות, לעצב זוג פריימרים mutagenesis משלימים (במובן / קדימה antisense / הפוכה) לכל תפקיד חומצת אמינו עם ההנחיות הבאות:
- להחליף את קודון המתאים חומצת אמינו להיות mutagenized ידי NNS (כאשר N הוא תערובת של כל ארבעה בסיסים נוקליאוטידים ו- S הוא תערובת של ציטוזין (C) גואנין (G)) ובמרכז חסודהאה, מוקף כ -15 נוקלאוטידים בכל צד.
- ודא 5 'ו 3' מסתיים לסיים ב C או G וכי טמפרטורת ההתכה (T מ) הוא כ 70 ° C 3. השתמש NNS_PrimerDesign.m סקריפט חישובית (ראה קובץ קוד משלים) לתכנן פריימרים mutagenesis NNS פי הנחיות אלו.
- פריימרים להזמין ממקור מסחרי. על מנת להקל על השימוש, יש להם מסונתז בפורמט צלחת 96-היטב מראש מדולל במים עד 50 מיקרומטר, עם סט אחד של צלחות המכילות פריימרים mutagenesis תחושת ועוד פריימרים antisense.
- מלאו אגן פיפטה עם מים ולהשתמש פיפטה רבה להעביר 95 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב. לדלל את פריימרים פי 20 ל -2.5 מיקרומטר באמצעות פיפטה רבה להעביר 5 μl מהצלחות 96-היטב המכילות את פריימרים mutagenesis ההגיוניים בארות מאותו המקור של הצלחות המכילות מים.
- חזורצעד פרוטוקול 2.1.3 לדלל את פריימרים mutagenesis antisense.
- כדי mutagenize כל עמדת חומצות אמיניות לכל חומצות אמינו האפשריות, לעצב זוג פריימרים mutagenesis משלימים (במובן / קדימה antisense / הפוכה) לכל תפקיד חומצת אמינו עם ההנחיות הבאות:
- סינתזה של-ספריות משנה NNS לכל תפקיד חומצת אמינו על ידי mutagenesis אתר מכוונת שני שלבים PCR
- בצעו את PCRs מוטגנים בסיבוב הראשון. עבור כל צבע יסוד mutagenesis, להכין תגובת PCR 25 μl באמצעות פלסמיד pBR322_AvrII כמו AatII_F התבנית פריימרים או AvrII_R (פריימרים mutagenesis תחושה זיווג עם פריימר AvrII_R, ו פריימרים mutagenesis antisense זיווג עם פריימר AatII_F; סך של 526 PCRs). ראה טבלה של חומרים עבור רצפי AatII_F ו AvrII_R.
- הכן PCR "תערובת אמן" על ידי הוספת חומרים כימיים מטבלה 4 צינור חרוטי 15 מ"ל. מעביר אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 15 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב PCR. השתמש פיפטה רב להעביר 10 μl מהצלחות 96-היטב המכיל את פריימרים mutagenesis תחושה מדולל ל בארות מאותו מקור in צלחות PCR.
- כיסוי כל צלחת PCR עם חותם צלחת 96-היטב. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 2 דקות.
- מעבירים את צלחות PCR כדי thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 20 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 ° C עבור 1 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C..
- פרוטוקול חזור על שלבים 2.2.1.1 - 2.2.1.3 עבור צלחות 96-היטב המכיל את פריימרים mutagenesis antisense מדולל.
- בצעו את PCRs בסיבוב השני מוטגנים. לכל תפקיד חומצת אמינו, להכין AatII_F פריימרים באמצעות תגובה 25 μl PCR ו AvrII_R, ואת מעורבות ומדולל בסיבוב הראשון מוצרי ה- PCR מוטגנים כתבנית (סה"כ 263 PCRs).
- מלאו אגן פיפטה עם מים ולהשתמש פיפטה רבה להעביר 198 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב.
- שלב ו לדלל 100-לקפל את מוצרי ה- PCR מוטגנים לכל תפקיד חומצת אמינו באמצעות פיפטה רבה כדיההעברה הראשונה 1 μl מהצלחות 96-היטב PCR המכיל את מוצרי ה- PCR הנובעים פריימרים mutagenesis הגיוני בארות מאותו מקור של צלחות המכילות מים. לאחר מכן לחזור על העברה של מוצרי ה- PCR הנובעים פריימרים mutagenesis antisense.
- הכן PCR "תערובת אמן" על ידי הוספת חומרים כימיים מטבלה 5 צינור חרוטי 15 מ"ל. מעביר אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 24 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב PCR. השתמש פיפטה רב להעביר 1 μl מהצלחות 96-היטב המכיל את מעורבות ומדולל בסיבוב הראשון מוצרי ה- PCR מוטגנים אל בארות מאותו מקור של צלחות PCR.
- כיסוי כל צלחת PCR עם חותם צלחת 96-היטב. צנטריפוגה ב כ XG 200 במשך 2 דקות. צלחות העברה thermocycler ולהפעיל אותה תוכנית כמו בשלב פרוטוקול 2.2.1.3.
- נתחו את התוצאות של PCRs מוטגנים בסיבוב השני על ידי ג'ל אלקטרופורזה.ודא כי כל המוצרים הם של הגודל הנכון ונעדר של זיהום מוצרים.
