Summary
معرض تخديره من الفئران غير الفسيولوجية ضغط الدم النظامية، مما يحول دون تقييم حقيقي للهجة اللاإرادي ونظرا للعلاقة الحميمة بين ضغط الدم والجهاز العصبي اللاإرادي. وهكذا يرد طريقة جديدة لنشاط العصب متعاطفة مع الكلي في وقت واحد تسجيل وضغط الدم مع التسريب الوريدي في الفئران واعية.
Abstract
الأعصاب متعاطفة الكلوي تساهم الظواهر الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية على حد سواء. تقييم نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) ذو أهمية كبيرة في العديد من مجالات البحوث مثل مرض الكلي المزمن وارتفاع ضغط الدم، وقصور القلب، والسكري والسمنة. وهكذا لا لبس فيه تقييم لدور النظام العصبي الودي أمر حتمي للتفسير السليم للنتائج التجريبية وفهم عمليات المرض. وقد تم قياس رسنا تقليديا في تخديره من القوارض، بما في ذلك الفئران. ومع ذلك، الفئران عادة ما يحمل ضغط الدم الجهازية منخفضة جداً وعدم الاستقرار الفسيولوجية لعدة ساعات أثناء التخدير والجراحة. هو مرتبك تفسير معنى رسنا بهذه الدولة غير الفيزيولوجية، ونظرا للعلاقة الحميمة بين لهجة متعاطفة مع الجهاز العصبي ومركز القلب والأوعية الدموية. لمعالجة هذا القيد من النهج التقليدية، قمنا بتطوير أسلوب جديد لقياس رسنا في الفئران واعية، وتتحرك بحرية. تم تجهيزها الفئران مزمنة مع راديو-تيليميتيرس للرصد المتواصل لضغط الدم، فضلا عن قسطرة الحقن الوريدي جوجولار أ والقطب القطبين مصممة خصيصا للتسجيل المباشر رسنا. وعقب فترة استرداد 48-72 ساعة، معدل البقاء على قيد الحياة 100% وتصرف جميع الفئران عادة. في هذه النقطة الزمنية، سجلت رسنا بنجاح في 80 في المائة فئران، مع إشارات قابلة للحياة الحصول على ما يصل إلى 4 و 5 أيام ما بعد الجراحة في 70% و 50% من الفئران، على التوالي. سجلت فسيولوجية الدم الضغوط في جميع الفئران (ملم زئبق 116±2; n = 10). زيادة رسنا مسجل مع الأكل والاستمالة، كما الراسخة في الأدب. وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة رسنا بالحصار جانجليونيك والتحوير لضغط الدم مع وكلاء الدوائية. ويرد هنا، طريقة فعالة وقابلة للإدارة لتسجيل واضح من رسنا في الفئران واعية، وتتحرك بحرية.
Introduction
الاهتمام باستخدام الفئران في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية يواصل توسيع مع تطوير نماذج المهندسة وراثيا لا حصر لها. للجزء الأكبر، التقدم التقني قد تواكب الزيادة في استخدام الفئران في علم وظائف الأعضاء، وهناك الآن مجموعة رائعة من الأجهزة المنمنمة التي وضعت خصيصا لقياس البارامترات الفيزيولوجية الهامة في الفئران. على الرغم من توجيه أجهزة القياس البعدي لقياس اللاإرادي لهجة العصبية في الفئران واعية كانت متاحة لأكثر من عقد، والأجهزة المنمنمة لتقييم نشاط العصبية في الفئران واعية غير متوفرة حاليا. المحققون عادة الالتفاف حول هذا القيد بتقييم إسهام العصبي المستقل بطرق غير مباشرة (أي الكاتيشولامين البلازما أو البول، الحصار اللاإرادي الدوائية، والتحليل الطيفي لأنماط من الدم معدل الضغط/القلب)1.
في حين توفر هذه النهج معلومات قيمة، والنتيجة صورة عالمية للهجة اللاإرادي عموما، بدلاً من الكشف عن مساهمة متميزة للسكان المعزولين للأعصاب للظاهرة قيد التحقيق. بدلاً من ذلك، تم تنفيذ التسجيل المباشر للنشاط من أعصاب محددة في تخديره من الفئران، التي يشكل عدد وافر من الشواغل. من الصعب جداً للحفاظ على استقرار ضغط الدم ضمن نطاق الفسيولوجية في ماوس أنيسثيتيزيد لعدة ساعات بعد الجراحة. وفي الواقع، في هذه الأنواع من التجارب، ضغط الدم غالباً ما غير المنظم أو عرضت على مستويات منخفضة للغاية (أي 60-80 مم زئبق مقابل > 100mmHg في ماوس واعية)2. هشاشة الأوعية الدموية معروضة في إعداد ماوس تخديره وكثيراً ما يحول دون تقييم حقيقي لنشاط العصب اللاإرادي، نظراً للعلاقة كوديبيندينت بين ضغط الدم ولهجة متعاطفة مع3، 4.
لمعالجة هذا القيد، أسلوب جديد للتسجيل المباشر لنشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) في واعية، وضعت الفئران غير المقيد، دون عائق داخل اقفاصها المنزل. يتم وصف كل النهج الجراحية والتجريبية لتنفيذ هذه التقنية بنجاح بالتفصيل. يمكن إعداد هذا المحقق تسجيل الضغط الشرياني عن طريق راديوتيليميتري بالإضافة إلى رسنا، مع القدرة على إضافة لبث وكلاء للفائدة عن طريق الوريد دون الإخلال بالماوس في وقت واحد.
أربع وعشرين ساعة بعد الجراحة، الفئران تتصرف بشكل طبيعي ولا يحمل علامات الألم أو المعاناة. ويجوز أن تبدأ التسجيلات التجريبية ثم 48 إلى 72 ساعة بعد عملية جراحية حين تقع الماوس بشكل مريح في قفصة المنزلية بالوصول غير المقيد إلى الغذاء والماء والإثراء البيئي. تعرض آثار رسنا واضحة وأظهرت الردود المميزة من هذا السكان العصب للحركات البدنية العادية للحيوان (مثل الأكل والاستمالة) بالإضافة إلى تعديل الدوائية لضغط الدم النظامية. كذلك صحة نوعية وخصوصية إشارة رسنا بالحصار جانجليونيك. وتشمل هذه المخطوطة تكملة السمعي البصري لوصف نشرت في البداية لهذا الأسلوب5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة الإجراءات التجريبية وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وأقرتها لجنة الاستخدام من المركز الطبي في جامعة ميسيسيبي ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-الحيوانات والإسكان
- بيت الفئران (24-35 غ) لدى وصوله إلى مرفق الحيوانات المختبرية المؤسسية.
- توفر الفئران تشاو القوارض القياسية وماء الصنبور ad متواصلة في جميع مراحل البروتوكول التجريبي في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة والرطوبة.
2-تخصيص تلفيق مسرى رسنا القابلة للغرس
ملاحظة: بناء مسرى رسنا القابلة للغرس على الأقل بضعة أيام قبل العملية الجراحية المقررة لاستيعاب وقت المعالجة والتعقيم (الموصوفة أدناه).
