Summary
마 취 쥐 비 생리 조직 혈압, 혈압과 자율 신 경계 사이의 친밀 한 관계를 주어진 자율의 의미 있는 평가 하는 걸로 전시. 따라서, 동시에 기록적인 신장 교감 신경 활동을 의식 쥐의 정 맥 주입 혈압 소설 방법 요약.
Abstract
신장 교감 신경 생리 적 및 병 태 생리 현상에 크게 기여 한다. 만성 신장 질환, 고혈압, 심장 마비, 당뇨병, 비만 등 연구의 많은 분야에 큰 관심은 신장 교감 신경 활동 (방사선학) 평가. 교감 신경의 역할의 명확한 평가 따라서 실험 결과의 적절 한 해석 및 질병 과정의 이해에 대 한 필수적입니다. 방사선학은 전통적으로 마 취 설치류, 쥐를 포함 하 여 측정 되었습니다. 그러나, 마우스 일반적으로 전시 매우 낮은 조직 혈압과 hemodynamic 불안정성 몇 시간 동안 마 취와 수술 하는 동안. 방사선학의 의미 해석 교감 신경 음색 및 심장 혈관 상태 사이의 친밀 한 관계를 주어진이 비 생리 적 상태에 의해 혼동 됩니다. 전통적인 접근의 이러한 제한을 해결 하기 위해 우리 의식, 자유롭게 이동 마우스에서 방사선학을 측정 하기 위한 새로운 방법을 개발. 마우스 만성 라디오-telemeters 혈압으로 jugular 정 맥 주입 카 테 터와 방사선학의 직접 녹음에 대 한 사용자 정의 설계 된 양극 전극의 지속적인 모니터링으로 계측 되었다. 48-72 시간 복구 기간에 따라 생존 율 100% 이었고 모든 쥐 행동 일반적으로. 이 시간 포인트에서 방사선학 성공적으로 각각 4와 마우스의 50%와 70%에서 수술 후 5 일 취득 가능한 신호와 마우스의 80%에 기록 되었다. 생리 혈액 압력 모든 쥐에 기록 되었다 (116±2 mmHg, n = 10). 기록 된 방사선학 먹고 정리, 문학에서 확고 한으로 증가. 또한, 방사선학 절 봉쇄 및 약리 작용 혈압의 변조에 의해 확인 되었다. 여기, 의식, 자유롭게 이동 마우스에 방사선학의 명확한 기록에 대 한 효과적이 고 관리 방법을 설명 합니다.
Introduction
생물 의학 연구의 여러 영역에서 마우스를 사용 하 여 관심 수많은 유전자 조작된 모델의 개발을 확장 하 고 있습니다. 대부분의 경우, 기술 진보는 생리학에서 마우스의 사용 증가와 속도 유지 그리고 지금 쥐에 있는 중요 한 생리 적 파라미터 측정을 위해 특별히 개발 된 소형된 장치의 인상적인 선택을. 비록 telemetric 장치에 대 한 직접 측정의 자율 의식 쥐에서 신경 톤 10 년 동안 사용할 수 있다, 의식 쥐의 신경 활동을 평가 하기 위한 소형된 장치는 현재 사용할 수 없습니다. 조사는 일반적으로 간접 방법 (플라즈마 또는 소변 catecholamines, 약리 자율 봉쇄, 혈액의 패턴의 스펙트럼 분석으로 자율 신 경계에의 기여를 평가 하 여이 제한을 회피합니다 압력/심장 박동)1.
이러한 접근 귀중 한 정보를 제공 하는 동안 결과 고립 된 인구 조사 현상에 신경의의 개별 기여를 공개 하는 것 보다는 전반적인 자율 톤의 세계적인 사진입니다. 또는, 특정 신경에서 활동의 직접 녹음 처형 되었습니다 마 취 쥐에는 다양 한 문제를 포즈. 시간 수술을 다음과 같은 몇 가지에 대 한 마 취 마우스에 생리 적 범위 내에서 안정 된 혈압을 유지 하는 것이 상당히 어렵습니다. 사실, 이러한 유형의 실험에서 혈압은 종종 unreported 또는 매우 낮은 수준에서 (즉, 60-80 mmHg 대 > 의식 마우스에서 100mmHg)2. 전시에 마 취 마우스 종종 심장 혈관 시스템의 취약성 걸로 하겠습니다 혈압과 공감 톤3, 간의 종속 관계를 주어 자율 신경 활동의 의미 있는 평가 4.
이 한계를 의식에서 신장 교감 신경 활동 (방사선학)의 직접 녹음에 대 한 새로운 방법을 해결 하기 위해 억제 쥐, 그대로 자신의 집 새 내에서 개발 되었다. 모두이 기술의 성공적인 구현에 대 한 수술 및 실험 방법을 자세히 설명 합니다. 이 준비는 동시에 정 맥 마우스를 방해 하지 않고 관심의 에이전트에 추가 기능이 있는 방사선학, 뿐만 아니라 radiotelemetry 통해 동맥 압력 기록 조사 수 있습니다.
24 시간 수술 후 마우스 정상적으로 동작 하 고 통증이 나 조 난의 표시를 전시 하지 않습니다. 다음 실험 녹음은 마우스 위에 편안 하 게 음식, 물, 환경 농축에 대 한 무제한 액세스를 가정 그것의 감 금에서 동안 수술 후 48-72 시간을 시작할 수 있습니다. 명확한 방사선학 추적 표시 됩니다 하 고 (예: 식사 및 정리) 동물의 정상적인 신체 움직임에이 신경 인구의 특성 응답 조직 혈압의 약리 변조 뿐만 아니라 시연. 품질 및 방사선학 신호의 특이성 더 절 봉쇄에 의해 유효성이 검사 됩니다. 이 원고는이 기술은5의 처음 게시 된 설명에 시청각 보완 포함 되어 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차의 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국가 학회에 있으며 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 미시시피의 대학 의료 센터에 의해 승인 했다.
1. 동물 및 주택
- 기관 실험 동물 시설에 도착시 집 쥐 (24-35 g)
- 표준 설치류 차 우와 수돗물 온도 및 습도 제어 환경에서 실험 프로토콜의 모든 단계에서 ad libitum 마우스를 제공 합니다.
2. 사용자 지정된 제작 삽입형 방사선학 전극의
참고: 구성 삽입형 방사선학 전극 (아래 설명 참조) 치료 하 고 살 균 시간에 맞게 예약된 수술에 앞서 적어도 몇 일.