- הוסף 2 מ"ל של צבע טעינת ג'ל 2x לאגן פיפטה ולאחר מכן להשתמש פיפטה רב להעביר 6 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות 96-היטב. השתמש פיפטה רב להעביר 6 μl מהצלחות 96-היטב PCR המכיל את מוצרי ה- PCR סיבוב שני מוטגנים אל בארות מאותו מקור של צלחות 96-היטב המכיל צבען.
- כן ג'ל agarose 1.5% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
- סולם DNA טען נתיבים ראשונים והאחרונים של כל שורה. לאחר מכן השתמש פיפטה רבה לטעון 10 μl של דגימות משלב פרוטוקול 2.2.3.1.
- הפעל את הג'ל על 100 וולט במשך 40 דקות ותמונה על transilluminator UV.
- פרוטוקול חזור על שלבי 2.2.3.2 - 2.2.3.4 עד שכל הדגימות מנותחות.
- למדוד במדויק את הריכוז של כל מוצר NNS תת-ספריה PCR באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
- לְהַעֲבִירכ 15 מ"ל EB חיץ אגן פיפטה. השתמש פיפטה רבה להעביר 49 μl 263 בארות מעל שלוש צלחות assay תחתונות 96-היטב, שחור קירות, ברורות.
- השתמש פיפטה רבה להעביר 1 μl של כל מוצר שני שלבים PCR (שלב פרוטוקול 2.2.2) על בארות מאותו המקור של צלחות assay 96-היטב.
- כן עקומת סטנדרט ריכוז ה- DNA על ידי דילול DNA הפאג למבדה 2 ng / μl ב 300 μl חיץ EB ולאחר מכן לבצע עשרה דילולים כפולים (עבור סכום כולל של 11 ריכוזים). העברת 50 μl לאחת עשרה העמודות הראשונות של שורה של אחד מלוחות assay 96-היטב מהשלב הקודם אשר אינו מכיל מדגם; לעמודה י"ב להוסיף 50 μl של חיץ EB (מגיב ריק).
- הכן מגיב quantitation dsDNA ידי הוספת 75 μl של מגיב (ראו טבלה של חומרים) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל, ואז מוסיפים 15 מ"ל של חיץ EB. מערבבים על ידי היפוך צינור ולאחר מכן להעביר אגן פיפטה. גן מגיב מן האור.
- השתמש פיפטה רב להעביר 50 μl של מגיב quantitation dsDNA מוכן היטב בכל צלחות assay. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה. דגירה צלחות ב RT במשך 5 דקות מוגנים מפני אור.
- מדוד קרינה של כל דגימה באמצעות קורא microplate ואת אורכי גל והעמסה סטנדרטיים (עירור 485 ננומטר, פליטה 520 ננומטר; 0.1 שניות).
- הפחת את ערך הקרינה של ריק מגיב מכל הדגימות. ליצור עקומת תקן מן מדידות הקרינה של דגימות הפאג למבדה. חשב את הריכוז של כל דגימה באמצעות מדידות הקרינה שלהם ואת עקומת סטנדרט.
- בצעו את PCRs מוטגנים בסיבוב הראשון. עבור כל צבע יסוד mutagenesis, להכין תגובת PCR 25 μl באמצעות פלסמיד pBR322_AvrII כמו AatII_F התבנית פריימרים או AvrII_R (פריימרים mutagenesis תחושה זיווג עם פריימר AvrII_R, ו פריימרים mutagenesis antisense זיווג עם פריימר AatII_F; סך של 526 PCRs). ראה טבלה של חומרים עבור רצפי AatII_F ו AvrII_R.
- שיבוט של ספריות משנת NNS לתוך וקטורי בחירה
- מערבבים 100 ng של כל מוצר תת-ספריה NNS PCR לחמש NNS קבוצות תת-ספריה. בעקבות 'הוראות היצרן, לנקות דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA ולאחר מכן ריכוז למדוד באמצעות dsמגיב quantitation DNA.
הערה: כל קבוצה מורכבת של כ 53 עמדות חומצות רציפות אמינו במרווחים לאורך רצף TEM-1 (NNS תת-ספריית קבוצות 1 - 5 מורכבות עמדות 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, ו 237 - 290, בהתאמה; מונה על פי אמבלר ואח 19).. - צור שיבוט וקטורים לכל קבוצת משנה הספרייה NNS.
- הכן חמישה 100 PCRs μl לפי טבלה 6, באמצעות פריימרים AvrII_F ו AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, ו פלסמידים pBR322_OP1-5 כתבנית (AatII_OP1_R זיווג עם pBR322_OP1, וכו ').
- מעבירים thermocycler ולהפעיל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 25 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C.. ראה T מסוגל של חומרים עבור רצפים של AatII_R ו AvrII_F.
- כן ג'ל agarose 1% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
- הוסף 20 μl של צבע טעינת ג'ל 6x מדגם PCR. טען את הנתיב הראשון של הג'ל עם סולם DNA; לטעון כל נפח של כל דגימה, מדלג לפחות אחד טוב בין דגימות.
- הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 50 דקות.
- דמיינו ג'ל באמצעות נורת UV לטווח אורך הגל (זהירות). פרוסות ובלו המכילות את מוצר ה- PCR ב ~ 3,500 נ"ב; להעביר להפריד צינורות microfuge. פרוסות ג'ל ניתן לאחסן ב -20 ° C.