- قطع ثلاثة أطوال متساوية من الفولاذ المقاوم للصدأ معزول الأسلاك متعددة-الذين تقطعت بهم السبل، 250 ملم (قطر السلك مم 0.0254 العارية، 0.14 ملم المغلفة). استخدام شفرة المبضع (يفضل أن يكون #11) إلى تجريد حوالي 15 ملم المواد العازلة للكشف عن المعادن الأساسية من طرف واحد لكل من أطوال الأسلاك.
- لحام موصل واحد دبوس ذكور (النحاس الأواني المطلية بالذهب) إلى نهاية البارد سوى اثنين من الأسلاك لإنشاء يؤدي ثنائي القطب الكهربائي (الشكل 1A). إجازة نهاية الثالثة طول الأسلاك العارية. هذا وسوف تعمل كالسلك الأرض.
- كشف قصيرة (~2.0-2.5 سم) قطعة من أنابيب انكماش قطرها 1.6 ملم على دبوس موصل والأسلاك تغطي كامل المشترك ملحوم حديثا بين موصل سلك ورقم التعريف الشخصي.
ملاحظة: يجب أن تظل مكشوفة غيض الموصل pin الذي سوف يكون موصول هيدستاجي مكبر للصوت. - أمسك السلك أعلاه بندقية حرارة مع زوج من كماشة صغيرة أو هيموستاتس إلى تقليص أنابيب حساسة للحرارة وعزل الاتصال بين الموصل pin والسلك الكهربائي. كرر هذه العملية لموصل سلك/دبوس الثاني.
- قص بطول 200 ملم من أنابيب البولي إيثيلين (PE 90؛ والقطر الداخلي 0.86 مم، القطر الخارجي 1.27 ملم). تجميع الأسلاك الثلاثة (اثنان يؤدي + سلك الأرضي) وإدخال نهايات متأثر في الأنبوب PE 90، خيوط لهم معا عن طريق إلى النهاية المفتوحة للأنابيب (الشكل 1B).
ملاحظة: 90 PE أنابيب مهام غمد المجموعة وحماية مسرى يؤدي وسلك الأرضي.- تحديد السلك الأرض وتسحبه عن طريق غمد PE 90 قليلاً إضافية لتمييزه عن العملاء المتوقعين ثنائي القطب الكهربائي.
3-بناء طرف القطب
- تصور نهايات الأسلاك الكهربائي متأثر مجهر تشريح. الموضوع ينتهي فضفاض ثلاثة القطب من خلال 5 مم-قطعة طويلة أصغر الأنابيب المصنوعة من البولي إيثيلين (PE 10، القطر الداخلي 0.28 ملم، القطر الخارجي مم 0.61) لربط الأسلاك الكهربائي معا.
- الخيط قطعة 1.5 مم من هذه الأنابيب PE 10 على الأسلاك الثلاثة القطب. النهوض بهذه الأنابيب لبقية 2.0 ملم بعيداً عن قطعة الأولية 5 مم من PE 10.
- الموضوع ثاني قطعة 1.5 مم من أنابيب PE 10 على النصائح من العملاء المتوقعين القطبين القطب اثنين لتغطية وعزل النصائح وفصلها عن الأسلاك الأرضية (الشكل 1).
- تقليم أي الطول الزائد للأسلاك مع المقص.
- الصق القطع الفردية من الأنابيب PE 10 إلى الأسلاك الكهربائي مع قطره صغيرة من الغراء السائل cyanoacrylate الصيغة. ضع إبرة قياس 25 يتثلم في نهاية أنبوب الغراء لتحسين المراقبة والحد من الانسكاب.
- ضع طرف الإبرة على مفترق الطرق بين PE 10 والأسلاك، ثم الاستغناء عن قطره صغيرة من الغراء ووضع تصور للغراء طلاء داخل الأنبوب PE.
- تسمح الغراء تماما علاج بين عشية وضحاها.
4-غرامة إعداد طرف القطب للتسجيل
- قطاع الطلاء العازلة من نصائح القطب الثنائي القطب وغيض من السلك الأرض مع شفرة المبضع #11. عدم الإزعاج أو الأضرار الكامنة وراء أسلاك تقطعت بهم السبل متعددة كهذا سوف يؤثر جودة الإشارة رسنا.
- قبضة مسرى شيدت بين 5.0 ملم والمراسي 1.5 ملم PE 10 مع منحنى ملقط والانحناء الأسلاك لتشكل زاوية 90 درجة (الشكل 1).
ملاحظة: ينبغي أن موقف هذه المناورة يؤدي ثنائي القطب الكهربائي أعلاه السلك الأرض، في وضع أمثل لمهد حزمة الأعصاب.
5-بناء قاعدة التمثال ترسيخ
- بناء قاعدة التمثال لتحقيق الاستقرار الكهربائي يؤدي إلى منطقة منتصف المنكب الماوس عند اكستيريوريزيشن بقطع قطعة 3 سم من أنابيب البولي إيثيلين (القطر الداخلي 2.70 ملم، القطر الخارجي 4.00 ملم).
- قبضة الأنابيب مع الملقط وتذوب نهاية واحدة على بندقية حرارة. اضغط end ساخنة من أنابيب خط عمودي على سطح معدني بارد لإنشاء سلسلة من التلال مدورة أو "الحافة".
- مؤشر الترابط هذا التمثال على مسرى المركبة، مثل أن يشير الشفة تجاه طرف القطب.
ملاحظة: التركيبة من غمد PE 90 ورمي ستحمي يؤدي القطب اكستيريوريزيد مرة من الحيوان.
6-تعقيم مسرى القابلة للغرس المكتملة
- حزمة مسرى المنجزة فردياً في أكياس التعقيم والأوزون تعقيم (تسو3) قبل غرس.
ملاحظة: التشاور مع مرفق تعقيم المستشفى المحلي فيما يتعلق بنوع معين من التعقيم الحقيبة وإجراء كهذا يختلف بين المؤسسات.
7-التخدير والتحضير لعملية جراحية
- إدارة التسكين 20 دقيقة قبل بدء الجراحة (ميلوكسيكام 2 مغ/كغ، الليبي). ضع الماوس في دائرة التعريفي يملؤه الأكسجين الطبي الصف 100%. ضبط إعدادات المبخر لزيادة النسبة المئوية ل isoflurane مخدر في زيادات بمقدار 0.5 لتصل إلى 4%. تقييم الطائرة الجراحية بتقييم استجابة منعكس لضغط لطيف تطبيقه على أصابع القدم أو منصات القدم للصدارة وهند الأطراف فضلا عن تباطؤ في معدل التنفس.
- نقل الحيوانات إلى طاولة العمليات الجراحية والحفاظ على التخدير مع isoflurane 1.5 إلى 2 في المائة عن طريق نوسيكوني حالما وصلت الطائرة الجراحية ولم يعد يسلك منعكس تو-رشة. كرر الرد تو-رشة بشكل دوري وتقييم معدل التنفس طوال الإجراءات الجراحية بأكملها. تطبيق مرهم العيون إلى العيون لمنع جفاف.
- الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية للحيوان في جميع الأوقات مع منصات مملوءة هلام الحرارة متحاور والجدول المقابل الجراحية. تخزين منصات متحاور في حمام مائي 37 درجة مئوية واستبدال منصات غالباً حسب الحاجة أثناء الجراحة للحفاظ على درجة حرارة الجسم الفسيولوجية.
