Summary
Narcose muizen vertonen niet-fysiologische systemische bloeddruk, die zich verzet tegen de zinvolle beoordeling van autonome Toon gezien de intieme relatie tussen bloeddruk en het autonome zenuwstelsel. Dus, een nieuwe methode om tegelijkertijd record renale sympathiek zenuw activiteit en bloeddruk met intraveneuze infusie in de bewuste muizen wordt geschetst.
Abstract
Renale sympathische zenuwen bijdragen aanzienlijk tot zowel fysiologische en pathofysiologische verschijnselen. Evaluatie van de activiteit van de renale sympathiek zenuw (RSNA) is van groot belang op vele terreinen van onderzoek zoals chronische nierziekten, hypertensie, hartfalen, diabetes en obesitas. Eenduidige beoordeling van de rol van het sympathische zenuwstelsel is dus absoluut noodzakelijk voor de juiste interpretatie van de experimentele resultaten en begrip van ziekteprocessen. RSNA is traditioneel gemeten bij narcose knaagdieren, zoals muizen. Echter, muizen meestal vertonen zeer lage systemische bloeddruk en hemodynamische instabiliteit voor enkele uren tijdens anesthesie en chirurgie. Zinvolle interpretatie van RSNA is verward door deze niet-fysiologische toestand, gezien de intieme relatie tussen sympathische zenuwstelsel Toon en cardiovasculaire status. Om deze beperking van de traditionele benaderingen, ontwikkelden we een nieuwe methode voor het meten van de RSNA in bewuste, vrij bewegende muizen. Muizen zijn chronisch geïnstrumenteerd met radio-telemeters voor continue monitoring van bloeddruk evenals een infusie van jugular veneuze katheter en bipolaire elektrode douane-ontworpen voor directe opname van RSNA. Na een herstelperiode van 48-72 uur, overlevingskans was 100% en alle muizen zich normaal gedragen. Op dit moment-punt, werd RSNA met succes opgenomen in 80% van de muizen, met levensvatbare signalen verworven tot 4 en 5 dagen na chirurgie in 70% en 50% van de muizen, respectievelijk. Fysiologische bloed druk werden opgenomen in alle muizen (116±2 mmHg; n = 10). Opgenomen RSNA verhoogd met eten en grooming, als gevestigde in de literatuur. RSNA werd bovendien gevalideerd door ganglionaire blokkade en modulatie van de bloeddruk met farmacologische stoffen. Een effectieve en beheerbare methode voor duidelijke opname van RSNA in bewuste, vrij bewegende muizen wordt hierin beschreven.
Introduction
Interesse in het gebruik van muizen op verschillende terreinen van biomedisch onderzoek blijft uitbreiden met de ontwikkeling van talloze genetisch gemanipuleerde modellen. Voor het grootste deel, technische vooruitgang gelijke tred hebben gehouden met het toegenomen gebruik van muizen in fysiologie en er is nu een indrukwekkende selectie van verkleinde apparaten ontwikkeld specifiek voor het meten van belangrijke fysiologische parameters in muizen. Hoewel telemetrische apparaten voor directe meting van autonome zenuwstelsel Toon in de bewuste rat zijn beschikbaar voor meer dan een decennium, verkleinde apparaten voor het beoordelen van zenuw activiteit in bewuste muizen zijn momenteel niet beschikbaar. Onderzoekers meestal omzeilen deze beperking door de beoordeling van de bijdrage van het autonome zenuwstelsel met indirecte methoden (d.w.z. plasma of urine catecholamines, farmacologische autonome blokkade, spectrale analyse van patronen van bloed Druk/hartslag)1.
Hoewel deze benaderingen waardevolle informatie bieden, is het resultaat een algemeen beeld van de totale autonome Toon, in plaats van waaruit de afzonderlijke bijdrage van geïsoleerde populaties van zenuwen naar het fenomeen onderzochte. Als alternatief, directe opname van de activiteit van bepaalde zenuwen is uitgevoerd in narcose muizen, die een veelheid van zorgen met zich meebrengt. Het is buitengewoon moeilijk om stabiele bloeddruk binnen de fysiologische bereik in een narcose muis voor enkele uren na de operatie. In feite, in dit soort experimenten, bloeddruk is vaak niet-aangegeven of gepresenteerd op een zeer laag niveau (dat wil zeggen 60-80 mmHg vs > 100mmHg in een bewuste muis)2. De kwetsbaarheid van het cardiovasculaire systeem tentoongesteld in de voorbereiding van een narcose muis vaak uitsluit zinvolle beoordeling van autonome zenuw activiteit, gezien de codependent relatie tussen bloeddruk en sympathieke Toon3, 4.
Om deze beperking, een nieuwe methode voor directe opname van renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) in bewuste, ongebreidelde muizen, ongestoord binnen hun huis kooien werd ontwikkeld. Zowel de chirurgische en experimentele aanpak voor een succesvolle implementatie van deze techniek wordt in detail beschreven. Deze voorbereiding kan de onderzoeker gelijktijdig opnemen arteriële druk via radiotelemetry naast RSNA, met de toegevoegde mogelijkheid om intraveneus infuus agenten van belang zonder verstoring van de muis.
Vierentwintig uur na chirurgie, muizen zich normaal gesproken gedragen en doen niet vertonen tekenen van pijn of leed. Experimentele opnames kunnen dan 48 tot 72 uur na operatie beginnen, terwijl de muis comfortabel in haar kooi met onbeperkte toegang tot voedsel, water en milieu verrijking ligt. Duidelijke RSNA sporen worden gepresenteerd en de karakteristieke reacties van deze zenuw bevolking normale fysieke bewegingen van het dier (zoals eten en grooming) worden gedemonstreerd naast farmacologische modulatie van de systemische bloeddruk. De kwaliteit en de specificiteit van de RSNA signaal wordt verder bevestigd door ganglionaire blokkade. Dit manuscript bevat de audiovisuele aanvulling op een aanvankelijk gepubliceerde beschrijving van deze techniek5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle van de experimentele procedures zijn in overeenstemming met de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité van het medisch centrum van de Universiteit van de Mississippi.
1. dieren en huisvesting
- Huis muizen (24-35 g) bij aankomst in de institutionele laboratorium dier faciliteit.
- Muizen bieden standaard knaagdier chow en leidingwater ad libitum in alle stadia van het experimentele protocol in een gecontroleerde omgeving van temperatuur en vochtigheid.
2. aangepaste fabricage van de implanteerbare RSNA-elektrode
Opmerking: Construeer de implanteerbare RSNA elektrode minstens een paar dagen voor de geplande chirurgische ingreep voor genezing en sterilisatie tijd (hieronder beschreven).