- בעקבות 'הוראות היצרן, לטהר דגימות באמצעות ערכת ג'ל מיצוי וריכוז מידה באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
- עבור שתי הקבוצות תת-ספריית NNS (שלב פרוטוקול 2.3.1) ו וקטורי שיבוט (שלב פרוטוקול 2.3.2), להגדיר הגבלה מעכלת עם אנזימי AatII ו AvrII פי T 7 מסוגלים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה. בעקבות 'הוראות היצרן, לנקות דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA ולאחר מכן ריכוז למדוד באמצעות quantita dsDNAמגיב tion.
- הגדרת תגובות קשירת באי לוח 8 לכל קבוצת משנה הספרייה NNS מתעכל הגבלה עם וקטור שיבוט מתעכל הגבלה מאותו המקור (קבוצת משנה הספרייה NNS 1 עם pBR322_OP1, וכו '). לדגור על RT במשך שעה 1. לנקות תגובות באמצעות ערכת טיהור DNA על פי הוראות היצרן; elute DNA עם 20 μl של מים.
- להפוך את מכלול תגובות הקשירה מטוהר לתוך E. ספרייה יעילה קולי תאים על ידי electroporation.
- הפשרת א electrocompetent קולי תאים ולאחר מכן מקום תאים ותגובות קשירת מטוהרים על קרח.
- העברת 10 μl מופשרים תאים לתגובת כל קשירת מטוהרים ולאחר מכן להעביר קובט electroporation. Electroporate ב 1.8 קילו וולט.
- שחזור תאים על ידי resuspending ב 1 מ"ל SOB. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- Resuspend 10 μl של כל תרבות התאוששות 990 μl LB; להפיץ 100 μl על ג צלחות LB-אגרontaining 12 מיקרוגרם / מ"ל ט. דגירה צלחות O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ° C.
- עבור כל תרבות התאוששות, להכין בקבוק תרבות 250 מ"ל עם 50 מ"ל LB ו -50 מניות ט μl. מעביר בקבוקון את ~ 1 המ"ל הנותר של תרבות התאוששות. דגירה O / N (~ 16 שעות) בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (~ 200 סל"ד).
- ספירת מושבות על כל צלחת. לחשב את מספר transformants מוצלח כמו
, איפה 
הוא מספר מושבות, 
הוא נפח תרבות התאוששות (1,000 μl) ו 
נפח של תרבות התאוששות מצופה (1 μl).
הערה: כדי להבטיח כיסוי מלא של כל המוטציות, ככלל אצבע מספר transformants מוצלח צריך להיות ≥100-לקפל על מספר מוטציות צפויות. כל הספרייה משנה NNS ~ 53 עמדות, כך המספר הצפוי של מוטציות הוא 53 עמדות × 32 קודונים / מיקום ≈ 1.7 × 10 3; לתת גודל ספרייה ≥100 פי (≥1.7 × 10 5) לא אמור להיות ≥170 מושב על כל צלחת. - על פי הוראות היצרן, לבודד DNA פלסמיד מתרבויות באמצעות ערכת טיהור פלסמיד ולאחר מכן למדוד ריכוזים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA. מערבבים יחד 100 ננוגרם של כל פלסמיד. זה יוצר את ספריית mutagenesis רווי כולה החלבון הסופית.
- מערבבים 100 ng של כל מוצר תת-ספריה NNS PCR לחמש NNS קבוצות תת-ספריה. בעקבות 'הוראות היצרן, לנקות דגימות באמצעות ערכת טיהור DNA ולאחר מכן ריכוז למדוד באמצעות dsמגיב quantitation DNA.
, איפה 
הוא מספר מושבות, 
הוא נפח תרבות התאוששות (1,000 μl) ו 
נפח של תרבות התאוששות מצופה (1 μl). בחירת 3. ספריית mutagenesis רווית Whole-חלבון TEM-1 עבור עמידות לאנטיביוטיקה
- הכנת התרבות הפרה-הבחירה.
- לדלל את פלסמיד משלב פרוטוקול 2.3.7 ל -0.5 ng / μl במים ולהעביר 20 μl לצינור microcentrifuge. בצע טרנספורמציה, מחדשcovery, ציפוי O / N צמיחה כפי שתואר לעיל בשלב פרוטוקול 2.3.5, למעט העברת 1 μl של התרבות התאוששות SOB 999 LB. μl
- ספירת מושבות. כדי להבטיח כיסוי מלא של כל המוטציות לא אמורה להיות ≥100 מושבות, המציין ≥10 6 transformants מוצלח (100 × 263 עמדות × 32 קודונים / מיקום ≈ 10 6).
- למדוד את ריכוז של תרבות 50 מ"ל O / N.
- הכן ריק LB על ידי הוספת 1 מ"ל LB קובט ספקטרופוטומטר. מדוד OD600 על ספקטרופוטומטר.
- לדלל את פי 10 התרבות O / N ידי resuspending 100 μl ב 900 LB. μl מדוד את OD600. הפחת את הקריאה OD600 של ריק ולהתרבות על ידי 10 לתת את OD600 של התרבות O / N.
- טרום לחמם את שלוש צלוחיות תרבות משלב פרוטוקול 1.1 עבור ~ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל את O / N תרבות OD600 = 0.1 ולהוסיף 1 מ"ל ל בקבוקון אחד (OD600 הסופי = 0.001). Tשלו הוא "תרבות טרום הבחירה".