- 절연된 스테인레스 스틸 여러 가닥 와이어, 250 m m (와이어 직경 0.0254 m m 맨, 코팅 0.14 m m)의 3 개의 동등한 길이 잘라. 메스 블레이드 (선호 #11) 약 15 m m 와이어의 길이의 각각의 한쪽 끝에서 기본 금속을 폭로 단 열 재료의 사용.
- 바이 폴라 전극 리드 (그림 1A)를 만드는 두 전선의 드러난된 끝에 단일 남성 핀 커넥터 (골드 도금 황동) 땜 납. 맨 손으로 세 번째 길이의 와이어의 끝을 남겨 주세요. 이 접지 와이어로 작동 합니다.
- (~2.0-2.5 c m) 짧은 슬립 핀 커넥터 및 와이어 와이어 및 핀 커넥터 사이의 새로 납땜된 조인트를 완전히 커버 1.6 m m 직경 열 수축 튜브의 조각.
참고: 앰프 headstage에 연결 합니다 핀 커넥터의 팁 노출 유지 되어야 합니다. - 한 쌍의 작은 펜 치 또는 hemostats 수축 열에 민감한 튜브와 전기 핀 커넥터와 네트워크 연결을 격리와 총 열 위에 와이어를 잡으십시오. 두 번째 와이어/핀 커넥터에 대 한 반복 합니다.
- 폴 리 에틸렌 튜브의 200 m m 길이 잘라 (PE 90; 내경 0.86 m m, 외부 직경 1.27 m m). 3 전선 (2 리드 + 와이어 접지)를 그룹화 하 고 PE 90 튜빙, 튜빙 (그림 1B)의 오픈 엔드를 통해 그들을 함께 스레딩에 손길이 닿지 않은 끝을 소개.
참고: PE 90 기능으로 그룹화 하 고 전극 보호 칼 집 리드 및 접지 와이어 튜브.- 접지 와이어를 식별 하 고 PE 90 칼 집 통해 바이 폴라 전극 리드에서 그것을 구별 하는 좀 더 당겨.
3입니다. 전극 팁의 건설
- 해 현미경으로 전극 와이어의 손길이 닿지 않은 끝을 시각화. 5 mm-긴 조각을 통해 작은 폴 리 에틸렌 튜브 전극의 3 끝나서 스레드 (PE 10, 내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 전극 와이어를 함께 묶는 것.
- 3 전극 와이어에이 PE 10 튜브 1.5 m m 조각 스레드. 이 튜브 PE 10 조각의 초기 5 m m에서 2.0 m m를 나머지를 사전.
- PE 10 튜브 커버 팁을 보 온 하 고 접지 와이어 (그림 1C)에서 그들을 분리 두 양극 전극 리드의 끝에 두 번째 1.5 m m 조각 스레드.
- 가 위로 전선의 초과 길이 잘라.
- 액체 수식 cyanoacrylate 접착제의 작은 방울으로 개별을 PE 10 튜브 전극 와이어를 붙입니다. 제어를 개선 하 고 흘림 줄일 접착제 튜브의 끝에 무딘된 25 게이지 바늘을 놓습니다.
- 바늘 팁 PE 10와 와이어, 사이 접속점에 다음 접착제의 작은 방울을 분배 놓고 PE 튜브의 내부를 코팅 하는 접착제를 시각화 합니다.
- 완전히 하룻밤 치료 접착제를 허용 합니다.
4. 잘 대비 전극 팁의 기록
- #11 메스 블레이드와 바이 폴라 전극 팁과 접지 와이어의 끝에서 단 열 코팅을 제거 합니다. 방해 하거나 기본 여러 좌초 와이어가의 방사선학 신호 품질에 영향을 미칠 것으로 손상 하지 마십시오.
- 그립 5.0 m m와 1.5 m m PE 10 앵커와 함께 생성 된 전극 곡선 겸 자 하 고 90 ° 각도 (그림 1D)를 형성 하기 위하여 철사를 구 부.
참고:이 책략 신경 번들 요람 최적의 위치에 접지 와이어 위에 양극 전극 리드를 위치 한다.
5입니다. 고정 받침대의 건설
- 구조 안정 전극 받침대 3 cm 조각 폴 리 에틸렌 튜브를 절단 하 여 중간 스카풀라 지역 exteriorization 시 마우스의 리드 (내경 2.70 m m, 외경 4.00 m m).
- 집게와 튜브를 열 총에 한쪽 끝을 녹여. 둥근된 릿지를 만들거나 "플랜지" 멋진 금속 표면에 수직 배관의 열된 끝을 누르십시오.
- 스레드 생성 된 전극에이 받침대는 플랜지 전극 팁을 가리키는.
참고: PE 90 칼 집 및 받침대의 결합 한 번 동물에서 exteriorized 전극 리드를 보호할 것입니다.
6입니다. 살 균이 완료 된 이식 전극의
- 패키지 및 오존 살 균 가방에서 개별적으로 완성 된 전극 이식 전에 (TSO3) 소독.
로이 기관 사이 다릅니다 참고: 살 균 가방 및 절차의 특정 형식에 대 한 로컬 병원 살 균 시설 문의.
7. 마 취와 수술에 대 한 준비
- 무 통 수술 (2 mg/kg meloxicam, 사우스 캐롤라이나)의 시작 하기 전에 20 분 관리. 100% 의학 급료 산소 주입 유도 실에서 마우스를 놓습니다. Isoflurane 4 %0.5 단위로 마 취의 비율을 증가 하는 기화 기 설정을 조정 합니다. 발가락 또는 발 패드의 앞에 적용 하는 부드러운 압력 반사 응답을 평가 하 여 수술 비행기를 평가 하 고 뒷 다리 사지 호흡 속도의 둔화 뿐만 아니라.
- 동물 수술 테이블에 전송 하 고 일단 수술 평면에 도달 하 고 발가락 핀치 반사를 전시 하는 더 이상 1.5 ~ 2%는 nosecone 통해 isoflurane와 마 취를 유지 합니다. 발가락-핀치 응답을 주기적으로 반복 하 고 전체 수술 내내 호흡 속도 평가. 건조를 방지 하기 위해 눈에 안과 연 고를 적용 합니다.