- Snij drie gelijke lengtes van geïsoleerde RVS meerdere-stranded wire elke 250 mm (draaddiameter 0.0254 mm kale, 0,14 mm gecoat). Gebruik een scalpel blad (bij voorkeur #11) aan strook van ongeveer 15 mm van het isolatiemateriaal om het onderliggende metaal van het ene eind van elk van de lengtes van draad bloot te stellen.
- Soldeer een enkele mannelijke pinsconnector (messing met goudlaag) naar het bared einde van slechts twee van de draden tot bipolaire elektrode leidt (figuur 1A). Laat het einde van de derde lengte van de draad kaal. Dit zal fungeren als de draad van de grond.
- Een korte (~2.0 - 2,5 cm) glijden stuk van 1,6 mm diameter heat-shrink tubing over de pinsconnector en de draad te volledig dekken de nieuw gesoldeerd pakking tussen de draad en pin connector.
Opmerking: Het uiteinde van de pinsconnector die zal worden aangesloten op de versterker headstage moet blijven blootgesteld. - Houd de draad boven een warmte-pistool met een paar kleine tangen of hemostats te krimpen van de buis warmtegevoelig en elektrisch isoleert de verbinding tussen de pens-connector en de draad. Herhaal dit voor de tweede draad/pin-connector.
- Knip een 200 mm lengte van polyethyleen slang (PE 90; binnendiameter 0,86 mm, buitendiameter 1,27 mm). Groep van de drie draden (twee leidt + draad op de grond) en de invoering van de ongerepte uiteinden in de PE 90-buis, draadsnijden ze samen door naar het open uiteinde van de buis (figuur 1B).
Opmerking: De 90 van de PE buizen functies als een omhulsel te groeperen en te beschermen van de elektrode leidt en draad op de grond.- Identificeer de grond draad en haal deze door de schede PE 90 een beetje verder om deze te onderscheiden van de bipolaire elektrode leads.
3. bouw van het elektrode-Tip
- Visualiseer de ongerepte uiteinden van de draden van de elektrode met een ontleden Microscoop. Rijg de drie losse eindjes van de elektrode via een 5 mm - lange stuk kleinere polyethyleen slang (PE 10, binnendiameter 0,28 mm, buitendiameter 0.61 mm) om de draden van de elektrode te verenigen.
- Een 1,5 mm stuk van deze PE 10-buizen op de drie elektrode draden met elkaar verbinden. Verder deze buizen om uit te rusten van 2.0 mm afstand van de eerste 5 mm stuk van PE-10.
- Rijg een tweede bagagestuk van 1,5 mm PE 10 buis op de toppen van de twee bipolaire elektrode leidt tot dekken en het isoleren van de tips en het scheiden van de grond draad (figuur 1 c).
- Trim eventuele overtollige lengte van de draden met een schaar.
- Lijm de afzonderlijke stukjes PE 10 buis aan de draden van de elektrode met een kleine druppel vloeibare formule Cyanoacrylaat lijm. Plaats een afgestompte 25 meter naald op het uiteinde van de buis van de lijm morsen te verbeteren van de controle.
- Plaats de naald tip op het kruispunt tussen de PE 10 en draad, dan afzien van een kleine daling van lijm en visualiseren lijm coating van de binnenkant van de PE-buis.
- Laat de lijm aan volledig genezen overnachten.
4. fijne voorbereiding van de elektrode Tip voor opname
- Strip de isolerende coating van de bipolaire elektrode-tips en het uiteinde van de draad van de grond met een scalpel #11 mes. Niet storen of schade aan de onderliggende meerdere gestrande draden zoals dit invloed op de kwaliteit van het signaal van de RSNA hebben zal.
- Greep de geconstrueerde elektrode tussen de 5.0 mm en 1.5 mm PE 10 ankers met pincet gebogen en buig de draden te vormen een hoek van 90° (figuur 1 d).
Opmerking: Dit manoeuvre moet de positie van de bipolaire elektrode leads boven de draad van de grond, in een optimale positie aan de wieg van de bundel van de zenuw.
5. bouw van de verankerende sokkel
- Construct een voetstuk te stabiliseren van de elektrode tot de mid schapulier regio van de muis op exteriorization leidt door het snijden van een 3 cm stuk polyethyleen slang (binnendiameter 2.70 mm, buitendiameter 4.00 mm).
- Grip van de buis met een tang en smelt een uiteinde over een warmte-pistool. Druk op de verwarmde end van buizen loodrecht op een koele metalen oppervlak om een afgeronde rug of "flens" te maken.
- Rijg deze voetstuk op de geconstrueerde elektrode, zodanig dat de flens naar het uiteinde van de elektrode wijst.
Opmerking: De combinatie van de PE 90 schede en voetstuk zal beschermen de elektrode leads keer die van het dier.
6. sterilisatie van de voltooide implanteerbare elektrode
- Pakket de voltooide elektrode individueel in sterilisatie tassen en ozon steriliseren (TSO3) vóór implantatie.
Opmerking: Raadpleeg met plaatselijk ziekenhuis sterilisatiefabriek met betrekking tot specifieke type van sterilisatie tas en procedure zoals dit tussen instellingen verschilt.
7. narcose en voorbereiding op de operatie
- Beheren analgesie 20 minuten voorafgaand aan de start van de operatie (2 mg/kg meloxicam, S.C.). Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een zaal van de inductie met 100% medische kwaliteit zuurstof toegediend. Vaporizer instellingen aanpassen zodat verhoging van het percentage van Isofluraan verdoving in stappen van 0,5 tot 4%. Evalueren van chirurgische vliegtuig door de beoordeling van de reflex reactie op zachte druk op de tenen of de stootkussens van de voet van voorgrond toegepast en hind ledematen en de vertraging van de ademhaling.
- Het dier overbrengen in de chirurgische tabel en onderhouden van anesthesie met 1,5 tot 2% Isofluraan via een neuskegel zodra het chirurgische vliegtuig heeft bereikt en niet langer de teen-snuifje-reflex vertoont. Herhaal het antwoord teen-snuifje periodiek en respiratoire tarief gedurende de gehele chirurgische procedure beoordelen. Ophthalmic zalf toepassen om te voorkomen dat droge ogen.
- Het handhaven van de normale lichaamstemperatuur van het dier te allen tijde met gel gevulde isothermische warmte pads en bijbehorende chirurgische tabel. Isothermische pads opslaan in een waterbad 37° C en vervangen remblokken zo vaak als nodig tijdens chirurgie om fysiologische lichaamstemperatuur.