- דגירה "תרבות טרום הבחירה" על 37 מעלות צלזיוס עם רעד נמרץ (200 סל"ד). מעת לעת לפקח הצמיחה על ידי מדידת OD600 כמו בשלב פרוטוקול 3.1.3 (זה לא הכרחי כדי לדלל התרבות של פי 10) עד OD600 = 0.1 (~ 2.5 שעות).
- העברת 100 מ"ל של התרבות הפרה-הבחירה לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 6 דקות ב 4 °. הסר ביותר של supernatant ולשלב לתוך צינור חרוטי 15 יחיד. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את כל supernatant. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
- בחירה להתנגדות אמפיצילין.
- בעוד תרבות טרום הבחירה היא דוגרת, להכין מלאי של 50 מ"ג / מיליליטר של Amp במים על ידי המסת אמפיצילין סודיום 0.5 גרם ב 10 מ"ל מים. לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- אל שתי צלוחיות אחרים, להוסיף ט לריכוז סופי של 12 מיקרוגרם / מ"ל ו כרך של tha כגון תרבות טרום הבחירה ך * OD600 הסופי = 0.001. כדי בקבוקון אחד, להוסיף 1 מ"ל Amp, ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל - זהו "תרבות הבחירה".
- דגירה התרבויות בשעה 37 ° C עם רעד נמרץ (200 סל"ד). צג הצמיחה של התרבות בגינם לא אמפיצילין נוסף בשלב הקודם, עד OD600 = 0.1 (~ 2.5 שעות). בשלב זה, גם למדוד את OD600 של תרבות הבחירה.
- מחלקים את OD600 של התרבות מבחר לתוך 0.1 ולהתרבות על ידי 100 מ"ל. העבר בכרך זה (~ 400 מ"ל) 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטי ב 4000 XG במשך 6 דקות ב 4 °. הסר ביותר של supernatant ולשלב לתוך צינור חרוטי 15 יחיד. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את כל supernatant.
- על פי הוראות היצרן, לבודד פלסמיד דנ"א מן המיון מוקדם (שלב פרוטוקול 3.1.6) ובחירה (שלב פרוטוקול 3.2.4) כדורי תא תרבות ולאחר מכן למדוד ריכוזים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA.
- הכנת דגימות עבור סידור תפוקה גבוהה
- כן 25 PCRs μl לדה-זמנית קבוצות תת-ספריית NNS עם פריימרים מאונכים
- להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9; להעביר 23 μl עד עשרה צינורות PCR.
- הוסף 1 μl של 0.5 ng / μl DNA פלסמיד מטוהרים מן התרבות טרום הבחירה PCR צינורות 1 - 5 ו מתרבות מבחר לצינורות 6 - 10.
- מערבב יחד 50 μl של 50 מיקרומטר קדימה OP1_F פריימרים מאונכים - OP5_F עם OP1_R פריימרים מאונכים ההפוך בהתאמה - OP5_R. באותו סדר, העברת 1 μl צינורות PCR 1 - 5 ו -6 - 10. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של OP1_F - OP5_F ו OP1_R - OP5_R.
- העבר צינורות PCR כדי thermocycler. הפעל את התוכנית הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 20 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 °; צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; להחזיק ב 4 ° C..
- כן 25 PCRs μl לבודד כל אחת מהקבוצות תת-ספריית NNS
- לדלל 100-לקפל את PCRs העשרה משלב פרוטוקול 4.1.1.4 על ידי העברת 1 μl של כל להפריד צינורות PCR והוסיף 99 μl של מים. מערבבים, אז פיפטה 99 μl וזורקים.
- מערבבים יחד 50 μl של 50 פריימרים מיקרומטר קדימה Group1_F - Group5_F עם Group1_R פריימרים הפוכה בהתאמה - Group5_R. באותו סדר, העברת 1 μl כדי PCR צינורות 1 - 5 ו -6 - 10. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של Group1_F - Group5_F ו Group1_R - Group5_R.
- להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9, להעביר 23 μl על צינור אחד PCR. העבר צינורות PCR כדי thermocycler; להפעיל את אותה תוכנית כמו בשלב פרוטוקול 2.2.1.3.
- לבצע 25 PCRs μl הסופי להוסיף רצפים לאינדקס
- diלאוטה 100-לקפל את PCRs העשרה משלב פרוטוקול 4.1.2.3 על ידי העברת 1 μl של כל להפריד צינורות PCR והוסיף 99 μl של מים. מערבבים, אז פיפטה 99 μl וזורקים.
- להכין תערובת אב PCR לפי טבלה 9, להעביר 23 μl על צינור אחד PCR.
- עבור צינורות עם תבנית שמקורם קבוצות תת-ספריה NNS 1-5, להעביר 0.5 μl לכל פריימרים צינור קדימה 501_F - 505_F בהתאמה. עבור צינורות עם תבנית הנובעים תרבויות קדם-והתאמת, להעביר 0.5 μl לכל צינור הפוכה פריימרים 701_R ו 702_R, בהתאמה. ראה טבלה של חומרים עבור רצפים של 501_F - 505_F, ו 701_R ו 702_R.
- העבר צינורות PCR אל thermocycler ולהפעיל את התוכנית משלב 2.2.1.3.