- 젤 가득 등온 열 패드와 해당 수술 테이블 항상 동물의 정상 체온을 유지 합니다. 37 ° C 물 욕조에 등온선 패드를 저장 하 고 패드를 생리 적 체온을 유지 하기 위해 수술 중 필요에 따라 자주 교체.
- 관리 glycopyrrolate (50-70 µ g/k g, 피하 (사우스 캐롤라이나)) 즉시 마 취 유도 시 기도 비의 과도 한 생산을 방지 하기 위해. 이 복용량 glycopyrrolate의 수술 (단계 9.1)의 중간점에 두 번째 시간을 관리 합니다.
- 무 균 조건 하에서 모든 수술 절차를 수행 합니다. 모든 수술 도구 예약된 수술 전에 압력가 되었습니다 확인 합니다. (7.2.1) 아래에 설명 된 수술 필드를 청소 하 고 유지 하는 절차를 통해 불 임.
- 얼굴 마스크, 압력가 고립 가운과 멸 균, 일회용 장갑 착용. 목이 돌아가는 전기 스탠드, 범위 및 70% 에탄올과 수술 테이블 해 부 등 모든 큰 장비를 청소 하십시오. 절차 동안 주기적으로 무 균을 보장 하기 위해 수술 장갑을에 70% 에탄올을 적용 됩니다.
- 작은 동물 발기 depilatory 크림 (민감한 피부에 수식) 다음으로 동물의 왼쪽된 측면, 복 부 목 지역과 midscapular 지역 등에서 머리를 제거 합니다.
- 3 수술 클렌징 솔루션의 응용 프로그램을 번갈아이 두 수술 분야의 피부 정화 (10 %Povidone 요오드)와 70% 에탄올. 수술 클렌징 솔루션의 최종 응용 프로그램과 함께 수술 필드를 준비 합니다.
8. 외과 이식 방사선학 전극의
- 동물의 왼쪽된 측면을 노출 하는 외과 의사의 왼쪽을 가리키는 rostral 끝의 오른쪽에 마우스를 놓습니다. 메스 (#11)와 midscapular 영역의 피부에 5mm 절 개를 확인 합니다.
참고:이는 방사선학 전극 리드 exteriorized 됩니다 사이트입니다.- 두 번째 절 개를 만들기 (< 20 m m)에서 왼쪽된 측면, 척추와 2mm 흉 곽에 꼬리에 수직 overlying 피부. 터널 등 출구 사이트에서 절 개를 피하이 절 개에서에서 13 G 스테인리스 바늘.
참고: 파일 두고 매끄러운, 최첨단-바늘의 날카로운 모서리. - 13 G 바늘을 통해 멸 균된 이식 방사선학 전극 (단계 2-6)를 전달 합니다. 왼쪽된 측면의 복 부 근육에 전극 팁을 다시 13 G 바늘을 당겨. 피부 아래 거짓말 전극 리드의 세그먼트 두고 두고 나머지 길이 등 절 개에서 신흥.
- 두 번째 절 개를 만들기 (< 20 m m)에서 왼쪽된 측면, 척추와 2mm 흉 곽에 꼬리에 수직 overlying 피부. 터널 등 출구 사이트에서 절 개를 피하이 절 개에서에서 13 G 스테인리스 바늘.
- 측에 전극 팁을 놓습니다. 8.1.1에서 피부 절 개를 직접 기본 복 부 근육에 절 개를 확인 합니다. 왼쪽된 신장 폭로 작은 면 밀고 도포 지방과 결합 조직에는 근육에 따라 구분 합니다.
- 마이크로-견인 기를 수술 필드를 열고 신장 철회. 레스터 신장 신경 손상 하 고 배제 가능한 방사선학 신호의 기록 신장 혈관 번들 스트레칭 하지 마십시오.
참고: 스틸 마이크로 브래킷으로 표준 종이 클립 및 4-0 실크의 길이에서 유행 수 있습니다. 이 견인 기 또한 무 균 기술을 유지 하기 위해 수술 기구와 멸 균 확인 합니다.
- 마이크로-견인 기를 수술 필드를 열고 신장 철회. 레스터 신장 신경 손상 하 고 배제 가능한 방사선학 신호의 기록 신장 혈관 번들 스트레칭 하지 마십시오.
- 높은 전력 해 부 현미경의 도움으로 신장 혈관 번들 시각화. 일반적으로 (그러나 항상) 신장 동맥 및 정 맥 함께 실행 됩니다 신장 신경 번들을 식별 합니다. 잘, 집게와 주변 조직에서 신경 다발을 해 부.
참고: 신장 신경 번들 "로프 같은" 반사 모습, 독특한 분명히 표시 림프 혈관에 비해 불투명 나타납니다.- 가능한 조금 신경 다발을 조작 합니다. 터치, 기지개 하거나 마십시오 언제 든 지 신경 번들을 선택 하십시오. 미세 혈관이 신경의 생존 능력을 손상 시킬 것 이기 때문에 지속적인 림프 액체/전극, 신경 주위 풀링 생산 신경, 또는 신장 림프 덕트를 공급 방해 또는 신경 신호를 완전히 없애다 것입니다 방해 하지 않습니다.
- 두고 그대로, 신장 신경 번들 도움이 될 것입니다 신경의 장기적인 생존 능력을 유지 뿐만 아니라 신경 및 (sectioned 신경 전극 시간과 자연 스러운 몸 움직임에서 풀 수는 즉) 전극 사이의 안정적인 접촉을 유지.
- 복 부에 방사선학 전극 팁을 소개 합니다. 바이 폴라 전극 팁과 접지 와이어 신장 혈관 번들에 수직이 되도록 위치를 조정 합니다. 더는 접지 와이어는 내부 조직 좋은 접촉 전극 신장 순환 (그림 1D)를 손상, 신장 혈관을 압축 하지 않는 전극의 위치를 조정 합니다.
- 직각된 포 셉으로 신장 신경 다발을 들어올립니다. 신경, 두 와이어와 직접 접촉에 신경을 떠나 아래 전극 팁이 구 요.
- 신경/바이 폴라 전선과 제 3 (지상) 와이어 (그림 1D) 사이 작은 조각의 파라핀 영화가 구 요.
참고: 담가 24 시간 및 무 균 생리 염 분 주입 이전에 린스 70% 에탄올에 파라핀 영화를 소독 하 고. - 모든 혈액을 제거 또는 작은 흡수와 신경/전극 주위에서 유체 스피어스는 신경 주위 왼쪽으로 어떤 액체 또는 전극 철사 방해 하거나 신경 신호를 소화.