- Beheren van glycopyrrolaat (50-70 µg/kg, subcutaan (S.C.)) om te voorkomen dat buitensporige productie van airway afscheidingen onmiddellijk na de inductie van de anesthesie. Beheren deze dosis glycopyrrolaat een tweede fouillering, bij het middelpunt van de chirurgische procedure (stap 9.1).
- Het gedrag van alle chirurgische ingrepen onder aseptische condities. Zorgen ervoor alle chirurgische instrumenten gesteriliseerde met autoclaaf vóór de geplande operatie. Schoonmaken van het chirurgische gebied zoals hieronder (7.2.1) beschreven en steriliteit gedurende de hele procedure handhaven.
- Draag een gezichtsmasker, gesteriliseerde met autoclaaf isolatie jurk en steriele handschoenen voor eenmalig gebruik. Reinig alle grote apparatuur, zoals zwanenhals lamp, ontrafeling van werkingssfeer en chirurgische tafel met 70% ethanol. Periodiek tijdens de procedure, wordt 70% ethanol toepassen door de chirurgische handschoenen om steriliteit.
- Verwijderen haren van het dier linkerflank, ventrale nek en dorsale midscapular regio met kleine dierlijke tondeuses, gevolgd door ontharende room (gevoelige huid formule).
- Reinigen van de huid van deze twee chirurgische velden met 3 afwisselend toepassingen van chirurgische reiniging oplossing (10% Povidon jodium) en 70% ethanol. Het chirurgische gebied met een definitieve toepassing van de chirurgische reiniging oplossing voor te bereiden.
8. chirurgische implantatie van de RSNA-elektrode
- Plaats de muis op de rechterkant met de rostraal einde wijst naar de surgeon's links, bloot de linker flank van het dier. Maak een 5 mm incisie in de huid van de midscapular regio met een scalpel (#11).
Opmerking: Dit is de site waarop de RSNA elektrode leads die zal worden.- Maak een tweede snede (< 20 mm) in de huid over de linkerflank, loodrecht op de wervelkolom en de 2 mm caudal aan de ribbenkast. Tunnel een 13G RVS naald subcutaan van deze incisie aan de insnijding op de site van de dorsale afsluiten.
Opmerking: File de scherpe randen van de naald te verlaten een gladde, niet-cutting edge. - De gesteriliseerde implanteerbare RSNA elektrode (stap 2 - 6) passeren de 13G naald. Trek de naald 13G terug te laten de tip van de elektrode liggend op de buikspier van de linkerflank. Laat een segment van de elektrode leads liggen onder de huid en laat de resterende lengtes die voortkomen uit de dorsale incisie.
- Maak een tweede snede (< 20 mm) in de huid over de linkerflank, loodrecht op de wervelkolom en de 2 mm caudal aan de ribbenkast. Tunnel een 13G RVS naald subcutaan van deze incisie aan de insnijding op de site van de dorsale afsluiten.
- Plaats het uiteinde van de elektrode naar de kant. Maak een incisie in de buikspier rechtstreeks ten grondslag liggen aan de huid incisie gemaakt in 8.1.1. Scheid de vet en bindweefsel langs de rug spier met kleine katoen-tipped applicatoren bloot de linker nier.
- Open het chirurgische gebied met micro-OPROLMECHANISMEN en intrekken van de nier. Doe niet te rekken van de renale neurovasculaire bundel, die onherroepelijk zullen beschadigen de renale zenuwen en beletsel voor opname van een levensvatbare RSNA signaal.
Opmerking: Staal micro-OPROLMECHANISMEN kunnen worden gevormd uit een standaard paperclip en een lengte van de zijde van de 4-0. Zorg ervoor dat deze oprolmechanismen zijn ook gesteriliseerd met de chirurgische instrumenten ter bescherming van aseptische techniek.
- Open het chirurgische gebied met micro-OPROLMECHANISMEN en intrekken van de nier. Doe niet te rekken van de renale neurovasculaire bundel, die onherroepelijk zullen beschadigen de renale zenuwen en beletsel voor opname van een levensvatbare RSNA signaal.
- Visualiseer de renale neurovasculaire bundel met behulp van een high power ontrafeling van Microscoop. Identificeer de renal zenuw bundel, die meestal (maar niet altijd) langs de renale slagader en ader loopt. Ontleden de bundel van de zenuw van de omliggende weefsels met een fijne, rechte Tang.
Opmerking: De renale zenuw bundel ondoorzichtig, met een "touw-achtige" reflecterende uitstraling uniek ten opzichte van de lymfevaten, die duidelijk weergegeven.- Manipuleren van de zenuw bundel zo weinig mogelijk. Niet aanraken, rekken of pick-up de zenuw bundel op elk gewenst moment. Fijne bloedvaten bevoorrading van de zenuw, of de renale lymfe-buis, omdat dit zal levensvatbaarheid van de zenuw en produceren continu lymfe vloeistof bundelen rond de zenuw/elektrode, die zal belemmeren of volledig vernietigen het signaal van de zenuw niet verstoren.
- Laat de renale zenuw bundel intact, die zal helpen behouden op de lange termijn levensvatbaarheid van de zenuw, alsmede stabiele contacten tussen de zenuw en de elektrode (dat wil zeggen een verdeelde zenuw kan glijden off van elektroden met tijd en natuurlijke lichaamsbewegingen) onderhouden.
- De RSNA elektrode tip in de buik te introduceren. Haar positie aanpassen zodat de bipolaire elektrode uiteinde en grond draad staan loodrecht op de renale neurovasculaire bundel. De positie van de elektrode verder aanpassen zodat de grond wire goed contact met de onderliggende weefsels heeft en de elektrode niet de renale schepen comprimeren doet, afbreuk te doen aan de renale circulatie (figuur 1 d).
- Til de renale zenuw bundel met schuine pincet. Glijd de elektrode-tip onder de zenuw, waardoor de zenuw in rechtstreeks contact met beide draden.
- Een klein stukje van paraffine film glijden tussen de zenuw/bipolaire draden en de derde (grond) draad (figuur 1 d).
Opmerking: Soak steriliseren de paraffine film in 70% ethanol gedurende 24 uur en spoel in een steriele fysiologische zoutoplossing vóór. - Verwijder eventuele bloed of vloeistof uit rond de zenuw/elektrode met kleine absorberend spears als elke vloeistof links rond de zenuw of elektrode draden zal belemmeren of het signaal van de zenuw te blussen.
- Snel test de kwaliteit van het signaal van de RSNA indien gewenst (setup hieronder beschreven).