- إدارة جليكوبيرولاتي (50-70 ميكروغرام/كغ، تحت الجلد (الليبي)) لمنع الإفراط في إنتاج من إفرازات مجرى الهواء فور التعريفي للتخدير. إدارة هذه الجرعة من جليكوبيرولاتي مرة ثانية في منتصف العملية الجراحية (9.1 الخطوة).
- إجراء جميع العمليات الجراحية تحت ظروف معقمة. ضمان جميع الأدوات الجراحية قد يعقم قبل الجراحة المجدولة. تنظيف الحقل الجراحي كما هو موضح أدناه (7.2.1) والحفاظ على العقم طوال فترة الإجراءات.
- ارتداء قناع لوجه وعزل يعقم بثوب وقفازات معقمة، وتستخدم مرة واحدة. قم بتنظيف جميع المعدات الكبيرة مثل مصباح gooseneck، تشريح النطاق والجدول الجراحية مع الإيثانول 70%. بشكل دوري أثناء الإجراء، تطبيق الإيثانول 70% للقفازات الجراحية لضمان العقم.
- إزالة الشعر من الجناح الأيسر للحيوان ومنطقة الرقبة البطني ومنطقة ميدسكابولار الظهرية مع مقص الشعر الحيوانات الصغيرة تليها كريم مزيل الشعر (صيغة حساسية الجلد).
- تطهير الجلد من هذين الحقلين الجراحية مع 3 تطبيقات لحل التطهير الجراحي بالتناوب (10 ٪ اليود البوفيدون) و 70% إيثانول. إعداد الميدان الجراحية مع تطبيق نهائي لحل التطهير الجراحي.
8-العمليات الجراحية زرع مسرى رسنا
- ضع الماوس على الجانب الأيمن مع نهاية روسترال مشيراً إلى اليسار للجراح، وفضح الجناح الأيسر للحيوان. جعل شق 5 ملم في جلد منطقة ميدسكابولار مشرط (رقم 11).
ملاحظة: هذا هو الموقع الذي سوف اكستيريوريزيد رسنا القطب العملاء المتوقعين.- جعل شق ثان (< 20 مم) في الجلد تغمر الجناح الأيسر، عمودي للعمود الفقري ووالذيليه إلى القفص الصدري 2 مم. نفق فولاذ المقاوم للصدأ ز 13 إبرة تحت الجلد من هذا الشق للشق في موقع خروج الظهرية.
ملاحظة: ملف حواف حادة من الإبرة لمغادرة على نحو سلس، غير المتطورة. - تمر الإبرة ز 13 مسرى رسنا القابلة للغرس معقمة (الخطوات 2-6). سحب الإبرة ز 13 مرة أخرى ترك تلميح القطب الكذب في عضلة البطن من الجهة اليسرى. ترك شريحة من العملاء المتوقعين القطب الكذب تحت الجلد، وترك أطوال المتبقية الخارجة من شق الظهرية.
- جعل شق ثان (< 20 مم) في الجلد تغمر الجناح الأيسر، عمودي للعمود الفقري ووالذيليه إلى القفص الصدري 2 مم. نفق فولاذ المقاوم للصدأ ز 13 إبرة تحت الجلد من هذا الشق للشق في موقع خروج الظهرية.
- ضع طرف القطب إلى الجانب. إجراء شق في عضلة البطن مباشرة الكامنة وراء شق الجلد في 8.1.1. فصل الدهون والنسيج الضام على طول العضلات مرة أخرى مع قضيب القطن ذات الرؤوس الصغيرة تطبيق لفضح الكلي اليسرى.
- فتح الحقل الجراحي مع مايكرو-الكامشات وسحب الكلي. القيام به لا لتمتد الباقة neurovascular الكلي، الذي لا رجعة فيه تلف الأعصاب الكلوية ويحول دون تسجيل إشارة رسنا قابلة للحياة.
ملاحظة: يمكن أن تصاغ الصلب الصغيرة-الكامشات من قصاصة ورق قياسية وطول من الحرير 4-0. ضمان هذه الكامشات يتم تعقيمها أيضا مع الأدوات الجراحية حفاظا على الأسلوب العقيم.
- فتح الحقل الجراحي مع مايكرو-الكامشات وسحب الكلي. القيام به لا لتمتد الباقة neurovascular الكلي، الذي لا رجعة فيه تلف الأعصاب الكلوية ويحول دون تسجيل إشارة رسنا قابلة للحياة.
- تصور حزمة neurovascular الكلي مع المعونة من قوة عالية تشريح مجهر. تحديد حزمة العصب الكلوي، الذي يمتد عادة (ولكن ليس دائماً) إلى جانب الشريان الكلوي والوريد. تشريح العصب حزمة من الأنسجة المحيطة بالملقط غرامة، على التوالي.
ملاحظة: حزمة العصب الكلوي تظهر معتمة، مع "حبل مثل" تعكس مظهر، فريدة من نوعها مقارنة بالأوعية اللمفاوية، التي تبدو واضحة.- معالجة حزمة الأعصاب بأقل قدر ممكن. لا تعمل باللمس، وتمتد أو التقاط الحزمة العصبية في أي وقت. عدم تعطيل غرامة الأوعية الدموية تمد العصب، أو القناة اللمفاوية الكلوية لأن هذا سوف يعرض للخطر بقاء العصبي وتنتج تجميع السوائل الليمفاوية المستمر حول العصب/مسرى، التي سوف تعرقل أو طمس تماما الإشارة العصبية.
- إجازة حزمة الأعصاب الكلوية سليمة، مما سيساعد على الحفاظ على الاستمرار في الأجل الطويل للعصب، فضلا عن البقاء على اتصال مستقرة بين العصب ومسرى (أي قد كشف عصب مقطعة الخروج من أقطاب مع الوقت وحركات الجسم الطبيعية).
- إدخال تلميح القطب رسنا في البطن. تعديل موقفها أن السلك نصيحة والأرض ثنائي القطب الكهربائي متعامدة حزمة neurovascular الكلوي. كذلك ضبط موضع القطب أن السلك الأرض لديها اتصالات جيدة مع الأنسجة الكامنة ومسرى لا ضغط الأوعية الكلوية، المساس بالتداول الكلي (الشكل 1).
- رفع الحزمة العصبية الكلوية مع الملقط الزاوية. كشف طرف القطب تحت العصب، ترك العصب في اتصال مباشر مع كل الأسلاك.
- تنزلق قطعة صغيرة من الفيلم البارافين بين الأسلاك العصبية/القطبين والسلك الثالث (الأرض) (الشكل 1).
ملاحظة: تعقيم نقع الفيلم البارافين في الإيثانول 70% لمدة 24 ساعة والشطف في المحلول الملحي الفيزيولوجي معقمة قبل غرس. - إزالة أي الدم أو السائل من حول العصب/مسرى مع ماصة صغيرة سبيرز كأي سائل غادر حول العصب أو أسلاك الكهربائي سوف تعرقل أو إطفاء الإشارة العصبية.
- اختبار جودة الإشارة رسنا بسرعة إذا رغبت (الإعداد المبينة أدناه).
ملاحظة: يجب أن يتم هذا بسرعة التعرض للهواء سوف الجاف للأعصاب وخرق قدرته على البقاء. - تطبيق الاستومر سيليكون المكون الثاني الوحدة العصبية/القطب، ضمان أن مجمعات سيليكون تحت وحول العصب لتوفير العزل الكهربائية كاملة (أي ليس مجرد قطره على رأس العصب).