- מערבבים ולטהר דגימות
- ריכוזים מדודים באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA פי הוראות היצרן. מערבבים 100 ng של כל int מוצר ה- PCRצינור OA יחיד microcentrifuge.
- כן ג'ל agarose 2% עם 0.2 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (זהירות).
- להוסיף צבע טעינת ג'ל 6x מדגם מוצרי PCR המעורב. טען את הנתיב הראשון של הג'ל עם סולם DNA; לטעון כל נפח של המדגם.
- הפעל הג'ל על 100 וולט במשך 50 דקות. דמיינו ג'ל באמצעות נורת UV לטווח אורך הגל (זהירות). פרוסה ובלו המכילה את מוצר ה- PCR ב ~ 360 נ"ב; להעביר microfuge שפופרת. ניתן לאחסן פרוסת ג'ל ב -20 ° C.
- בעקבות הוראות היצרן, לטהר מדגם באמצעות ערכת ג'ל מיצוי למדוד ריכוז באמצעות ריאגנט quantitation dsDNA. זהו המדגם הסופי עבור סידור תפוקה גבוהה.
- רצף על פלטפורמת רצף תפוקה גבוהה (ראה טבלה של חומרים עבור פלטפורמה בשימוש בפרוטוקול זה).
- חישוב ריכוז מדגם ננומטר כמו
הוא הריכוז של המדגם בשנת ng / μl ו 
הוא אורך רצף של DNA במדגם (~ 360 נ"ב). לדלל מדגם 4 ננומטר חיץ EB. - עקוב אחר הוראות היצרן כדי לפגל מדגם לדלל עד 9 בערב במאגר הכלאה.
- טען 600 μl של מדגם לתוך מחסנית מגיבה. הרצף הבא להוראות היצרן הנחיות על המסך.
- חישוב ריכוז מדגם ננומטר כמו
- כן 25 PCRs μl לדה-זמנית קבוצות תת-ספריית NNS עם פריימרים מאונכים
- ניתוח של נתוני רצף
- הורד Flash (התאמת אורך תענית הסיפורים קצרה) 20, להציב לתוך תיקייה יחד עם קבצי fastq.gz המתקבלים רצף.
- להשתמש בפלאש להצטרף קבצי fastq.gz המתאימים-סוף לזווג קורא לכל זוג המדדים (קדימה הפוך קוראים לכל קבוצה תת-ספריית NNS עבור התרבויות קדם-והתאמה).
- לאחר שהצטרף כל זוג קורא, למקם את קובץ פלט out.extendedFrags.fastq לתיקיות נפרדות תוצאות של תרבויות קדם-בחירה או בחירה. שנה את שם הקובץ פלט out.extendedFrags.fastq לפי קבוצת תת-ספריה NNS שאליו הוא עולה בקנה אחד (כלומר., 1.fastq, 2.fastq, וכו ').
- הפעל את NNS_DataAnalyzer.m סקריפט חישובית (ראה קובץ קוד משלים) מכל תיקייה כדי לחשב את הספירה עבור כל מוטציה בחומצה אמינית אחת, ואת הספירה עבור wild-type, לכל קבוצת משנה הספרייה NNS.
- לחשב את השפעת הכושר
של כל מוטציה כמו עשר לוגריתם בבסיס היחס של ספירת המתקבל בבחירה (
) מול הבחירה מראש ( 
תנאים), ביחס wild-type: 
.
הוא הריכוז של המדגם בשנת ng / μl ו 
הוא אורך רצף של DNA במדגם (~ 360 נ"ב). לדלל מדגם 4 ננומטר חיץ EB. 
של כל מוטציה 
) מול הבחירה מראש ( 
תנאים), ביחס wild-type: 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מפת פלסמיד במשך חמשת פלסמידים pBR322 השונים המכילים אתרים יחולו אורתוגונלי (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) מוצגת באיור 2 א. כדי לבדוק אם פריימרים המאונכים הם ספציפיים, PCRs בוצע באמצעות כל זוג פריימרים מאונך בנפרד, יחד עם כל חמשת פלסמידים pBR322_OP1-5, או עם כל פלסמידים מינוס הפלסמיד התאמת זוג פריימר מאונך. המוצר הנכון הושג רק כאשר פלסמיד ההתאמה נכלל, ולא מוצר בכל גודל הושג בהעדרה (איור 2 ב).
ניסוי נציג בוצע בעקבות הפרוטוקול המתואר בטקסט זה (איור 1). בעקבות עיבוד (סעיף פרוטוקול 4.2), 6.2 × 10 6 קורא מתוך מצב טרום הבחירה 6.3 × 10 6 קורא מן conditi מבחר אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ"לעל התקבלו. ספירת מתקבל עבור כל אמינו מוטצית חומצה ממצב טרום הבחירה להציג (איור 3 א) מאפיין לוג-נורמלי הפצת 13. לפחות אחד לספור מ רצף של התרבות הפרה-הבחירה עבור 98.9% של מוטציות (58 לא סופרים), ו יותר מ -100 ספירות עבור 91.2% (465 הייתה פחות מ -100 ספירות) התקבלה. איור 3 ב מציג את שפעת הכושר היחסית () עבור כל מוטציה בכל עמדת TEM-1; החלוקה מוצגת באיור 3C. תחת בחירה ב אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מיליליטר, ולרובם יש מוטציות השפעת כושר ניטראלית או כמעט ניטראלית (0 ≈, מתאימות פיקסלים לבן באיור 3 ב ואת השיא הגדול באיור 3C). חלק קטן של מוטציות בריכוז זה להיות השפעות משמעותיות על כושר (<< 0, מתאים פיקסלים כחולים באיור 3 ב ואת הזנב השמאלי איור 3 ג); exp ectedly, אלה כוללים מוטציות בתוך שאריות אתר הפעילות השמורות ביותר (S70, K73, S130, D131, N132, K234 ו G236) 13,14. לעומת זאת, כמה מוטציות באופן משמעותי להגביר את הכושר על פני זו של TEM-1 (>> 0, מתאימות פיקסלים אדום באיור 3 ב), כפי שניתן היה לצפות מאז TEM-1 הוא יעיל ביותר הידרוליזה אמפיצילין ( 
≈ 10 7 M -1 s -1) 14.