Opmerking: Dit moet snel worden gedaan zoals blootstelling aan lucht zal drogen van de zenuw en haar levensvatbaarheid. - Een tweecomponenten silicone-elastomeer toepassen op de eenheid van de zenuw/elektrode, ervoor te zorgen dat de siliconen zwembaden onder/nabij het lef om te zorgen voor volledige elektrische isolatie (d.w.z. niet alleen een druppel op de top van de zenuw).
Opmerking: Zorg ervoor dat de elektrode tips zijn ook gecoat in het silicone. De draad van de grond moet blijven in contact met de onderliggende weefsel en elastomeer hoeft dus niet te zwembad onder deze draad. Vermijd een onnodig groot bedrag van de silicone-elastomeer, toe te passen omdat dit renale doorbloeding potentieel kan belemmeren, of met natuurlijke lichaamsbewegingen met tijd worden verdreven. - Laat 1-2 minuten voor de silicone-elastomeer te genezen volledig, vervolgens zorgvuldig opheffing van de buitenste randen van het silicone "glob" met een tang en breng een kleine hoeveelheid vloeibare formule chirurgische plakband over de opening.
Opmerking: zorg niet toe te passen van een bovenmatige hoeveelheid deze lijm, aangezien het kan afbreuk doen aan de omloop of verspreid naar de zenuw en haar levensvatbaarheid.
- Een klein stukje van paraffine film glijden tussen de zenuw/bipolaire draden en de derde (grond) draad (figuur 1 d).
- Sluit de abdominale incisie met discontinue, absorbeerbare hechtingen (5-0). Sluit de bovenliggende huid op een soortgelijke manier met hetzelfde hechtdraad materiaal.
9. de innesteling van de bloeddruk Radiotelemeter
- Verplaats de muis op zijn rug, met de rostraal einde wijzen naar de chirurg. Anesthesie neuskegel naar wens aanpassen. Beheren de tweede dosis van glycopyrrolaat op dit punt (zie 7.1.3).
- Maak een middellijn-incisie in de huid van de nek regio met een scalpel (#11), vanaf net onder de onderkaak van het dier en uitbreiding van net boven de ribbenkast. Scheid het klierweefsel om de onderliggende nekspieren bloot te stellen. Bloot de linker gemeenschappelijke halsslagader en scheiden van de omringende weefsels.
Opmerking: Neem grote zorg niet te beschadigen van de nervus vagus, omdat dit tot verhoogde na chirurgische sterfte leiden kan.- Drie gedeeltes van de 6-0 zijde hechtdraad materiaal onder de slagader doorgegeven. Positie één hechtdraad zo veel rostrally mogelijk en bind het om het occlude van het schip. Plaats een tweede hechtdraad halverwege langs de lengte van het schip en losjes binden. Plaats de laatste hechtdraad zo caudally mogelijk en losjes binden.
- Intrekken van de rostraal-meeste hechtdraad en veiligste tot de neuskegel met een klein stukje navelstreng tape. Intrekken van de caudal-meeste hechtdraad met micro-mug pincet te beperken van de bloedstroom in het schip.
- Maak een kleine incisie in de vaatwand met fijne lente schaar zo rostrally mogelijk. Het introduceren van de muis bloeddruk radiotelemeter katheter in het vaartuig en de vooraf aan de caudal hechtdraad.
- Bind de middelste hechtdraad tijdelijk stabiliseren van de katheter, laat de caudal retractie en verder van de katheter 10 mm. Tie hechtdraad rond katheter in plaats veilig te stellen.
- Tunnel de telemeter lichaam aan een subcutane zak langs de rechterflank.
10. implantatie en Exteriorization van de Jugular veneuze katheter
- Met kleine katoen-tipped applicatoren waarmee werkmapberekeningen de juiste halsslagader. Twee gedeeltes van de 6-0 zijde hechtdraad materiaal doorgegeven rond het schip.
- Positie één hechtdraad rostrally zo ver als mogelijk en band met de occlude van het schip. Plaats de tweede hechtdraad zo caudally mogelijk en voorzichtig intrekken om te stoppen met de bloedstroom in het schip.
- Gebruik fijne lente schaar om een kleine incisie in de vaatwand zo dicht mogelijk bij de rostraal hechtdraad mogelijk. De ader met warmte-uitgerekt tubing catheterize (od 1,02 mm, uitgerekt tot OD 0.64 mm), die is vooraf gevuld met steriele fysiologische zoutoplossing.
Opmerking: Zorg ervoor dat het uiteinde van de katheter wordt gesneden met een scalpel tot een afgeronde schuine kant om te voorkomen dat vaartuig perforatie. Bepalen van de hoeveelheid vloeistof in de katheter (dode spatie) voor naslaginformatie (Zie stappen 14.4-14.6 hieronder).- Verder de katheter ~ 8 mm in de ader. Het beveiligen van de katheter door koppelverkoop de zijde hechtingen rond het schip en katheter, evenals de toepassing van een kleine daling van gel formule Cyanoacrylaat lijm.
- Plaats de muis aan de linkerkant. Tunnel de intraveneuze katheter vanaf de nek om af te sluiten op de dorsale midscapular regio met behulp van een naald 13G RVS.
- Verplaats de muis op zijn rug. Sluit de hals snede met niet-aaneengesloten hechtingen.
- Plaats het dier in de vatbaar positie. Rijg een kleine onderhuidse knop op de veneuze katheter. Beveilig de knop onder de huid met hechtingen. Rijg de overeenkomstige roestvrij stalen veer over de veneuze katheter en veilig naar de knop van de huid te beschermen van de katheter.
11. beveiliging van de elektrode die leidt
- Beveilig de polyethyleen voetstuk beschermen die de elektrode tot de onderliggende spier weefsel verlijmd leidt. Suture de bovenliggende huid over de flens voor verdere ondersteuning.
12. na chirurgisch herstel
- Antibiotische zalf toepassen op alle incisies.
- Beheren van pijnstillende medicatie. Beheren van extra doses van pijnstillende medicatie indien nodig tijdens de herstelperiode als het dier tekenen van pijn of leed toont.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een metabole kooi bekleed met houtsnippers beddengoed en papieren handdoek om te herstellen. Voortdurend volgen van het dier en laat niet het zonder toezicht totdat het bewustzijn herwint en sternale ligcomfort kan handhaven. Op dit moment introduceren van milieu verrijking en voedsel en water (ad libitum).
- Spoel elektrode leidt buiten de kooi tot het tijdstip van het experiment.