ملاحظة: تأكد من نصائح القطب أيضا المغلفة في السيليكون. السلك الأرض ينبغي أن تظل على اتصال بالانسجة الكامنة، وهكذا لا تحتاج الاستومر إلى تجمع تحت هذا السلك. تجنب تطبيق مبلغ كبير دون داع من الاستومر السيليكون، كهذا يمكن أن يحتمل أن تعرقل تدفق الدم الكلوي، أو تصبح فكها مع حركات الجسم الطبيعية مع مرور الوقت. - يسمح 1-2 دقيقة الاستومر السيليكون لعلاج تماما، ثم بعناية مع الملقط رفع الحواف الخارجية سيليكون "غلوب" وتنطبق على كمية صغيرة من السائل اللاصق الجراحي الصيغة.
ملاحظة: الحرص على عدم تطبيق كمية زائدة من هذا الغراء، كما أنه قد يضعف الدورة الدموية أو ينتشر إلى العصب وخرق قدرته على البقاء.
- تنزلق قطعة صغيرة من الفيلم البارافين بين الأسلاك العصبية/القطبين والسلك الثالث (الأرض) (الشكل 1).
- إغلاق شق البطن مع خيوط متقطع، قابلة للامتصاص (5-0). إغلاق الجلد السطحية بطريقة مماثلة مع مواد خياطة الجروح نفسها.
9-غرس راديوتيليميتير ضغط الدم
- قم بتغيير موضع الماوس على ظهرها، مع نهاية روسترال مشيراً نحو الجراح. ضبط نوسيكوني التخدير حسب الحاجة. إدارة الجرعة الثانية من جليكوبيرولاتي عند هذه النقطة (انظر 7.1.3).
- جعل خط الوسط شق في الجلد في منطقة الرقبة مع مشرط (رقم 11)، بدءاً من أسفل الفك السفلي للحيوان وتوسيع فقط أعلاه القفص الصدري. فصل الأنسجة الغدية لفضح عضلات الرقبة الكامنة. كشف الشريان السباتي المشترك الأيسر وفصل من الأنسجة المحيطة.
ملاحظة: رعاية كبيرة لا إتلاف العصب المبهم وهذا يمكن أن يؤدي إلى زيادة في معدل الوفيات بعد الجراحة.- تمرير ثلاث قطع من المادة 6-0 خياطة الحرير تحت الشريان. ضع خياطة واحدة روسترالي إلى أقصى حد ممكن، والتعادل على أوككلودي السفينة. وضع خياطة ثانية في منتصف الطريق على طول السفينة وربطه عنق فضفاضة. وضع خياطة الماضي كاودالي ممكن وربطه عنق فضفاضة.
- التراجع عن خياطة روسترال معظم وآمنة إلى نوسيكوني مع قطعة صغيرة من الشريط الحبل السري. التراجع عن خياطة والذيلية معظم مع الملقط الصغير-البعوض لتقييد تدفق الدم في السفينة.
- جعل شق صغير في جدار السفينة مع مقص الربيع الجميلة روسترالي قدر الإمكان. إدخال قسطرة راديوتيليميتير ضغط الدم الماوس في السفينة ومقدماً لخياطة والذيلية.
- التعادل خياطة الأوسط مؤقتاً لتثبيت القسطرة، والإفراج عن سحب والذيلية والنهوض بالقسطرة 10 مم. خياطة ربطه عنق حول القسطرة في مكان أمن.
- نفق للجسم تيليميتير لجيب تحت الجلد على طول الجناح الأيمن.
10-غرس واكستيريوريزيشن من القسطرة الوريدية جوجولار
- استخدم قضيب تطبيق صغير القطن ذات الرؤوس لفضح الحق حبل الوريد. حول السفينة، تمرير قطعتين من مواد خياطة الحرير 6-0.
- وضع خياطة واحدة قدر روسترالي قدر الإمكان، والتعادل أوككلودي السفينة. وضع خياطة الثانية كودالي ممكن وتتراجع برفق لوقف تدفق الدم في السفينة.
- استخدام مقص الربيع الجميلة جعل شق صغير في جدار السفينة قريبة من خياطة روسترال قدر الإمكان. كاثيتيريزي في الوريد مع أنابيب تمتد الحرارة (نقلت 1.02 مم، امتدت إلى OD 0.64 ملم)، وهو ما قبل مليئة بالمحلول الملحي الفيزيولوجي معقمة.
ملاحظة: تأكد من قطع طرف القسطرة مع مشرط لإنتاج المجسم مشطوف الحواف مدورة لمنع ثقب السفينة. تحديد حجم السائل في القسطرة (الفضاء الميت) للرجوع إليها (انظر الخطوات 14.4-14.6 أدناه).- تقدم القسطرة ~ 8 ملم في هذا السياق. تأمين القسطرة بربط خيوط الحرير حول السفينة والقسطرة، فضلا عن تطبيق قطره صغيرة من هلام cyanoacrylate الصيغة الغراء.
- ضع الماوس على جانبها الأيسر. نفق القسطرة الوريدية من الرقبة للخروج في المنطقة الظهرية ميدسكابولار باستخدام إبرة فولاذ المقاوم للصدأ ز 13.
- تغيير موضع الماوس على ظهره. إغلاق شق الرقبة مع خيوط متقطع.
- وضع الحيوان في موقف المعرضة. مؤشر ترابط زر صغير تحت الجلد على القسطرة الوريدية. تأمين الزر تحت الجلد بخياطة الجروح. الموضوع ربيع الفولاذ المقاوم للصدأ المقابلة عبر القسطرة الوريدية وتأمينه إلى زر الجلد لحماية القسطرة.
11-تأمين القطب اكستيريوريزيد يؤدي
- تأمين حماية التمثال البولي إثيلين الكهربائي يؤدي إلى العضلات الأساسية مع لاصق الأنسجة. خياطة الجلد السطحية على شفة لمزيد من الدعم.
12-بعد الجراحة الانتعاش
- تطبيق مرهم مضاد حيوي لجميع شقوق.
- إدارة دواء مسكن. إدارة جرعة إضافية من دواء مسكن حسب الحاجة أثناء فترة الاسترداد إذا كان الحيوان تظهر علامات الألم أو المعاناة.
- ضع الماوس في قفص ايضية مبطنة برقائق الخشب الفراش ومنشفة ورقية لاسترداد. مراقبة الحيوان بشكل مستمر ولا تترك غير المراقب حتى يستعيد وعيه ويمكن الحفاظ على ريكومبينسي القصية. إدخال الإثراء البيئي والأغذية والمياه (ad libitum) عند هذه النقطة.
- ويؤدي اللولب الكهربائي خارج القفص حتى وقت التجربة.
- ضع القفص على منصة حرارة دافئة خلال ال 24 ساعة الأولى من الانتعاش. قم بتوصيل الربيع الفولاذ المقاوم للصدأ والقسطرة الوريدية نظام قطب/ضخ للتسريب المستمر من المحلول الملحي الفسيولوجي أثناء فترة الاسترداد (0.5 مل/ساعة).
- ضمان بقاء الحيوان مساكن منفردة في قفص مخصص نظراً لطبيعة القسطرة اكستيريوريزيد ويؤدي القطب.