מתאר באיור 1. פרוטוקול mutagenesis רוויה Whole-חלבון עבור TEM-1 β-lactamase תחת בחירת אמפיצילין. פעולות כמתואר בפרוטוקול מוצגים מודגש. צעדי פרוטוקול ממוספרים מוצגים בצד השמאל, לעיון לטקסט העיקרי.k "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אימות של אורתוגונלית לקרקע אתר פלסמיד וקטורים. (א) מפת פלסמיד במשך חמשת פלסמידים pBR322 השונים המכילים אתרים יחולו אורתוגונלי (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). מיקום וכיוון באתרים יחולו המאונך מסומן. מיקומים של אתרי הגבלה כמה מסומנים; הספרייה mutagenesis הרוויה כולה חלבון TEM-1 (הכולל את הגן TEM-1 כולו האמרגן) הוא משובטים ב-בין אתרי הגבלה AatII ו AvrII. קיצורים: הגן התנגדות טטרציקלין ט, אורי המוצא של שכפול (B) כל זוג פריימרים אורתוגונלי (OP1-OP5) נבדק PCR המכיל את כל חמשת פלסמידים pBR322_OP1-5 (+), או עם כל פלסמידים מינוס הפלסמיד בהתאמה (. ˗). המוצג הוא ברומיד ethidiumג'ל מוכתם agarose (1% w / v) עמוס כל תגובת PCR, גודל מופרד על ידי אלקטרופורזה. מוצר הגודל הצפוי הוא 1,628 נ"ב; הנתיב הראשון הוא סולם DNA, בגדלים של תקנים רלוונטיים מסומנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תוצאות איור 3. של TEM-1 β-lactamase ניסוי רוויה Whole-חלבון. (א) היסטוגרמה המציגה את התפלגות ספירה לכל מוטצית חומצת אמינו המתקבלת רצף תפוקה גבוהה של הספרייה מתוך מצב טרום הבחירה. לשם פשטות, מוטציות עם אפס עבירות (53 מוטציות) מוצגות כבעלי ספירה של אחד. (ב) השפעות כושר של כל המוטציות של חומצות אמינו יחידות TEM-1 תחת בחירה ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. מוצג הם הנתונים מטריקס המכיל את שפעת הכושר היחסית () המתוארת colorimetrically עם אפקט כחול מייצג מזיק, אדום השפעה חיובית ולא ביחס השפעת כושר לבנה wild-type. מוטציות בגינם לא ספירה התקבלו מתרבות מראש מבחר נצבעות שחורות. שורות מתארות עמדות לאורך הרצף העיקרי ועמודות מצביעות מוטציה לאחד עשרים חומצות אמיניות או קודון סיום (מסומן על ידי קוד חד-מכתב, * הוא קודון סיום); המבנה המשני של TEM-1 מצוין בחלקה מוטיבים שמאל וכמה שמור ביותר בתוך האתר הפעיל מסומנים בצד ימין. (C) היסטוגרמה המציגה את התפלגות השפעות כושר יחסית. מוצגים הם תוצאות עבור מוטציות אלה עם> 100 ספירת מתקבל רצף התרבות הפרה-הבחירה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מֵגִיב | מסה או נפח | תגובה |
| Typtone | 2 g | |
| תמצית שמרים | 0.5 גרם | |
| נתרן כלורי | 0.06 גרם | |
| אשלגן כלורי | 0.02 גרם | |
| מגנזיום סולפט | 0.24 גרם | |
| מים מטוהרים | 100 מ"ל |
טבלת 1. סופר אופטימל מרק (SOB). שמות וכמויות מגיבים המשמשים בהכנת 100 מיליליטר SOB (שלב פרוטוקול 1.1).
| מֵגִיב | מסה או כרךume | תגובה |
| Typtone | 10 גרם | |
| תמצית שמרים | 5 גרם | |
| נתרן כלורי | 10 גרם | |
| מים מטוהרים | 1 L |
טבלה 2. לוריא- Bertani מרק (LB). השמות מגיב וכמויות המשמשים בהכנת 1 L LB (שלב פרוטוקול 1.1).
| מֵגִיב | מסה או נפח | תגובה |
| Typtone | 10 גרם | |
| תמצית שמרים | 5 גרם | |
| נתרן כלורי | 10 גרם | |
| אגר | 15 גרם | |
| מים מטוהרים | 1 L |
לוח 3. LB-אגר. שמות מגיב וכמויות המשמשים בהכנת LB-אגר (שלב פרוטוקול 1.1).