- Plaats de kooi boven een warme warmte pad voor de eerste 24 uur van herstel. RVS lente en intraveneuze katheter verbinden met een draaibare/infusie systeem voor continue infusie van fysiologische zoutoplossing tijdens de herstelperiode (0,5 mL/uur).
- Zorgen dat het dier blijft afzonderlijk gehuisvest in een speciale kooi vanwege de aard van de exteriorized katheter en elektrode leidt.
13. experimentele opstelling voor opname bloeddruk en RSNA
- Voorzien van een roestvrij staal hoogste trillingdempende tafel met een eenvoudige kooi van Faraday.
Opmerking: Deze kooi van Faraday kan worden geconstrueerd met een houten frame en aluminium scherm mesh. Elektrisch gemalen de tabel/Faraday kooi te elimineren alle elektrische ruis. - Plaats een bloeddruk radiotelemetry ontvanger binnen de kooi van Faraday.
- Sluit de ontvanger van de radiotelemetry naar de bijbehorende druk output adapter. Deze adapter aansluiten een data-acquisitiesysteem naar record bloeddruk online.
- Soldeer twee vrouwelijke pins aansluitingen die gratis naar de elektrode mannelijke pins connectors (messing met goudlaag) aan de uiteinden van een gekoppelde, afgeschermde PVC geïsoleerde kabel. Soldeer de tegenovergestelde einden van deze gekoppelde kabel Banaan pluggen. De banaan stekkers verbinden met een preamplification headstage (10 X amplificatie).
- Deze voorversterker verbinden met een differentiële versterker. Pas de instellingen te versterken om de zenuw signaal x10, 000. Filterinstellingen als volgt aanpassen: laag uitgesneden, 100Hz; Hoge knippen, 1000 Hz.
- Plaats de kooi met de muis op de ontvanger van de radiotelemetry gelegen binnen de kooi van Faraday 48 tot 72 uur na de operatie. Inschakelen van de radiotelemetry sonde bloeddruk signalen opnemen.
Opmerking: De muis wennen door het plaatsen van de kooi in de setup in de loop van 1 week voorafgaand aan de operatie is optimaal. - Uncoil van de elektrode leads en steek de aansluitingen van de pin van de bipolaire elektrode in de overeenkomstige vrouwelijke pin aansluitingen (13,4) hierboven om te beginnen met het opnemen van de RSNA.
- Weergeven en tegelijkertijd opnemen bloeddruk signalen online met een computer, terwijl de infusie van fysiologische zoutoplossing of oplossing van belang. Record een minimale overdrachtssnelheid voor gegevens bedraagt 2500 samples per seconde.
14. het monster van experimentele Protocol en validatie van RSNA signaal
- Zorgen dat muizen zijn comfortabel in hun kooi, ongebreidelde met gratis toegang tot voedsel en water. Volg institutionele dierenverzorgers richtlijnen voor het controleren van de normale weergave en het gedrag.
- Het huis van de muizen in de dezelfde temperatuur en de vochtigheid gecontroleerd kamer in welke RSNA opname zal plaatsvinden. Zorgen voor intraveneuze infusie blijft zoals hierboven beschreven.
- Toestaan ten minste 30 minuten van stabilisatie zodra het dier in de opname-instellingen ligt voordat u gaat opnemen van één uur van basislijn bloeddruk en RSNA gegevens hierboven beschreven. Zorgen dat het dier rustig rust tijdens opname aangezien natuurlijke beweging gekoppeld aan verhoging van sympathieke Toon is. Opmerking Wanneer het dier rechtstreeks op het digitale spoor gaat tijdens opname zodat dit kan worden genegeerd tijdens de analyse.
- Test de baroreflex reactie van eerste langzaam een bolus van natrium nitroprusside (2,5 µg/g lichaamsgewicht in een volume van 25 µL zoutoplossing) injecteren in de lijn van de infusie. Langzaam spoelen de regel met ~ 50 µL fysiologische zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Record bloeddruk en RSNA voor 2 tot 5 minuten.
- Langzaam injecteren een bolus van phenylephrine (20 µg/g lichaamsgewicht in 25 µL zoutoplossing). Spoelen met ~ 50 µL fysiologische zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Record bloeddruk en RSNA voor nog eens 10 tot 15 minuten.
- Controleer of de postganglionic aard van het signaal van de zenuw door het langzaam het injecteren van een bolus van de ganglionaire blocker, hexamethonium (50 µg/g lichaamsgewicht in 25 µL zoutoplossing) in de lijn van de infusie. Spoelen met ~ 50 µL zoutoplossing. Zorg katheter dode ruimte is uitgeschakeld. Doorgaan met opnemen gedurende enkele minuten.
- Gebruik de resterende activiteit die na toediening van de hexamethonium als een schatting van achtergrondgeluiden voor gebruik in de analyse van de RSNA blijft (hieronder beschreven).
- Euthanaseren van de muis met een overdosis van Isofluraan (stapsgewijze dosering in stappen van 0,5 tot 5%) en blijven opnemen RSNA voor nog eens 30 minuten. Opmerking: De resterende signaal kan ook gebruikt worden als een schatting van achtergrondgeluiden voor analyse van RSNA.
15. de gegevensanalyse
- Gebruik de software van de overname van het gegevens om ruwe bloeddruk en RSNA sporen te analyseren.
- Digitaal integreren en full-wave corrigeren de ruwe RSNA trace gebruikend deze software. Selecteer "Absolute integraal" voor integraal instellingen; een tijd van constante verval van 0,1 seconden6van toepassing.
- Analyseer het geïntegreerde RSNA signaal (weergegeven in eenheden van µV·s) voor elk segment van het experimentele protocol. Segmenten van de opname negeren wanneer het dier is gebeurd te bewegen. Neem minstens 3 maten voor basislijn en experimentele gedeelten van het experiment, respectievelijk.
- RSNA op het niveau van de minimale en maximale bloeddruk bereikt voor natrium nitroprusside of phenylephrine, respectievelijk om te beoordelen van de gevoeligheid van de baroreflex te analyseren.
- Het gemiddelde van de individuele metingen boven voor elk gedeelte van de experimentele protocol naar een enkele waarde opleveren.
- De RSNA respons te kwantificeren door het berekenen van de procentuele verandering van RSNA vanaf basislijn, die is aangewezen op 100%7. Volledige statistische analyse zo nodig.