13-التجريبية الإعداد لتسجيل ضغط الدم ورسنا
- تجهيز فولاذ المقاوم للصدأ أعلى جدول المضادة اهتزاز مع قفص فاراداي بسيطة.
ملاحظة: يمكن بناء قفص فاراداي هذا مع شبكة شاشة الإطار والألومنيوم خشبي. كهربائياً أرضية القفص الجدول/فاراداي للقضاء على أي الضوضاء الكهربائية. - ضع جهاز استقبال راديوتيليميتري ضغط الدم داخل قفص فاراداي.
- الاتصال المتلقي راديوتيليميتري بمحول الإخراج الضغط المرتبطة بها. قم بتوصيل هذا المحول إلى نظام الحصول على بيانات لسجل ضغط الدم على الإنترنت.
- لحام موصلات دبوس الإناث اثنين التي مجانية على موصلات دبوس الذكور قطب كهربائي (النحاس الأواني المطلية بالذهب) إلى نهايات البلاستيكية المزدوجة، محمية عزل الكابل. جندي طرفي نقيض من هذه الكابلات المزدوجة للموز المقابس. قم بتوصيل المقابس الموز هيدستاجي بريامبليفيكيشن (10 X التضخيم).
- قم بتوصيل هذا المضخم مكبر للصوت تفاضلية. ضبط الإعدادات لتضخيم إشارة العصب x10، 000. ضبط إعدادات عامل التصفية على النحو التالي: قص منخفض، 100 هرتز؛ قص عالية، 1000 هرتز.
- ضع القفص الصفحة الرئيسية التي تحتوي على الماوس على جهاز الاستقبال راديوتيليميتري تقع داخل قفص فاراداي 48 إلى 72 ساعة بعد الجراحة. قم بتشغيل المسبار راديوتيليميتري لتسجيل إشارات ضغط الدم.
ملاحظة: التأقلم الماوس بوضع القفص المنزل في الإعداد على مدى أسبوع واحد قبل الجراحة الأمثل. - تفك يؤدي الكهربائي وقم بتوصيل موصلات دبوس القطبين القطب المقابل موصلات دبوس الإناث الموصوفة أعلاه (13.4) لبدء تسجيل رسنا.
- عرض، وفي نفس الوقت تسجيل إشارات ضغط الدم على الإنترنت مع جهاز كمبيوتر، بينما غرس المحلول الملحي الفيزيولوجي أو الحل للفائدة. سجل البيانات بمعدل الحد أدنى من عينات 2500 في الثانية الواحدة.
14-نموذج البروتوكول التجريبي والتحقق من إشارة رسنا
- ضمان الفئران مريحة في قفص المنزل بهم، غير المقيد مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. اتبع المبادئ التوجيهية مؤسسات الرعاية الحيوانية للتحقق من المظهر الطبيعي والسلوك.
- بيت الفئران في نفس درجة الحرارة والرطوبة الخاضعة للغرفة في رسنا التي سيجري تسجيل. ضمان استمرار التسريب الوريدي كما هو موضح أعلاه.
- تسمح 30 دقيقة على الأقل لتحقيق الاستقرار بمجرد الحيوان يقع في تسجيل الإعداد المذكورة أعلاه قبل تسجيل ساعة واحدة لضغط الدم خط الأساس والبيانات رسنا. ضمان هو يستريح الحيوان بهدوء أثناء تسجيل منذ الحركة الطبيعية ويرتبط مع زيادة في لهجة متعاطفة. ملاحظة عندما يتحرك الحيوان مباشرة على التتبع الرقمي أثناء تسجيل حتى هذا يمكن تجاهلها أثناء التحليل.
- اختبار استجابة باروريفليكس الأولى ببطء حقن بلعه من الصوديوم nitroprusside (2.5 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم في وحدة تخزين 25 ميليلتر من المحلول الملحي) في السطر التسريب. بطء تدفق الخط مع ~ 50 ميليلتر فيزيولوجية المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. سجل ضغط الدم ورسنا لمدة 2 إلى 5 دقائق.
- ببطء حقن بلعه phenylephrine (20 ميكروغرام/غرام من وزن الجسم في 25 ميليلتر من المحلول الملحي). مسح مع ~ 50 ميليلتر فيزيولوجية المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. سجل ضغط الدم ورسنا لمزيد من 10 إلى 15 دقيقة.
- التحقق من طبيعة postganglionic إشارة العصب عن طريق حقن بلعه من مانع جانجليونيك، هيكساميثونيوم (50 ميكروغرام/غرام وزن في 25 ميليلتر الملحية) في خط ضخ ببطء. مسح مع ~ 50 ميليلتر المالحة. تأكد من مسح الفضاء قتيلا القسطرة. مواصلة التسجيل لعدة دقائق.
- استخدم النشاط المتبقية التي لا تزال بعد الإدارة هيكساميثونيوم كتقدير للضوضاء الخلفية لاستخدامها في تحليل رسنا (الموصوفة أدناه).
- Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من إيسوفلوراني (الجرعة تدريجي في زيادات بمقدار 0.5 ما يصل إلى 5 في المائة) ومواصلة تسجيل رسنا زيادة 30 دقيقة. ملاحظة: إشارة المتبقية كما يمكن استخدام كتقدير للضوضاء الخلفية لتحليل رسنا.
15-بيانات التحليل
- استخدام البرمجيات اقتناء البيانات لتحليل ضغط الدم الخام وآثار رسنا.
- دمج رقمياً وتصحيح الموجه كامل التتبع رسنا الخام باستخدام هذا البرنامج. حدد "المطلقة" متكاملة "لإعدادات لا يتجزأ؛ تطبيق وقت اضمحلال مستمر 0.1 ثانية6.
- تحليل الإشارات رسنا المتكاملة (عرض) في وحدات µV·s لكل جزء من البروتوكول التجريبي. تجاهل قطاعات من التسجيل عندما حدث هذا الحيوان لتتحرك. أخذ قياسات على الأقل 3 لخط الأساس وأجزاء تجريبية للتجربة، على التوالي.
- تحليل رسنا على مستوى ضغط الدم الحد الأدنى والحد الأقصى يتحقق nitroprusside الصوديوم أو فينيليفريني، على التوالي، لتقييم حساسية baroreflex.
- متوسط القياسات الفردية المتخذة أعلاه لكل جزء من البروتوكول التجريبي تسفر عن قيمة مفردة.
- قياس الاستجابة رسنا بحساب النسبة المئوية للتغير من رسنا من الأساس، والذي تم تعيينه في 100%7. استكمال التحليل الإحصائي حسب الاقتضاء.
ملاحظة: في هذا المثال، تم تحليل إحصائي لرد رسنا على nitroprusside الصوديوم و phenylephrine مع اختبار t للطالب؛ أهمية وقبلت بقيم P < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وبعد وصف البروتوكول، كان معدل البقاء على قيد الحياة 100%-جميع الفئران تجهيزها في هذه الدراسة ونجا وتعافي تماما بعد العملية الجراحية. خلال 24 ساعة إعداد العمليات الجراحية، الفئران كل تصرف عادة، نستعرض الأكل نموذجي، السلوكيات الاستمالة واستكشافية. الحيوانات لم تظهر أي علامة على الألم أو المعاناة في هذا الوقت. 48 ساعة بعد الجراحة، وسجلت إشارة رسنا واضحة ويمكن التحقق منها في 10 من أصل 12 الفئران. وأبقى على هذه الإشارات في هذه الجراحة بعد 72 ساعة من الفئران، لكن إشارة رسنا صحيح سجلت في 7 (70 في المائة) من الفئران يوم 4 وفي 5 فقط من الفئران (50%) عن طريق الجراحة بعد يوم 5. وكانت الفئران لا يحمل إشارة رسنا عالية جودة بسبب الضوضاء الكهربائية أو التلوث بواسطة إشارات رسم القلب لا تزال في صحة جيدة حتى وقت يوثانيزيشن.