- 신속 하 게 (아래에 설명 된 설정)을 원하는 경우의 방사선학 신호 품질을 테스트 합니다.
참고:이 수행 되어야 합니다 신속 하 게 공기에 노출 신경 건조 하 고 그것의 생존 능력을 손상. - 2 구성 요소 실리콘 고무 아래와 완벽 한 전기적 절연 (즉 단순히 신경 위에 한 방울)을 제공 하기 위해 신경 주위 실리콘 풀 수 있도록 신경/전극 단위에 적용 됩니다.
주: 전극 팁은 실리콘 코팅 또한 확인 하십시오. 접지 와이어 기본 조직을 접촉 유지 해야 하 고 따라서 탄성 중합체가이 와이어 아래 풀에 필요 하지 않습니다. 이 잠재적으로 신장 혈액 흐름을 방해 하는 수 또는 시간 자연적인 몸 움직임으로 제거 되는 불필요 하 게 많은 양의 실리콘 탄성 중합체를 적용 하지 마십시오. - 허용 완전히 치료 실리콘 엘라 스토 머에 대 한 1-2 분 후 신중 하 게 집게와 실리콘 "글로브"의 외부 가장자리를 들어올려 액체 수식 외과 접착제의 작은 금액을 적용 합니다.
참고: 주의 하지이 접착제의 과도 한 금액을 적용 하는 그것 순환에 악영향을 줄 수 있습니다 또는 신경에 확산 하 고 그것의 생존 능력을 손상.
- 신경/바이 폴라 전선과 제 3 (지상) 와이어 (그림 1D) 사이 작은 조각의 파라핀 영화가 구 요.
- 불연속, 흡수 되기 쉬운 봉합 (5-0) 복 부 절 개를 닫습니다. 비슷한 방식으로 동일한 봉합 사 물자 overlying 피부를 닫습니다.
9입니다. 혈압 Radiotelemeter의 주입
- 마우스의 뒷면에 위치를 변경할 의사를 가리키는 rostral 끝. 필요에 따라 마 취 nosecone를 조정 합니다. 관리 glycopyrrolate의 두 번째 복용량이 시점에서 (7.1.3 참조).
- 중간 절 개를 피부에 메스 (#11)와 함께 목 지역의 동물의 낮은 턱 바로 아래에서 시작 하 고 바로 흉 곽 위에 확장을 확인 합니다. 기본 목 근육을 노출 하 선 직물을 구분 합니다. 좌 일반 경 동맥을 노출 하 고 주위 조직에서 분리.
참고: 미주 신경으로 수술 후 사망률 증가 발생할 수 있습니다 손상 않기로 상당한 주의.- 동맥 아래 6-0 비단 봉합 사 물자의 세 가지를 전달 합니다. 하나의 봉합 사 rostrally까지 가능한 놓고 배를 가리고 넥타이. 선박의 길이 따라 두 번째 봉합 미드웨이 느슨하게 묶어. 마지막 봉합 가능한 caudally을 느슨하게 묶어.
- Rostral 대부분 봉합을 철회 하 고 탯 줄 테이프의 작은 조각 가진 nosecone를. 혈관에서 혈액 흐름을 제한 하는 마이크로-모기 집게와 꼬리 대부분 봉합을 철회.
- 가능한 rostrally 좋은 봄이 위 혈관 벽에 작은 절 개를 확인 합니다. 배와 꼬리 봉합에 사전에 마우스 혈압 radiotelemeter 카 테 터를 소개 합니다.
- 일시적으로 카 테 터를 안정, 꼬리 철회 놓고 테 10. 넥타이 봉합 자리에 확보 하 여 카 테 터 주변을 사전에 중간 봉합을 묶어.
- 터널 오른쪽 측면을 따라 피하 포켓에 telemeter 시체.
10. 이식 및 Jugular 정 맥 카 테 터의 Exteriorization
- 작은 면 밀고 도포를 사용 하 여 바로 경 정 맥 노출. 혈관 주위 6-0 비단 봉합 사 물자의 두 가지를 전달 합니다.
- Rostrally까지 가능한 및 배를 가리고 넥타이 한 봉합을 배치 합니다. 두 번째 봉합 가능한 caudally을 부드럽게 혈관에 혈액의 흐름을 중지 하려면 취소.
- 잘 봄이 위를 사용 하 여 가능한 rostral 봉합에 가까운 혈관 벽에 작은 절 개를 만들기 위해. 열 확장 튜브와 함께 정 맥 catheterize (마약 1.02 m m, 외경을 0.64 m m), 멸 균 생리 식 염 수로 채워진 사전입니다.
주: 카 테 터 팁 용기 구멍 뚫 기를 방지 하기 위해 둥근된 경사를 생산 하는 메스로 잘라 확인 하십시오. 참조에 대 한 카 테 터 (죽은 공간)에 있는 액체의 볼륨을 결정 (참조 14.4-14.6 아래 단계).- 정 맥에 카 테 테 르 ~ 8 m m를 사전. 젤 포뮬러 cyanoacrylate 접착제의 작은 방울의 응용 프로그램 뿐만 아니라 선박 및 카 테 테 르, 실크 봉합 매 여 테를 보안 합니다.
- 그것의 왼쪽에 마우스를 놓습니다. 터널 13 G 스테인리스 바늘을 사용 하 여 등 쪽 midscapular 지역에서 목에서 정 맥 카 테 테 르.
- 그의 뒤쪽에 마우스 위치를 변경할. 불연속 봉합 목 절 개를 닫습니다.
- 경향이 위치에 동물을 놓습니다. 스레드 정 맥 카 테 터에 작은 피하 버튼. 고정 봉합 피부 아래 버튼. 정 맥 카 테 터를 통해 해당 스테인리스 봄 스레드 및 카 테 터를 보호 하기 위해 피부 버튼 보안.
11. 보안 Exteriorized 전극 리드
- 폴 리 에틸렌 받침대 보호 전극 리드 조직 접착제로 기본 근육을 보호 합니다. 추가 지원에 대 한 플랜지에 overlying 피부를 봉합.
12. 포스트 외과 복구
- 모든 절에 항생제 연 고를 적용 됩니다.
- 진통 약물을 관리 합니다. 동물 통증이 나 조 난의 흔적을 보여줍니다 하는 경우 복구 기간 동안 필요에 따라 진통 약물의 추가 복용량을 관리 합니다.