Opmerking: In dit voorbeeld, statistische analyse van de reactie van RSNA op natrium nitroprusside en phenylephrine werd afgesloten met een Student t -test; betekenis werd aanvaard met P -waarden < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na het protocol beschreven was overlevingspercentage 100% - alle muizen geïnstrumenteerd in deze studie overleefd en herstelde zich goed na de chirurgische ingreep. Binnen 24 uur na chirurgische voorbereiding, alle muizen zich normaal gesproken gedragen vertonen de typische eten, verzorgen en experimentele gedrag. Geen dieren toonde teken van pijn of leed op dit moment. 48 uur na de operatie, werd een verifieerbare en duidelijk signaal van de RSNA opgenomen in 10 van de 12 muizen. Dit signaal werd gehandhaafd in deze muizen 72 uur na operatie, maar een echte RSNA signaal werd opgenomen in 7 (70%) van muizen per dag 4 en in slechts 5 (50%) muizen door dag 5 na chirurgie. Muizen die niet een kwalitatief hoogwaardige RSNA signaal als gevolg van elektrische ruis of besmetting door elektrocardiogram signalen vertonen deed waren nog steeds in goede gezondheid tot de tijd van euthanization.
Bedoel arteriële druk in de bewuste muizen 48 uur na operatie was 116±2 mmHg, met een overeenkomstige gemiddelde hartslag van 596±22 bpm (n = 10). Gelijktijdig opnemen van een representatieve steekproef van bloeddruk en RSNA op dit moment blijkt duidelijk zichtbaar en typisch ritmische uitbarstingen van RSNA (figuur 2). De typische verhogingen van RSNA verwacht met normale activiteiten zoals eten en grooming, als rechtstreeks waargenomen en personeel heeft opgemerkt, waren ook aanwezig (zie figuur 3). Kwalitatief hoogwaardige RSNA werd ook opgenomen opeenvolgend in 50% van de muizen onderzochte omhoog tot 5 dagen na chirurgische voorbereiding (figuur 4). Bloeddruk en hartslag bleef stabiel gedurende het onderzoek 5 dagen en waarden waren niet afwijken die hebben we vastgelegd na maximaal 10 dagen na chirurgisch herstel (tabel 1)8.
Om het signaal van de RSNA valideren en controleren dat het inderdaad met de arteriële baroreflex is entrained, werd de bloeddruk farmacologisch gemanipuleerd met een intraveneuze injectie van natrium nitroprusside en phenylephrine. RSNA typisch gestegen in reactie op de natrium nitroprusside-geïnduceerde vermindering van arteriële druk; omgekeerd, RSNA werd vrijwel tot zwijgen gebracht na de phenylephrine veroorzaakte stijging van de arteriële druk (figuur 5). Kwantitatief, natrium nitroprusside daalde de bloeddruk tot 62±3 mmHg, die overeenkwam met een hoogte van RSNA tot 77±9% boven het niveau van de basislijn (n = 5; P < 0,05, figuur 6). Ook na phenylephrine administratie, arteriële druk bereikt 137±6 mmHg, die verminderd RSNA met 79±2% onder het niveau van de basislijn (n = 5; P < 0,05, figuur 6). Bovendien, RSNA werd volledig uitgeschakeld na ganglionaire blokkade met hexamethonium (figuur 7), tot oprichting van de post ganglionaire aard van de RSNA signaal.
Figuur 1: bouw en plaatsing van de elektrode implanteerbare renale sympathiek zenuw. Schematische voorstelling van het ontwerp en de aanbevolen plaatsing van de elektrode implanteerbare renale sympathiek zenuw. (A) bipolaire leads voorzien van pin verbindingsstukken en een derde gemalen draad. (B) draden zijn threaded via polyethyleen (PE) 90 slang ter bescherming van de exteriorized leidt. (C) ontwerp van de elektrode tip om te scheiden van de bipolaire leads van de draad van de grond. (D) elektrode tip is gebogen onder een hoek van 90° ter vergemakkelijking van de optimale positie; de renale zenuw bundel staat loodrecht op de bipolaire leads en laboratorium wax gebaseerde film isoleert de leads uit de grond draad die in aanraking komt met het onderliggende weefsel. Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Vertegenwoordiger opname van arteriële druk en renale sympathische zenuwen activiteit (RSNA). Monster trace demonstreren gelijktijdige opname van systemische arteriële bloeddruk, RSNA en geïntegreerde RSNA in een bewuste, rustig rust muis 48 uur na chirurgische voorbereiding. Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Reactie van renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) aan normale lichaamsbeweging. Vertegenwoordiger traceren met gelijktijdige opname van systemische arteriële bloeddruk, RSNA en geïntegreerde RSNA in twee bewuste muizen 48 en 72 uur na de operatie op basislijn en (A) bij aanvang van actieve verzorgen of (B) rustig eten. De grote pijl geeft het begin van de lichamelijke activiteit van rest. Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Op lange termijn renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) signaal levensvatbaarheid. Sequentiële representatieve opnames van bloeddruk en RSNA in een bewuste, rustig rust muis meerdere dagen na chirurgische voorbereiding. (A) 2 dagen, (B) 3 dagen, (C) 4 dagen en (D) 5 dagen na chirurgie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Meevoeren van de renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) signaal met de arteriële baroreflex. Representatieve registratie van arteriële bloeddruk en RSNA in een bewuste muis in rust tijdens de (A) basislijn en na daaropvolgende intraveneuze toediening van (B) natrium nitroprusside gevolgd door (C) phenylephrine. Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Kwantificatie van renale sympathieke responsivity naar arteriële bloeddruk. Kwantitatieve reactie van arteriële bloeddruk en renale sympathiek zenuw activiteit (RSNA) op farmacologische manipulatie met natrium nitroprusside en phenylephrine. (A) gemiddelde arteriële druk op basislijn (zwarte balk; 116±2 mmHg) en na daaropvolgende intraveneuze toediening van natrium nitroprusside (grijze balk; 62±3 mmHg) en phenylephrine (open bar; 137±6 mmHg). (B) overeenkomstige RSNA reactie tijdens natrium nitroprusside (grijze balk; 77±9%) of phenylephrine (open bar; -79±2%). RSNA wordt uitgedrukt een procentuele verandering van baseline, gemiddelde ± SEM. * Significant verschil van basislijn (p < 0,05, n = 5). Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Na ganglionaire aard van de activiteit van de renale sympathiek zenuw (RSNA). Representatieve spoor van arteriële bloeddruk en RSNA op basislijn in (A), (B) onmiddellijk na ganglionaire blokkade met hexamethonium en (C) na het slachten. Gereproduceerd met toestemming5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Dierlijke ID | 2D | 3D | 4d | 5d | |
| A | mmHg | 112 | 110 | 108 | 109 |
| BPM | 657 | 551 | 626 | 616 | |
| B | mmHg | 115 | 107 | 111 | 110 |
| BPM | 582 | 652 | 662 | 668 | |
| C | mmHg | 115 | 118 | 113 | 111 |
| BPM | 591 | 599 | 689 | 664 | |
| D | mmHg | 114 | 115 | 116 | 110 |
| BPM | 457 | 513 | 599 | 531 | |
| E | mmHg | 109 | 109 | 103 | 105 |
| BPM | 632 | 687 | 699 | 689 |
Tabel 1: Gemiddelde arteriële druk en hartslag basislijnwaarden in geïnstrumenteerde muizen meer dan 5 opeenvolgende dagen na chirurgie. Gereproduceerd met toestemming5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben hierin uiteengezet, aangetoond en een nieuwe methode voor gerichte beoordeling van RSNA in bewuste muizen, vrij te verplaatsen en comfortabel rusten in hun huis kooien gevalideerd. Na chirurgische implantatie van een radiotelemeter van de arteriële druk, een inwonende intraveneuze infusie-katheter en een douane-ontworpen RSNA bipolaire elektrode, muizen hersteld van de operatie en gedurende 48 tot 72 uur ongemoeid werden gelaten. Muizen bleef comfortabel vaste in hun kooi te allen tijde (met inbegrip van experimentele perioden) met onbeperkte toegang tot voedsel, water en milieu verrijking. Alle daaropvolgende experimentele manipulatie door de onderzoeker was externe en heeft niet de onrust van de dieren. Met betrekking tot de kwaliteit en de interpretatie van de RSNA signaal verwijderd deze aanpak volledig de ongewenste en onvermijdelijke fysiologische complicaties van anesthesie, evenals chirurgisch trauma en terughoudendheid en andere bronnen van fysieke en mentale stress om te het dier. Deze ernstig storende factoren die van invloed zijn steevast de interpretatie van de sympathieke activiteit metingen werden zo effectief uitgeschakeld.