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ 5x PCR | 1,450 μl | |
| תוסף PCR | 1,450 μl | |
| 2 מ"מ dNTPs | 725 μl | 2 מ"מ כל נוקלאוטיד |
| 50 מיקרומטר AatII_F או פריימר AvrII_R | 145 μl | |
| 1 ng / פלסמיד pBR322_AvrII μl | 145 μl | |
| 2 יחידות / μl DNA פולימרז | 72.5 μl | |
| מַיִם | 363 μl |
לוח 4.-סיבוב ראשון מוטגנים PCR מיקס מאסטר. שמות מגיב וכמויות להכנת מיקס מאסטר עבור בסיבוב הראשון מוטגנים PCR (שלב פרוטוקול 2.2.1). הכמות הכוללת מספיקה עבור 290 25 תגובות μL.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ 5x PCR | 1,450 μl | |
| תוסף PCR | 1,450 μl | |
| 2 מ"מ dNTPs | 725 μl | 2 מ"מ כל נוקלאוטיד |
| פריימר 50 מיקרומטר AatII_F | 145 μl | |
| פריימר 50 מיקרומטר AvrII_R | 145 μl | |
| 2 יחידות / μl DNA פולימרז | 72.5 μl | |
| מַיִם | 2,973 μl |
לוח 5-סיבוב שני מוטגנים PCR מיקס מאסטר. שמות מגיב וכמויות להכנת תערובת אב-הסיבוב השני מוטגנים PCR (שלב פרוטוקול 2.2.2). הכמות הכוללת מספיקה עבור 290 25 תגובות μl.
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ 5x PCR | 20 μl | |
| תוסף PCR | 20 μl | |
| 2 מ"מ dNTPs | 10 μl | 2 מ"מ כל נוקלאוטיד |
| פריימר 50 מיקרומטר AvrII_F | 2 μl | |
| 50 מיקרומטר AatII_OP1_R - פריימר AatII_OP5_R | 2 μl | פריימר אחד לכל תגובה, יחד עם הפלסמיד בהתאמה |
| 1 ng / μl פלסמיד pBR322_OP1-5 | 2 μl | פלסמיד אחד לכל תגובה |
| 2 יחידות / μl DNA פולימרז | 1 μl | |
| מַיִם | 43 μl |
לוח 6: שיבוט וקטור PCR. שמות מגיב וכמויות להכנת PCR על מנת להפוך את הווקטורים שיבוט (שלב פרוטוקול 2.3.2).
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ אנזים הגבלה 10x | 5 μl | |
| 4 יחידות / AvrII μl | 2.5 μl | |
| 20 יחידות / AatII μl | 0.5 μl | |
| DNA להגבלת Digest | נפח עבור 500 ננוגרם | |
| מַיִם | 50 נפח הכולל μl |
הגבלת לוח 7. מעכל. שמות מגיב וכמויות מעכל הגבלה של וקטורים שיבוט וקבוצות תת-ספריה NNS (שלב פרוטוקול 2.3.3).
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ האנזים 10x T4 DNA | 5 μl | |
| DNA קבוצת משנה ספרייה NNS המטוהר מתעכלת הגבלה | נפח עבור 48 ng | |
| DNA וקטור שיבוט מטוהר מתעכלת הגבלה | נפח ל -52 ננוגרם | |
| האנזים דנ"א 400 יחידות / T4 μl | 1 μl | |
| מַיִם | עד 20 הנפח הכולל μl |
לוח 8: קשירת שמות מגיב וכמויות קשירה של וקטורי שיבוט עם קבוצות תת-ספריית NNS מתעכל הגבלת ביחס של 1:. וקטור 3: להכניס יחס טוחן (שלב פרוטוקול 2.3.4).
| מֵגִיב | כֶּרֶך | תגובה |
| חיץ 5x PCR | 55 μl | |
| תוסף PCR | 55 μl | |
| 2 מ"מ dNTPs | 27.5 μl | 2 מ"מ כל נוקלאוטיד |
| 2 יחידות / μl DNA פולימרז | 2.75 μl | |
| מַיִם | 113 μl |
לוח 9: ריאגנטים PCR עבור הכנת דוגמאות עבור רצף תפוקה גבוהה. שמות מגיב וכמויות להכנת מאסטר PCR תערובות המשמש דה-ריבוב עם פריימרים אורתוגונלי (4.1.1), לבודד קבוצות תת-ספריה NNS (שלב פרוטוקול 4.1.2) והוספת רצפי אינדקס (פרוטוקול צעד 4.1.3). הכמות הכוללת מספיקה 11 25 תגובות μl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנה פרוטוקול מתואר לביצוע ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי כולה חלבון, באמצעות טכנולוגיית ריצוף תפוקה גבוהה. היבט חשוב של השיטה הוא השימוש פריימרים מאונך במהלך תהליך השיבוט. בקצרה, כל עמדת חומצת אמינו היא אקראית על ידי מוטגנים PCR, ו מעורבת יחד לקבוצות של עמדות בשילוב שאורך רצף לאכלס ידי רצף תפוקה גבוהה. קבוצות אלו הן משובטות לתוך וקטורי פלסמיד המכילים זוגות של אתרים יחולו מאונכים, מעורבבים יחד נתון לבחירה, אז דה-מרובב באמצעות פריימרים המאונכים, ובהמשך בהקפאה עמוק רצף. מאז מוטציות מתוחמות בתוך הרצף לקרוא הגבלת אורך, גישה זו מגדילה את המספר שימושי קורא המכיל מוטציות גנים של גודל יותר מאשר הרצף לקרוא אורך. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת את הבחירה בו זמנית או "חד-יצווה" של mutatio כולוספרייה סופית, הפחתת עומס העבודה, כמו גם את האפשרות כי מוטציות לחוות רמות של בחירה שונות. למעשה, את השלבים הקריטיים בארגון דאגה בעיקר פרוטוקול: במהלך תהליך השיבוט (שלב פרוטוקול 2.3) אחד חייב להבטיח הערבוב הנכון של מוצרי PCR מוטגנים לקבוצות השיבוט הבא שלהם לתוך הווקטור מאונך יחולו אתר הנכון; במהלך תקופת ההכנה של המדגם עבור סידור (שלב פרוטוקול 4.1), פריימרים המאונכים הנכונים, כמו גם פריימרים לבודדים כל אחת מהקבוצות תת-ספריית NNS ולהוסיף רצפים לאינדקס, חייב לשמש.