- 대사 케이지 늘어서 나무 칩 침구와 복구를 종이 타월에에서 마우스를 놓습니다. 동물을 지속적으로 모니터링 하 고 방치 하지 마십시오 그것 그것 식을 차릴 때까지 sternal recumbency를 유지할 수 있습니다. 이 시점에서 환경 농축 및 음식과 물 (광고 libitum)를 소개 합니다.
- 코일 전극 실험의 시간까지 케이지 외부 리드.
- 복구의 첫 24 시간에 대 한 따뜻한 열 패드 위에 케이지를 놓습니다. 스테인리스 봄, 정 맥 카 테 터 (0.5 mL/hr) 복구 기간 동안 생리 식 염 수의 지속적인 주입을 위한 회전/주입 시스템에 연결 합니다.
- 유지 동물 exteriorized 카 테 터의 특성상 전용된 케이지에서 홀로 지 내게 하 고 전극 리드.
13. 실험 설치 기록 혈압 및 방사선학
- 장비와 간단한 패러데이 케이지 스테인리스 가기 방진 테이블.
참고:이 패러데이 케이지 나무 프레임과 알루미늄 스크린 메쉬를 생성할 수 있습니다. 전기적으로 접지 어떤 전기 잡음을 제거 하기 위해 테이블/패러데이 케이지. - 패러데이 새 장 내에서 혈압 radiotelemetry 수신기를 놓습니다.
- Radiotelemetry 수신기 관련된 압력 출력 어댑터에 연결 합니다. 온라인 기록 혈압 데이터 수집 시스템에이 어댑터를 연결 합니다.
- 솔더 두 여성 핀 커넥터는 쌍, 차폐 된 PVC의 끝에 전극 남성 핀 커넥터 (골드 도금 황동) 무료 케이블 절연. 이 짝된 바나나 플러그 케이블의 반대쪽 끝을 땜 납. 바나나 플러그 preamplification headstage (10 배 확대)에 연결 합니다.
- 이 프리 앰프는 차동 증폭기에 연결 합니다. 신경 신호 x10, 000에 증폭 하는 설정을 조정 합니다. 필터 설정을 다음과 같이 조정: 낮은 컷, 100 헤르쯔; 높은 컷, 1000 Hz입니다.
- 패러데이 케이지 내 수술 후 48 ~ 72 시간에 있는 radiotelemetry 수신기에 마우스를 포함 하는 홈 케이지를 놓습니다. 혈액 압력 신호를 기록 하는 radiotelemetry 프로브를 켭니다.
참고: 수술 전 1 주에 걸쳐 설정에서 홈 케이지를 배치 하 여 마우스를 Acclimating 최적입니다. - 전극 리드를 풉니다 해당 여성 핀 커넥터 (13.4) 위에서 설명한 방사선학 녹음 하려면 양극 전극의 핀 커넥터를 연결 하 고.
- 표시 하 고 동시에 생리 식 염 수 또는 관심의 솔루션을 일으키는 동안 혈압 신호는 컴퓨터 온라인을 기록 합니다. 초당 2500 샘플의 최소 속도에서 레코드 데이터입니다.
14. 실험 프로토콜 및 방사선학 신호의 유효성 검사 샘플
- 마우스는 새 장에 그들의 가정, 음식 및 물으로 억제 편안 하 게 확인 하십시오. 정상 모양 및 동작을 확인 하는 것에 대 한 기관 동물 관리 지침을 따릅니다.
- 집 쥐 같은 온도 및 습도 제어 룸에서 어떤 방사선학 녹음 열릴 예정 이다. 정 맥 주입은 위에서 설명한 대로 계속 하도록.
- 동물 기준 혈압과 방사선학 데이터의 1 시간을 기록 하기 전에 위에서 설명한 녹음 설정에 위치 하 고 있습니다 일단 안정화의 적어도 30 분을 허용 합니다. 동물 이기 때문에 자연 스러운 움직임 증가와 관련 된 동 정적인 음색에 기록 하는 동안 조용히 휴식을 확인 하십시오. 참고 때 동물 그래서이 분석 중 무시 될 수 있습니다 기록 하는 동안 디지털 추적에 직접 이동 합니다.
- 처음에 의해 baroreflex 응답을 천천히 테스트 주입 라인 nitroprusside 나트륨 (염 분의 25 µ L의 볼륨에 몸 무게의 2.5 µ g/g)의 bolus 주사. 천천히 ~ 50 µ L 생리 식 염 수와 라인을 플러시. 카 테 터 죽은 공간 선택이 취소 되어 있는지 확인 합니다. 혈압을 기록 하 고 2 ~ 5 분에 대 한 방사선학.
- 천천히 phenylephrine (20 µ g/g의 염 분의 25 µ L에 몸 무게) bolus 주사. ~ 50 µ L 생리 식 염 수와 플러시. 카 테 터 죽은 공간 선택이 취소 되어 있는지 확인 합니다. 혈압을 기록 하 고 추가로 10 ~ 15 분에 대 한 방사선학.
- 절 차단, 주입 라인에 늄 (25 µ L 염 분에 50 µ g/g 몸 무게) bolus를 천천히 주입 하 여 신경 신호의 postganglionic 특성을 확인 합니다. ~ 50 µ L 염 분으로 플러시. 카 테 터 죽은 공간 선택이 취소 되어 있는지 확인 합니다. 몇 분 동안 녹화를 계속 합니다.
- (아래 설명 참조) 방사선학의 분석에 사용 하기 위해 배경 잡음의 추정으로 늄 관리 후 남아 있는 잔여 활동을 사용 합니다.
- Isoflurane (stepwise 복용량 0.5 최대 5%의 증가)의 과다와 함께 마우스를 안락사 고 추가 30 분에 대 한 방사선학을 녹음을 계속 합니다. 참고: 나머지 신호도 사용할 수 있습니다 배경 잡음의 추정으로 방사선학의 분석을 위해.
15. 데이터 분석
- 사용 데이터 수집 소프트웨어 원시 혈압과 방사선학 추적 분석 하.
- 디지털 통합 하 고 전체 파 해결할이 소프트웨어를 사용 하 여 원시 방사선학 추적. 정수 설정;에 대 한 "절대 필수적인" 선택 0.1 초6의 시간 상수 감퇴를 적용 합니다.