Alle muizen waren in goede gezondheid en zo vroeg als 24 uur na chirurgie, weergegeven typische gedrag zoals helderheid, activiteit, alertheid, eten, drinken, verzorging, alsmede speelse en experimentele gedrag. Alle dieren tentoongesteld van deze kenmerken en actief met de meegeleverde milieu verrijking ongeacht al dan niet een levensvatbare RSNA-signaal kon worden geregistreerd. Hoewel de hersteltijd volledig moet herstellen normale bloeddruk volgende implantatie van de radiotelemetric sonde naar verluidt is zolang 4-7 dagen9, arteriële druk keert terug naar normaal veel sneller, zoals aangetoond door de waarden gemeld hier voor bloeddruk en hartslag. Inderdaad, deze cardiovasculaire parameters gelijkwaardig zijn aan die eerder werd gemeld in Evenzo geïnstrumenteerde dieren die mochten omhoog tot 10 dagen om te herstellen van de operatie8,10.
De keuze om te gebruiken radiotelemetric sondes voor het meten van de bloeddruk via een katheter vloeistof gevulde was opzettelijk, vermindert stress in de muizen, en levert ook meer duidelijke en betrouwbare bloed- en puls druk signalen en hartslag waarden11. Met behulp van telemetrische technologie naar record bloeddruk vormt een bijkomend voordeel de noodzaak regelmatig leegmaken en handhaven dat de vloeistof gevulde arteriële katheter met EDTA zoutoplossing, die onvermijdelijk het dier verstoort, is volledig geëlimineerd. Ook de aanpak van het operatief exteriorizing, verankering en de bescherming van de intraveneuze katheter en bipolaire elektrode leidt is ideaal ten opzichte van andere verslagen beschrijven van tijdelijke opslag van leads in een subcutane zak12, sinds onze aanpak vermijdt zelfs korte re-anesthesie en de chirurgische manipulatie van het dier onmiddellijk voorafgaand aan de opname van het experimentele, die ongetwijfeld de muis erover en compromissen van de kwaliteit en interpretability van prachtig gevoelige autonome zenuwstelsel gegevens.
Deze methode resulteert in true RSNA signalen, waarvan de kwaliteit worden gedemonstreerd door de karakteristieke uitbarstingen van elektrische activiteit duidelijk te onderscheiden van de achtergrondruis in een ontspannen, rustig rusten muis. Daarnaast toonde RSNA typische alertheid op lichamelijke activiteit in het dier zoals het verzorgen en rustig eten zoals gemeld in de literatuur13,14. Gezien de karakteristieke verhogingen in RSNA verwacht met natuurlijke beweging of alertheid van het dier, het is dus absoluut noodzakelijk en uitsluiten van deze perioden ten behoeve van experimentele analyse en te richten op segmenten van de opname waarin de dier is rustig rusten. Dit helpt voorkomen dat mogelijk verkeerde interpretatie van de gegevens. Andere factoren die tot een verkeerde interpretatie van gegevens leiden kunnen zijn elektrische ruis of storingen, evenals signaal besmetting met ECG pulsen15. Overmatig verkeer van het exteriorized gedeelte van de elektrode leads kan ook invloed hebben op de kwaliteit van het signaal van de RSNA en kan worden weergegeven als een onstabiele of "zwenkende" basislijn. Soms deze bronnen van signaal storing kan verschijnen en spontaan verdwijnen tijdens een duidelijk opname en analyse5,15,16moeten worden uitgesloten. Een extra overweging is het tijdstip waartegen de opnames zijn verkregen. Het is belangrijk op te merken dat bloeddruk en RSNA met het circadiane ritme, variëren dus ideaal om uit te voeren van de experimenten op hetzelfde moment van de dag om te voorkomen dat dit potentieel storende factor. In deze studie, deed niet zien we aanzienlijke variabiliteit van bloeddruk en RSNA als gevolg van circadiane oscillaties zoals we alle parameters tussen 10 am en 6 pm - ruim binnen de daglicht-cyclus van de dierverblijven faciliteit registreerden. Een ander belangrijk onderdeel van dit verslag is de validatie van de RSNA signaal, dat zoals aangetoond, is inderdaad entrained met de arteriële baroreflex. Gezien de snelle vermindering en verhoging van de RSNA in parallel met de farmacologisch geïnduceerde drop en verhoging van de systemische bloeddruk, de arteriële baroreflex was zeer zeker intact - die zelf toont aan dat occlusieve innesteling van de radiotelemetry katheter in een halsslagader interfereert niet met normale cardiovasculaire functie. De virtuele verdwijning van het signaal van de RSNA op ganglionaire blokkade met hexamethonium verder bevestigt opname van postganglionic RSNA.