يعني الضغط الشرياني في الجراحة بعد 48 ساعة من الفئران واعية 116±2 ملم زئبق، مع معدل القلب يعني مقابلة 596±22 بي بي أم (n = 10). تسجيل واحد من عينة تمثيلية من ضغط الدم ورسنا في هذا الوقت أظهر رشقات نارية واضحة للعيان وايقاعي مميز من رسنا (الشكل 2). زيادات نموذجية من رسنا المتوقع مع الأنشطة العادية مثل الأكل والاستمالة، كما لاحظ مباشرة ولاحظ أفراد، تم أيضا تقديم (الشكل 3). رسنا عالية الجودة أيضا وسجلت تسلسلياً في 50% الفئران تحت التحقيق يصل إلى 5 أيام بعد إعداد العمليات الجراحية (الشكل 4). ضغط الدم ومعدل ضربات القلب وظلت مستقرة لفترة التحقيق يوم 5 وقيم لا تختلف عن تلك التي كنا قد سجلت بعد 10 أيام من التعافي بعد الجراحة (الجدول 1)8.
للتحقق من صحة الإشارة رسنا والتحقق من أن ذلك هو في الواقع العالق مع baroreflex الشرياني، تلاعب ضغط الدم كان عقاقيري مع حقن الوريد الصوديوم نيتروبروسيدي وفينيليفريني. رسنا مميز زيادة استجابة لتخفيض الضغط الشرياني؛ الناجمة عن نيتروبروسيدي الصوديوم على العكس من ذلك، كان إسكات رسنا تقريبا عقب الزيادة الناجمة عن فينيليفريني في الضغط الشرياني (الشكل 5). من الناحية الكمية، nitroprusside الصوديوم انخفض ضغط الدم إلى 62±3 ملم زئبق، التي تقابل رفع رسنا إلى 77±9 في المائة أعلى من مستويات خط الأساس (n = 5؛ ف < 0.05، الشكل 6). وبالمثل، عقب phenylephrine الإدارة والضغط الشرياني التوصل إلى 137±6 ملم زئبق، مما خفض رسنا من 79±2 في المائة أقل من مستوى خط الأساس (n = 5؛ ف < 0.05، الشكل 6). وعلاوة على ذلك، رسنا تماما ألغى بعد الحصار جانجليونيك مع هيكساميثونيوم (الشكل 7)، تحديد طبيعة الإشارات رسنا جانجليونيك بعد.
رقم 1: البناء، وإخضاع مسرى القابلة للغرس الكلوي العصب متعاطفة. تصوير التخطيطي تصميم وتنسيب الموصى بها القطب العصب متعاطفة الكلوي القابلة للغرس. (A) بين القطبين يؤدي مزودة بموصّلات دبوس وثالث الأرضية الأسلاك. (ب) أسلاك مترابطة عن طريق أنابيب البولي إيثيلين (PE) 90 لحماية العملاء المتوقعين اكستيريوريزيد. (ج) تصميم من طرف القطب بغية فصل العملاء المتوقعين القطبين من السلك الأرض. (د) قطب نصيحة عازمة بزاوية 90 درجة لتسهيل الوضع الأمثل؛ حزمة العصب الكلوي يوضع خط عمودي للعملاء المتوقعين القطبين والفيلم المختبر على أساس الشمع يعزل العملاء المتوقعين من سلك الأرضي التي على اتصال بالانسجة الكامنة. تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل تسجيل الضغط الشرياني والكلوي متعاطفة الأعصاب النشاط (رسنا)- تتبع عينة تثبت تسجيل متزامنة الجهازية ضغط الدم الشرياني، رسنا ورسنا المتكاملة في ماوس واعية، ويستريح بهدوء 48 ساعة التالية إعداد العمليات الجراحية. تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الاستجابة لنشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) للنشاط البدني العادي. الممثل تتبع تسجيل متزامنة تتميز المنهجية ضغط الدم الشرياني، رسنا ورسنا المتكاملة في ساعتين الفئران واعية 48 و 72 عقب عملية جراحية في الأساس و (ألف) عند بدء الاستمالة النشطة أو الأكل (ب) هادئة. السهم الكبير يدل على بدء النشاط البدني من بقية. تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: نشاط العصب متعاطفة الكلوي الأجل (رسنا) إشارة الجدوى. تسجيلات الممثل متسلسلة من ضغط الدم ورسنا في الماوس واعية، ويستريح بهدوء واحد عدة أيام بعد إعداد العمليات الجراحية. (أ) 2 أيام، (ب) 3 أيام، (ج) 4 أيام و (د) 5 أيام ما بعد الجراحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: الرائعة إشارة النشاط (رسنا) الكلوي العصب متعاطفة مع baroreflex الشرياني. تسجيل الممثل من ضغط الدم الشرياني ورسنا في ماوس واعية في بقية خلال خط الأساس (A) وبعد الإدارة عن طريق الحقن الوريدي اللاحقة من nitroprusside الصوديوم (ب) يليه (ج) phenylephrine. تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: كوانتيتيشن ريسبونسيفيتي متعاطفة الكلوي لضغط الدم الشرياني. الكمية استجابة ضغط الدم الشرياني ونشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا) للتلاعب الدوائية مع نيتروبروسيدي الصوديوم و phenylephrine. (أ) يعني الضغط الشرياني في خط الأساس (شريط أسود؛ 116±2 مم زئبق) وعقب اللاحقة الإدارة عن طريق الحقن الوريدي نيتروبروسيدي الصوديوم (شريط رمادي؛ 62±3 مم زئبق) وفينيليفريني (بار مفتوح؛ 137±6 مم زئبق). (ب) المقابلة استجابة رسنا أثناء نيتروبروسيدي الصوديوم (شريط رمادي؛ 77±9%) أو فينيليفريني (بار مفتوح-؛ 79±2%). يتم التعبير عن رسنا تغييرا في المائة من خط الأساس، يعني ± sem. * فرق كبير من خط الأساس (ف < 0.05، n = 5). تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: جانجليونيك ما بعد طبيعة نشاط العصب متعاطفة الكلوي (رسنا)- تتبع الممثل من ضغط الدم الشرياني ورسنا في خط الأساس (أ)، (ب) مباشرة بعد الحصار جانجليونيك مع هيكساميثونيوم و (ج) بعد الوفاة. تتكرر مع إذن5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معرف الحيوان | 2d | 3d | د 4 | د 5 | |
| A | ملم زئبقي | 112 | 110 | 108 | 109 |
| نبضة في الدقيقة | 657 | 551 | 626 | 616 | |
| ب | ملم زئبقي | 115 | 107 | 111 | 110 |
| نبضة في الدقيقة | 582 | 652 | 662 | 668 | |
| ج | ملم زئبقي | 115 | 118 | 113 | 111 |
| نبضة في الدقيقة | 591 | 599 | 689 | 664 | |
| د | ملم زئبقي | 114 | 115 | 116 | 110 |
| نبضة في الدقيقة | 457 | 513 | 599 | 531 | |
| ه | ملم زئبقي | 109 | 109 | 103 | 105 |
| نبضة في الدقيقة | 632 | 687 | 699 | 689 |
الجدول 1: قيم الأساس التي يعني الشرياني الضغط ومعدل ضربات القلب في الفئران الآلية أكثر من 5 أيام متتالية بعد الجراحة- تتكرر مع إذن5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا لدينا المبينة، وأظهر والتحقق من صحة طريقة جديدة للتقييم المستهدفة من رسنا في الفئران واعية، حرية الانتقال والراحة بشكل مريح في اقفاصها المنزل. وبعد الجراحية زرع راديوتيليميتير ضغط الشرياني، قسطرة تسريب الوريدي نائحين وقطب رسنا قطبين خصيصا، الفئران تعافي من جراحة وتركت دون عائق لمدة 48 إلى 72 ساعة. ظلت الفئران تمت تسويتها بشكل مريح في قفص على المنزل في جميع الأوقات (بما في ذلك فترات تجريبية) بالوصول غير المقيد إلى الغذاء والماء والإثراء البيئي. كان بعيد التلاعب التجريبية التي تلت كل من المحقق وقلق لا الحيوانات. فيما يتعلق بنوعية وتفسير الإشارات رسنا، هذا النهج تماما إزالة التعقيدات الفسيولوجية غير مرغوب فيها ولا يمكن تجنبها للتخدير والصدمة الجراحية، فضلا عن ضبط النفس وغيرها من الإجهاد البدني والعقلي لمصادر هذا الحيوان. وهكذا، كانت هذه العوامل المؤثرة الأخرى الخطيرة التي تؤثر دائماً تفسير القياسات نشاط العصب متعاطفة مبرماً.