- 실험 프로토콜의 각 세그먼트에 대 한 통합 된 방사선학 신호 (µV·s의 단위로 표시)를 분석 합니다. 이동 하는 동물 일 때 기록의 세그먼트를 무시. 각각 기준선과 실험의 실험 부분에 대 한 적어도 3 측정을 가져가 라.
- Baroreflex 민감도 평가 하기 위해 각각 나트륨 nitroprusside 또는 phenylephrine, 달성 하는 최소 및 최대 혈압 수준에서 방사선학을 분석 합니다.
- 평균 측정 된 개별 값 위에 실험 프로토콜의 각 부분에 대 한 단일 값을 생성 합니다.
- 1007에서 지정 된 기준선에서 방사선학의 비율 변화를 계산 하 여 방사선학 응답 계량. 적절 한 완전 한 통계 분석입니다.
참고:이 예제에서는 나트륨 nitroprusside와 phenylephrine 방사선학의 응답의 통계 분석 완료 학생의 t 시험; 중요성 P 값으로 받아들여졌다 < 0.05.
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Representative Results
설명 된 프로토콜에 따라 생존 율 100%-모든 쥐가이 연구 살아남 고 잘 수술 절차에 따라 복구에 계측 했다. 수술 준비, 모든 마우스 행동을 일반적으로, 일반적인 식사, 전시 손질 및 예비 동작의 24 시간 이내 아니 동물이 이번에 통증이 나 조 난의 흔적을 보여주었다. 48 시간 수술, 검증 하 고 명확한 방사선학 신호 12 쥐에서 10에 기록 되었다. 그러나이 신호는 수술이 쥐 72 시간 후에 유지 되었다, 진정한 방사선학 신호 기록 했다 7 (70%)에 쥐의 하루 4, 5 일 후 수술에 의해 단 5 (50%) 마우스. 심전도 신호에 의해 전기 노이즈 또는 오염이 높은-품질 방사선학 신호를 전시 하지 않았다 쥐 euthanization의 시간까지 건강에 아직도 있었다.
의식이 쥐 48 시간 후 수술에서 동맥 압력은 596±22 bpm의 해당 의미 심장 박동으로 116±2 mmHg (n = 10). 이 시간에 혈압과 방사선학의 대표적인 샘플의 동시 녹음 방사선학 (그림 2)의 명확 하 게 표시 하 고 독특하게 리듬 버스트를 시연 했다. 식사 및 정리, 직접 관찰 하 고 (그림 3)는 또한 제시 했다 직원에 의해 지적, 같은 정상적인 활동으로 예상 하는 방사선학의 일반적인 증가 합니다. 높은-품질 방사선학 또한 기록 했다 순차적으로 조사를 받고 쥐의 50%에서 최대 수술 준비 (그림 4) 후 5 일. 혈압과 심장 박동 5 일 조사 기간에 대 한 안정적인 유지 하 고 값 다른 우리 최대 10 일 수술 후 회복 (표 1)8의 다음 기록 했다.
방사선학 신호를 확인 하 고 동맥 baroreflex와 실제로 개입 확인, 혈압 약리학 나트륨 nitroprusside과 phenylephrine의 정 맥 주입으로 조작 했다. 방사선학의 동맥 압력; 나트륨 nitroprusside 유발 감소에 대 한 응답에서 독특하게 증가 반대로, 방사선학 phenylephrine 유발 증가 동맥 압력 (그림 5)에 따라 사실상 침묵 했다. 양적, 나트륨 nitroprusside 기준선 수준 이상 77±9% 방사선학의 상승에 대응 62±3 mmHg로 혈압 감소 (n = 5; P < 0.05, 그림 6). 마찬가지로, phenylephrine 관리, 다음과 같은 동맥 압력 도달 137±6 mmHg, 방사선학 기준선 수준 79±2% 감소 (n = 5; P < 0.05, 그림 6). 또한, 방사선학 완전히 탈락 했다 다음 늄 (그림 7)와 함께 절 봉쇄 방사선학 신호 후 절 자연 설정.
그림 1: 건설 및 이식 신장 교감 신경 전극의 배치. 디자인 및 이식 신장 교감 신경 전극의 권장된 배치 도식 묘사 (A) 양극 리드 핀 커넥터를 장착 하 고 세 번째 접지 와이어. (B) 전선 exteriorized 리드를 보호 하기 위해 폴 리 에틸렌 (PE) 90 튜브를 통해 스레드입니다. (C) 접지 와이어에서 바이 폴라 리드를 분리 하기 위하여 전극 팁의 디자인. (D) 전극 팁 촉진 최적의 위치; 90 ° 각도로 구 부 러 신장 신경 번들 양극 리드에 수직 고 왁 스 기반 실험실 영화에서 기본 조직을 접촉 하는 접지 와이어 리드 격리 됩니다. 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 녹음 동맥 압력 및 신장 교감 신경 활동 (방사선학). 조직 동맥 혈압의, 방사선학 및 의식, 조용히 휴식 마우스에서 통합된 방사선학 동시 녹음 수술 준비 다음 48 시간을 보여 주는 샘플 추적입니다. 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 응답 신장 교감 신경 활동 (방사선학)의 정상적인 신체 활동을. 대표 조직 동맥 혈압의, 방사선학 및 두 의식 쥐 48 및 72 시간 수술 초기에 고 (A) 활성 손질 또는 (B) 조용한 식사의 시작 시에 통합된 방사선학 갖춘 동시 녹음을 추적 합니다. 큰 화살표는 나머지에서 신체 활동의 시작을 나타냅니다. 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 장기 신장 교감 신경 활동 (방사선학) 신호 생존. 한 의식, 조용히 휴식 마우스 몇 일 수술 준비에에서 혈압과 방사선학의 순차적 대표 기록. (A) 2 일, (B) 3 일, (C) 4 일 및 (D) 5 일 후 수술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 동맥 baroreflex로 신장 교감 신경 활동 (방사선학) 신호 유입. (C) phenylephrine 대표적인 녹음 동맥 혈압 및 방사선학의 나머지에서 의식 마우스에서 (A) 초기 동안 및 (B) 나트륨 nitroprusside의 후속 정 맥 관리 후 다음. 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 신장 공감 responsivity 동맥 혈압의 정량. 나트륨 nitroprusside와 phenylephrine 약리 조작 동맥 혈압 및 신장 교감 신경 활동 (방사선학)의 양적 응답. (A) 기준 (검은 바, 116±2 mmHg)와 나트륨 nitroprusside (회색 바, 62±3 mmHg)과 phenylephrine (오픈 바, 137±6 mmHg)의 후속 정 맥 주사 관리에 따라 동맥 압력을 의미 합니다. (B) 대응 나트륨 nitroprusside (회색 바, 77±9%) 또는 phenylephrine (오픈 바;-79±2%) 하는 동안 방사선학 응답 합니다. 방사선학 표현 기준, 평균 ± SEM.에서에서 백분율 변경 * 기준에서 중요 한 차이 (p < 0.05, n = 5). 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 신장 교감 신경 활동 (방사선학)의 후 절 자연. (A) (B) 직후 늄 및 (C) 사후 절 봉쇄 기준선에서 동맥 혈압 및 방사선학의 대표적인 추적입니다. 권한5재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 동물 ID | 2d | 3d | 4 d | 5 d | |
| A | mmHg | 112 | 110 | 108 | 109 |
| bpm | 657 | 551 | 626 | 616 | |
| B | mmHg | 115 | 107 | 111 | 110 |
| bpm | 582 | 652 | 662 | 668 | |
| C | mmHg | 115 | 118 | 113 | 111 |
| bpm | 591 | 599 | 689 | 664 | |
| D | mmHg | 114 | 115 | 116 | 110 |
| bpm | 457 | 513 | 599 | 531 | |
| E | mmHg | 109 | 109 | 103 | 105 |
| bpm | 632 | 687 | 699 | 689 |
표 1: 기준 평균 동맥 압력 및 심장 박동 값 계측된 마우스 이상 5 일 연속 수술에. 권한5재현.