Het zou ideaal zijn om te zorgen voor een langere herstelperiode na operatie voor de muizen, maar wij en anderen op dit gebied erkennen dat het behoud van de levensvatbaarheid op lange termijn van autonome zenuwen bij chronisch geïnstrumenteerde dieren, vooral muizen, uitdagend blijft. Hoewel de signaalkwaliteit RSNA in de loop van verscheidene dagen na chirurgie afgenomen, was het nog steeds mogelijk om op een betrouwbare manier opnemen waar RSNA gedurende ten minste 3 opeenvolgende dagen in alle muizen en maximaal 5 dagen in ongeveer de helft van de dieren. Deze prestatie op zich betekent een doorbraak op het gebied van autonome studies in muizen. Bovendien, deze methode maximaliseert het gebruik van kostbare transgene dieren, zoals het is mogelijk om te registreren van meerdere experimentele en controle van proeven in hetzelfde dier op verschillende dagen, uiteraard rekening houdend met randomisatie van proef orde en juiste basislijn opname voor elk experiment17. Het is bemoedigend om te zien van de geslaagde verslagen van langdurige sympathieke opnamen uitgevoerd in bewuste knaagdieren18,19,20 , met inbegrip van vorderingen in telemetrische zenuw opname technologieën voor ratten 15,21. Miniaturisatie van deze technologie voor gebruik in de bewuste muis komt en in de tussentijd, we streven naar verbetering van deze techniek te verhogen de levensduur van de sympathische zenuwvezels uit te breiden van de experimentele venster en misschien mogelijk een langere post-operatie hersteltijd. Deze methode blijft echter een nuttig en gemakkelijk toegankelijk en betaalbaar alternatief/aanvulling op eventuele toekomstige ontwikkelingen in telemetrische zenuw opname technologie in muizen, die een investering in speciale apparatuur en regelmatige apparaat vereisen onderhoud.
De behoefte aan betrouwbare technieken voor de beoordeling van de cardiovasculaire en autonome functie in muizen nooit zo groot geweest, gezien de groeiende belangstelling voor transgene muis modellen op het gebied van biomedisch onderzoek. Grote vooruitgang is geboekt op veel gebieden van de fysiologie, maar er is nog steeds ver te gaan in termen van standaardisering en optimaliseren van benaderingen voor de evaluatie van autonome functie in de muis. Tot op heden is er een rapport met een beschrijving meting van sensorische zenuw activiteit in de bewuste muis12. Deze aanpak schetst de meting van de blaas sensorische zenuw activiteit en impliceert van anesthesie en de chirurgische manipulatie van subcutaan geplaatste katheters onmiddellijk voorafgaand aan experimentele opname en fysieke beperking van de muizen in de loop van de experimentele protocol12. Deze factoren zijn bekend met stressoren die volledig met de huidige benadering, die zeker kan worden aangepast voor de opname van een verscheidenheid van zenuwen van belang naast renale zenuwen worden vermeden. Meer recentelijk, sympathieke metingen bij bewuste muizen zijn gemeld, echter deze metingen zijn grotendeels uitgevoerd uren na chirurgische voorbereiding, met geen woord gerept over de pijnstillende administratie22. Afgezien van deze verslagen, heeft de autonome functie anders uitsluitend in narcose muizen zijn beoordeeld. Een grondige herziening van de literatuur een veelheid aan benaderingen, uren durende experimentele duur, verdoving combinaties/dosissen, mechanische ventilatie en vaak creatieve maatregelen om de muizen in een Braziliaanse rekening houdend met wat schijn te ondersteunen levert het fysiologische (d.w.z. zuurstof geblazen rechtstreeks naar de neus van het dier)23,24,25,26,27,28,29, 30,31. Onder deze studies zijn rapporten van de bloeddruk waarden afwezig of bodemloos lage - onder het fysiologische bereik van systemische arteriële druk2. Dit is een probleem op vele niveaus, maar met name zo wanneer adequate beoordeling van autonome functie bij deze dieren gaat, gezien het gevestigde verband tussen bloeddruk en autonome Toon. Verdoving agenten zich rechtstreeks van invloed zijn sympathieke Toon, met veel rapporten suggereren dat verdoving dempt sympathische activiteit. Inderdaad, bewijs aantonen dat urethaan, de meest gekozen verdoving voor acute zenuw opname experimenten32, dosis dependently dalingen RSNA33 en remt de arteriële baroreflex34. Omgekeerd, andere rapporten suggereren dat urethaan verhoogt sympathiek Toon35. Toegegeven, dat dergelijke studies meestal experimentele zenuw activiteit als een verandering van een opgenomen basislijn vergelijken, maar het veranderde staat van het autonome zenuwstelsel onder de hierboven beschreven voorwaarden onmiskenbaar uitsluit detectie van discrete veranderingen in zenuw activiteit.
De uitdaging van deze methode ligt vooral in de chirurgische vaardigheden nodig zijn voor de succesvolle voorbereiding van de muis voor opname van de bewuste zenuw. Echter de investering in het honen deze vaardigheden wordt meer dan gecompenseerd door de kwaliteit en de betrouwbaarheid van de directe RSNA gegevens geproduceerd. Deze benadering omzeilt volledig de beperkingen gesteld door indirecte evaluaties van de autonome controle zoals plasma catecholamine niveaus, die zijn heel labile in muizen en worden beperkt door de hoeveelheid bloed die mogelijk humaan verzamelde36. Daarnaast Toon plasma catecholamine niveau evenals farmacologische autonome blokkade schatting over het geheel genomen autonome1 in tegenstelling tot de afzonderlijke bijdragen van specifieke zenuw populaties, die over het algemeen van meer belang zijn. Wiskundige evaluatie van autonome Toon via spectrale analyse van de macht van bloeddruk en hartslag sporen is handig voor het evalueren van autonome functie bij menselijke proefpersonen, maar deze techniek is mogelijk niet geschikt voor muizen36,37. Directe bemonstering van zenuw activiteit in een bewuste, comfortabel rusten muis is dus ideaal omdat het nauw de natuurlijke, intact autonome status van het subject weerspiegelt en verfijnde evaluatie van de bijdrage van geselecteerde zenuwen naar vergemakkelijkt fysiologische verschijnselen van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
S.M.H. werd gesteund door postdoctorale beurzen van de Canadese instituten voor gezondheid onderzoek (CIHR), hart & beroerte Stichting van Canada (HSFC) en Alberta innoveert Health Solutions (AiHS); J.E.H. wordt ondersteund door een subsidie van de National Heart-, Long- en bloed Instituut PO1HL-51971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
References
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