جميع الفئران كانت في صحة جيدة وأقرب وقت 24 ساعة بعد الجراحة، عرض السلوكيات النمطية مثل السطوع، النشاط، والاستجابة، والأكل، والشرب، والاستمالة، فضلا عن السلوك مرحة واستكشافية. جميع الحيوانات أظهرت هذه الخصائص، وتشارك بنشاط مع إثراء البيئية المقدمة بغض النظر عن أم لا كان قادراً على تسجيل إشارة رسنا قابلة للحياة. على الرغم من أن الانتعاش الوقت اللازم تماما استعادة ضغط الدم العادي التالي غرس مسبار راديوتيليميتريك يقال ما دام9من 4-7 أيام، الضغط الشرياني ترجع إلى وضعها الطبيعي أسرع بكثير، كما يتبين من القيم وذكرت هنا لضغط الدم ومعدل ضربات القلب. وفي الواقع، هذه المعلمات القلب والأوعية الدموية معادلة لتلك التي سبق أن أبلغت في الحيوانات الآلية وبالمثل الذي سمح لتصل إلى 10 أيام التعافي من الجراحة8،10.
خيار استخدام المسابير راديوتيليميتريك لقياس ضغط الدم عبر قسطرة مملوءة بسائل كان متعمدا، وهذا يقلل من الإجهاد في الفئران وأيضا تعطي المزيد من الدم واضحة وموثوق بها وإشارات ضغط النبض ومعدل ضربات القلب القيم11. باستخدام تكنولوجيا القياس البعدي لتسجيل ضغط الدم يشكل ميزة إضافية نظراً للحاجة إلى تدفق كثيرا ما والحفاظ على السوائل شغل القسطرة الشريانية مع المالحة هيبارينيزيد، التي لا محالة تزعج الحيوانات، هو قضاء مبرماً. كما أن النهج الذي تتبعه اكستيريوريزينج جراحيا، ترسيخ وحماية القسطرة الوريدية ويؤدي ثنائي القطب الكهربائي المثل الأعلى بالمقارنة مع تقارير أخرى تصف التخزين المؤقت للعملاء المتوقعين في جيب تحت الجلد12، منذ نهجنا يتجنب حتى قصيرة re-التخدير والتلاعب الجراحية الحيوان فورا قبل التسجيل التجريبي، الذي سيكون دون شك التشويش الماوس ويمس بالجودة والقدرة على تفسيرها رائع حساسية الجهاز العصبي اللاإرادي البيانات.
هذا الأسلوب تعطي إشارات رسنا صحيحاً، نوعية الذي أبداه رشقات نارية مميزة من النشاط الكهربائي يمكن تمييزها الواضح من الضوضاء الخلفية في استرخاء، بهدوء يستريح الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت رسنا الاستجابة النموذجية للنشاط البدني في الحيوان مثل الاستمالة وهادئة الأكل كما ذكرت في الأدبيات13،14. نظراً للزيادات مميزة في رسنا المتوقع مع الحركة الطبيعية أو اليقظة للحيوان، من المحتم وبالتالي ملاحظة واستبعاد هذه الفترات من الوقت بغرض التحليل التجريبي والتركيز على قطاعات من تسجيل خلالها هو يستريح الحيوان بهدوء. وهذا يساعد على منع إساءة تفسير ممكن للبيانات. وتشمل العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤدي إلى سوء تفسير البيانات الضوضاء الكهربائية أو التدخل، فضلا عن التلوث إشارة مع نبضات القلب15. الحركة المفرطة للجزء اكستيريوريزيد من العملاء المتوقعين القطب يمكن أن تؤثر أيضا جودة الإشارة رسنا ويمكن أن تظهر كخط أساس غير مستقرة أو "يرتعش". في بعض الأحيان هذه المصادر يمكن أن تدخل إشارة تظهر عفويا تختفي أثناء تسجيل واضحة تماما وينبغي استبعادها من التحليل5،،من1516. وهناك اعتبار آخر هو الوقت الذي يتم الحصول على التسجيلات. من المهم أن نلاحظ أن ضغط الدم ورسنا تختلف مع إيقاع circadian، حيث أنها مثالية لإجراء تجارب في الوقت نفسه اليوم لتجنب هذا العامل يحتمل الخلط. في هذه الدراسة، ونحن لم يلاحظ تقلب كبير في ضغط الدم ورسنا بسبب التذبذبات الإيقاعية كما سجلنا كافة المعلمات بين 10:00 ص و 06:00 م-ضمن دورة الصيفي مرفق الإسكان الحيواني. عنصر هام آخر من هذا التقرير هو التحقق إشارة رسنا، الذي تجلى، هو في الواقع العالق مع baroreflex الشرياني. نظراً للتخفيض السريع ورفع رسنا بالتوازي مع انخفاض المستحثة عقاقيري والزيادة في ضغط الدم النظامية، كان baroreflex الشرايين سليمة بالتأكيد--هذا في حد ذاته يوضح أن غرس الانسداد راديوتيليميتري القسطرة في الشريان السباتي واحد لا تتداخل مع وظيفة القلب والأوعية الدموية الطبيعية. ويؤكد الظاهري اختفاء إشارة رسنا عند الحصار جانجليونيك مع هيكساميثونيوم كذلك تسجيل رسنا postganglionic.