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Discussion
여기 우리 설명, 시연 하 고 의식 마우스, 이동 하 고 그들의 홈 장에서 편안 하 게 휴식 무료에서 방사선학의 대상된 평가 대 한 새로운 방법을 확인. 동맥 압력 radiotelemeter, 내재 주입 정 맥 카 테 터와 맞춤형 바이 폴라 방사선학 전극의 외과 주입, 다음 마우스 수술에서 회복 하 고 48-72 시간에 그대로 남았다. 마우스 편안 하 게 정착 남아 새 장에 그들의 가정 (를 포함 하 여 실험 기간) 항상 음식, 물, 환경 농축에 대 한 무제한 액세스를. 조사에 의해 모든 다음 실험 조작 원격 고 동물을 disquiet 하지 않았다. 품질 및 방사선학 신호 해석,이 이렇게 완전히 제거 구속 뿐만 아니라 마 취와 수술 외상의 바람직하지 못한와 피할 수 없는 생리 적 합병증과 신체적, 정신적 스트레스의 다른 소스 동물입니다. 따라서, 동 정적인 신경 활동 측정의 해석을 변함없이 영향 있는 이러한 심각한 혼란 요소를 효과적으로 삭제 되었다.
모든 마우스 좋은 건강에을 일찍 수술 24 시간 후, 밝기, 활동, 응답성, 먹고, 마시고, 손질로 쾌활 하 고 예비 동작 등 일반적인 동작을 표시 합니다. 모든 동물 이러한 특성을 전시 하 고 적극적으로 실행 가능한 방사선학 신호 기록 수 여부에 관계 없이 제공 된 환경 농축 약혼. 비록 완전히 복구 시간이 필요 복원 radiotelemetric 프로브의 다음 주입은 소문에 하면 4-7 일9, 동맥 압력 반환 정상으로 훨씬 더 빨리, 값에 의해 표시 된 대로 정상적인 혈압 혈압과 심장 박동에 대 한 여기를 보고. 사실, 이러한 심장 혈관 매개 변수는 이전에 보고 된 최대 허용 했다 마찬가지로 계측 동물에서 10 일 수술8,10에서 회복 하기 위해 그.
유체-채워진 카 테 테 르 통해 혈압 측정을 위한 radiotelemetric 프로브를 사용 하 것은 고의적으로,이 쥐에 게 스트레스를 감소 하 고 또한 더 명확 하 고 신뢰할 수 있는 혈액과 펄스 압력 신호 및 심장 박동 값11을 생성. 이후 자주 플러시하고 액체 가득 동맥 카 테 테 르는 필연적으로 방해 하지 동물, heparinized 염 분으로 유지의 필요가 완전히 제거 기록 혈압 telemetric 기술을 사용 하 여 추가 이점을 포즈. 또한, 수술, 고정 및 정 맥 카 테 터와 바이 폴라 전극 리드 보호 우리의 접근 방법부터 피하 포켓12리드의 임시 저장소를 설명 하는 다른 보고서에 비해 이상적 이다 exteriorizing의 접근 심지어 간단한 다시 마 취와 수술 조작 실험 기록, 직전 동물의 의심할 여 지 없이 마우스를 교란 고 품질과 뛰어나고 정교 중요 한 자율 신경의 손상 방지 데이터입니다.
이 메서드는 품질 조용히 마우스를 쉬고 편안, 배경 잡음에 명확 하 게 구별 전기 활동의 특성 파열에 의해 시연 진정한 방사선학 신호를 생성 합니다. 또한, 방사선학 및 문학13,14에서 보고 먹고 조용한 손질 같은 동물에 신체 활동에 일반적인 응답을 보여주었다. 자연 스러운 움직임 또는 동물의 경계와 예상 방사선학 특성 증가 감안할 때, 그것은 따라서 절대적 참고 실험 분석을 목적으로이 기간을 제외 하 고는 기록의 세그먼트에 집중 하는 동물을 조용히 휴식 하 고. 이 데이터의 가능한 오해를 방지할 수 있습니다. 데이터 오해도 이어질 수 있는 다른 요소에는 ECG 펄스15신호 오염 뿐만 아니라 전기 노이즈 또는 간섭, 포함 됩니다. Exteriorized 부분의 전극 리드의 과도 한 움직임의 방사선학 신호 품질에도 영향을 미칠 수 있다 고는 불안정 하거나 "떨리는"으로 나타날 수 있습니다. 때때로 신호 간섭 수의 이러한 소스 표시 및 자발적으로 확실 하 게 기록 하는 동안 사라지고 분석5,,1516에서 제외 해야 합니다. 추가 고려는 기록을 얻을 수 있습니다 하는 시간 이다. 혈압과 방사선학 할 다릅니다 circadian 리듬과 실험을 실시이 잠재적으로 혼란 함을 주 죠 요소를 피하기 위해 하루 중 같은 시간에 이상적입니다 그래서 중요 하다. 이 연구에서 우리 않았다 관찰 하지 circadian 진동으로 인해 혈압과 방사선학의 중대 한 다양성으로 우리 사이 오전 10 6-잘 일광 주기의 동물 주택 시설 내에서 모든 매개 변수를 기록. 이 보고서의 또 다른 중요 한 구성 요소 처럼, 실제로 동맥 baroreflex와 최은 방사선학 신호의 유효성 검사입니다. 조직의 혈액 압력에 있는 급속 한 감소와 약리학 유도 드롭 증가와 동시에 방사선학의 해발 고도 감안할 때, 동맥 baroreflex는 가장 확실히 그대로-자체의 그 폐색 이식 보여줍니다는 radiotelemetry 한 경 동맥에 카 테 터 정상적인 심장 혈관 기능을 방해 하지 않습니다. 늄 추가와 절 봉쇄 시 방사선학 신호의 가상 실종 postganglionic 방사선학의 기록을 확인합니다.