השלושה השלבים העיקריים של הפרוטוקול - בניית ספרייה, מבחר, וסדר - ניתן לשנות בכמה היבטים. באחת בניית ספרייה יכול להציג מוטציות תוך שימוש במגוון של טכניקות, למשל, על ידי מועדת לטעויות PCR, או על ידי בניית הגן באמצעות oligonucleotides מסונתז על ידי סימום בשבריר קטן של נוקלאוטיד החלופיזה 21. אפשר לבנות את הספרייה לכלול מוטציות כפולות או מסדר גבוה בתוך מגזרים של החלבון (כלומר, NNS תת-ספריית קבוצות), או רקע גנוטיפ חלופי 22. חשוב לציין, כל השינויים לשלב בניית ספרייה עם זאת צריכים לספק את הקריטריון הקובע את התכתובת בין המיקום של מוטציות ברצף ואת הרצף לקרוא אורך נשמר. קריטריון זה מוציא אם כך, היישום של הפרוטוקול כלפי מחקרים מקיפים של מוטציות רבות על פני חלבון. עשיית שינויים בחלק השני של הפרוטוקול כוללים תנאי בחירה חלופיים: (. למשל, טמפרטורה, רמות חומרים המזינים) סוגים β-לקטם שונים (או שילובים) וריכוזיים, בתנאי עקה חיצוניים, סוג המארח (למשל, סוגים שונים של חיידקים), או פעמי דגימה שונות (שעות עד ימים). לדוגמה, בעבודה הקודמת בחנו את ההשפעות הכושר של כל המוטציות חומצה אמינית בודדתב TEM-1 תחת ריכוזים שונים של אמפיצילין, ותחת cefotaxime צפלוספורין הדור השלישי 13. באשר לשלב השלישי של הפרוטוקול, אנחנו כרגע לא ממליצים לסטות הבחירה של פלטפורמת הרצף משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים). בעוד רצף לקרוא אורכים אכן כבר כיום פלטפורמות אחרות, מספר הקורא בר השגה היא כיום נמוך בהרבה; בכלל לדיוק שאליו השפעת מוטציה ניתן לקבוע הוא פרופורציונאלי למספר של קורא שהושג (ראה משוואה בשלב פרוטוקול 4.2.5).
בעיקר לפשטות, הפרוטוקול משתמש β-lactamase TEM-1 כמערכת מודל, אולם המתודולוגיה המתוארת כאן ניתן להרחיב למערכות אחרות עבורו מבחר תפוקה גבוהה או assay הקרנה הוא במקום. בניית מבחנים כזה היא אולם לעתים קרובות לא טריוויאלית: ראשית, אסטרטגיה עבור מידור של גן (מוטציה) וחלבון יחד יש להקיםלמשל בתוך תא, אגל נוזל (כמו פלטפורמת מיקרופלואידיקה), או על ידי תצוגה הפאג. שנית, והכי חשוב, חיבור כמותי בין תפקוד החלבון ו פנוטיפ לבחירה, או כושר, יש להקים. עבור אנזימים המעורבים במטבוליזם או עמידות לאנטיביוטיקה, את היכולת של תאים לגדול נשירה מזינה או תקשורת אנטיביוטיה היא לעתים קרובות פונקציה ישירה של פעילות האנזימטית. גישה סינטתית יותר אפשר להשתמש במערכות אחרות, למשל על ידי קישור בין חלבונים מחייב זיקת גן כתב (למשל., חלבון פלואורסצנטי) ביטוי בחיידקים או שמרים 11,23, או באמצעות מצע אנזים fluorogenic במערכת מיקרופלואידיקה 24 . לבסוף, כזה assay חייב להיות מדרגים, להתייחס בגודל של ספריית mutagenesis כל-חלבון.
לסיכום, רצף מבוסס תפוקה גבוהה גישה עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי כולה חלבון הוא described כאן. מרכז הגישה היא הבנייה של ספריית mutagenesis בתוך מגזרים לאורך הגן, ואת הניצול של ברקודים פריימר המאונכים לתייג כל פלח עבור ריבוב ריבוב דה הספרייה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לחלבונים אחרים עבורו מבחר תפוקה גבוהה מתאים או מסך פותחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