سيكون من المثالي لتوفير فترة نقاهة بعد عملية جراحية أطول للفئران، لكن نحن وآخرون في هذا المجال تعترف بأن الحفاظ على الاستمرار في الأجل الطويل للأعصاب اللاإرادي في الآلية مزمن الحيوانات، وبخاصة من الفئران، لا تزال صعبة. على الرغم من تراجع جودة الإشارة رسنا على مدى عدة أيام ما بعد الجراحة، أنه لا يزال من الممكن تسجيل رسنا صحيح موثوق لأيام متتالية على الأقل 3 في جميع الفئران وتصل إلى 5 أيام في حوالي نصف الحيوانات. وهذا الإنجاز في حد ذاته يدل على طفرة في مجال الدراسات اللاإرادي في الفئران. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يزيد استخدام الحيوانات المحورة وراثيا الثمينة، كما أنه من الممكن لتسجيل متعددة التجريبية ومراقبة المحاكمات في الحيوان نفسه في أيام مختلفة، بالطبع، مما يسمح للتوزيع العشوائي لأمر المحاكمة وتسجيل الأساس السليم قبل كل تجربة17. فإنه من المشجع أن نرى تقارير النجاح الطويل الأجل العصب متعاطفة مع تسجيلات أجريت في القوارض واعية18،،من1920 بما في ذلك التقدم في القياس البعدي العصب تسجيل التكنولوجيات للفئران 15،21. التصغير من هذه التكنولوجيا للاستخدام في الماوس واعية المقبلة، وفي الوقت نفسه، نحن نسعى جاهدين لتحسين هذا الأسلوب زيادة طول عمر ألياف العصب متعاطفة مع توسيع النافذة التجريبية وربما السماح لفترة أطول وقت الانتعاش ما بعد الجراحة. ومع ذلك، سيظل هذا الأسلوب بديل/تكملة مفيدة وسهولة وبتكلفة ميسورة لأي تطورات المستقبل في القياس البعدي العصب تسجيل التكنولوجيا في الفئران، التي تتطلب استثماراً في المعدات مخصصة والأجهزة العادية الصيانة.
لم تكن الحاجة إلى تقنيات موثوقة لتقييم وظيفة القلب والأوعية الدموية والاستقلال الذاتي في الفئران كبيرة جداً، النظر في الاهتمام المتزايد بالماوس المعدلة وراثيا نماذج في مجال البحوث الطبية الحيوية. بذلت خطوات كبيرة في مجالات كثيرة من علم وظائف الأعضاء، ولكن هناك لا يزال بعيداً للذهاب من حيث توحيد وتحسين النهج لتقييم دالة اللاإرادي في الماوس. وحتى الآن، هناك واحد يصف التقرير قياس نشاط العصبية الحسية في الماوس واعية12. هذا النهج يحدد قياس نشاط المثانة العصبية الحسية وينطوي على التخدير والجراحية التلاعب بالقسطرة توضع تحت الجلد مباشرة قبل تسجيل التجريبية وكذلك الإكراه البدني من الفئران خلال الدورة بروتوكول تجريبي12. وتعرف هذه العوامل عوامل الإجهاد التي يتم تجنبها تماما مع النهج الحالي، الذي يمكن التأكيد أن تكون مصممة لتسجيل مجموعة متنوعة من أعصاب فائدة بالإضافة إلى الأعصاب الكلوية. في الآونة الأخيرة، أبلغ عن العصب متعاطفة مع القياسات في الفئران واعية، ولكن هذه القياسات إلى حد كبير إجراء ساعات التالية إعداد العمليات الجراحية، مع أي ذكر لإقامة مسكن22. وبصرف النظر عن هذه التقارير، وإلا تقييم الدالة اللاإرادي حصرا في الفئران تخديره. استعراض شامل للأدب غلة العديد من النهج، ساعات طويلة المدة التجريبية، وتركيبات/جرعة مخدر، والتهوية الميكانيكية والإبداعية وكثيراً ما التدابير المتخذة للحفاظ على الفئران في دولة تحمل بعض مظاهر الفسيولوجية (أي الأوكسجين في مهب مباشرة نحو آنف الحيوان)23،24،25،،من2627،،من2829، 30،31. بين هذه الدراسات والتقارير عن قيم ضغط الدم، غائبة أو منخفضة ذريعا-أسفل النطاق الفسيولوجية للضغوط الشريانية الجهازية2. وهذا يثير إشكالية على مستويات عديدة، ولكن لا سيما حتى عندما يتعلق بتقييم سليم للدالة اللاإرادي في هذه الحيوانات، نظراً للعلاقة الراسخة بين ضغط الدم ولهجة اللاإرادي. وكلاء مخدر أنفسهم تأثيراً مباشرا لهجة متعاطفة، مع العديد من التقارير التي تفيد بأن التخدير يخفف من حدة النشاط متعاطفة. في الواقع، أدلة تثبت أن يوريتان، مخدر المختار على نطاق واسع للعصبية الحادة تسجيل تجارب32وجرعة رسنا النقصان33 [دبندنتلي] ويحول دون baroreflex الشرياني34. على العكس من ذلك، تشير تقارير أخرى إلى أن يوريتان يزيد لهجة متعاطفة مع35. منح، قارن هذه الدراسات عادة نشاط العصب التجريبية كتغيير من أساس مسجل، لكن تغيير حالة النظام العصبي اللاإرادي الظروف المذكورة أعلاه لا يمكن إنكاره يحول دون الكشف عن التغيرات المنفصلة في العصب النشاط.
التحدي المتمثل في هذا الأسلوب يكمن أساسا في المهارة الجراحية اللازمة للنجاح في إعداد الماوس لتسجيل العصب واعية. ومع ذلك الاستثمار في صقل هذه المهارات أكثر من يعوض بنوعية وموثوقية البيانات رسنا مباشرة إنتاج. وهذا النهج تماما تلتف التقييدات التي يفرضها تقييمات غير المباشرة للتحكم اللاإرادي مثل مستويات الكاتيكولامينات البلازما، وهي مجا تماما في الفئران ومحدودة بسبب كمية الدم التي قد تكون إنسانية جمعت36. وباﻹضافة إلى ذلك، لهجة البلازما الكاتيكولامينات الحصار اللاإرادي المستوى فضلا عن الدوائية التقدير عموما اللاإرادي1 مقابل مساهمات منفصلة من السكان العصب محددة، وعموما أكثر فائدة. تقييم الرياضيات للهجة اللاإرادي عن طريق التحليل الطيفي السلطة من آثار ضغط الدم ومعدل ضربات القلب مفيد لتقييم دالة اللاإرادي في البشر، إلا أن هذا الأسلوب قد لا تكون قابلة للتكيف للفئران36،37. ولذلك، أخذ العينات مباشرة من نشاط الأعصاب في ماوس واعية، ويستريح بشكل مريح مثالي كما يعكس حالة اللاإرادي طبيعية وسليمة لهذا الموضوع عن كثب ويسهل تقييم متطورة لمساهمة الأعصاب المحدد الظواهر الفسيولوجية للفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده سمة زمالات ما بعد الدكتوراه من "المعاهد الكندية" للبحوث الصحية (استوفوا) وقلب & مؤسسة السكتة الدماغية من كندا (هسفك) والبرتا يبتكر الحلول الصحية (عيس)؛ J.E.H. معتمد من قبل منحة من الوطني للقلب والرئة والدم معهد PO1HL-51971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
References
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