그러나 우리와이 분야에서 다른 인식 만성 계측 동물, 특히 쥐, 자율 신경의 장기적인 생존 능력을 유지 하기 어려운 남아 있다, 쥐에 대 한 더 이상 수술 후 회복 기간을 제공 하는 이상적인 것입니다. 방사선학 신호 품질 저하 수술 후 몇 일간의 과정 동안, 하지만 여전히 안정적으로 기록 하 진정한 방사선학 모든 마우스에서 적어도 3 일 연속에 대 한 동물의 절반 정도에서 최대 5 일 동안 가능 했다. 그 자체로이 성취 생쥐에서 자율 연구의 분야에 획기적인을 의미합니다. 여러 실험을 기록 하 고 재판에서 같은 동물 다른 일에, 물론, 예 심 순서 및 적절 한 초기 기록의 랜덤 수를 제어할 수로 또한,이 방법 귀중 한 유전자 변형 동물의 사용을 극대화 각 실험17전에. 그것은 의식 설치류18,19,20 telemetric 신경 기록 쥐 에 대 한 기술 발전 등에서 실시 하는 장기 동 정적인 신경 녹음의 성공적인 보고서를 보고 격려 15,21. 의식이 마우스에 사용 하기 위해이 기술의 소형화 출간 이며 그 동안, 우리는이 기술을 확장 하는 실험적인 창 고 아마도 더 이상 허용 교감 신경 섬유의 장 수를 증가 하기 위하여 향상 노력 수술 후 회복 시간입니다. 그러나,이 방법 유용 하 고 쉽게 접근 하 고 저렴 한 대체/보완 어떤 미래 발달 든 지에 남아 telemetric 신경 녹음 기술의 마우스, 전용된 장비 및 일반 장치에 투자 필요에 유지 보수입니다.
쥐에 있는 심장 혈관과 자율 기능을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요 정말 대 단, 모델 생물 의학 연구의 분야에서 유전자 변형 마우스에 점점 관심을 고려 적이 있다. 그러나 생리학, 있다 아직까지 표준화 및 마우스에서 자율 기능을 평가 하기 위한 접근을 최적화 갈의 많은 분야에서 큰 진보를 만들어왔다. 날짜 하려면, 의식 마우스12감각 신경 활동의 한 보고서 설명 측정이입니다. 이 방법은 방광 감각 신경 활동의 측정을 설명 하 고 과정에서 마 취와 수술 조작 실험 녹음 직전 피하 배치 카의 쥐의 물리적 구속을 포함 실험 프로토콜12의. 이러한 요소는 신경 신장 신경 뿐만 아니라 관심의 다양 한 기록에 확실히 맞출 수 존재 방식으로 완전히 피할 수 있는 스트레스를 알려져 있습니다. 그러나 의식 쥐에서 교감 신경 측정 더 최근에, 보고 되었습니다, 그리고,이 측정은 크게 실시 시간 진통 관리22의 언급으로 수술 준비를 다음. 자율 기능 이러한 보고서 이외에도 달리 되어 마 취 쥐에 독점적으로 평가. 문학의 철저 한 검토 생성 한 다양 한 접근, 시간-긴 실험 기간, 마 취 조합/복용량, 기계 환기와 자주 창조적인 조치를 일부 유사 베어링 상태에서 마우스를 유지 하는 생리 (즉 산소는 동물의 코를 향해 직접 날 려)23,,2425,26,27,28,29, 30,31. 이러한 연구 중 혈압 값의 보고서는 결 석, 또는 abysmally 낮은-조직의 동맥 압력2의 생리 적인 범위입니다. 이것은 많은 수준에 있지만 특히 문제가 그래서이 동물에 자율 기능에 대 한 적절 한 평가 걱정 주어 혈압과 자율 톤 사이 설립된 링크. 스스로 마 취 에이전트 직접 그 마 취 따 윈 공감 활동을 제안 하는 많은 보고서와 동 정적인 음색에 영향을. 사실, 증거, 보여 그 우 레 탄, 급성 신경 실험32기록에 대 한 가장 널리 선택된 마 취 복용량 독립적으로 감소 방사선학33 고 동맥 baroreflex34을 억제. 반대로, 다른 보고서는 우 레 탄 동 정적인 음색35증가 것이 좋습니다. 그러나 허락 하신다면, 이러한 연구는 일반적으로 기록 된 기준선에서 변화로 실험 신경 활동 비교, 위에 설명한 조건 하에서 자율 신경의 상태 변경된 대단한 걸로 신경에 개별 변경 내용 감지 활동입니다.
이 방법의 도전 의식이 신경 녹음에 대 한 마우스의 성공적인 준비에 필요한 외과 기술에 주로 있다. 그러나 제작이 기술을 연마에 대 한 투자 이상의 품질과 직접적인 방사선학 데이터의 신뢰성에 의해 보상 된다. 이 접근은 완전히 자율 제어 플라즈마 카 테 콜 아민 수준, 쥐에서 매우 불안정 하 고 고통 없이 수집된36수 있는 혈액의 양에 의해 제한 등의 간접 평가로 인 한 한계를 circumvents. 또한, 플라즈마 카 테 콜 아민 수준 뿐만 아니라 약리 자율 봉쇄 견적 전반적인 자율은 일반적으로 더 많은 관심의 특정 신경 인구의 개별 기여 반대1 톤. 그러나 혈압과 심장 박동 추적의 파워 스펙트럼 분석을 통해 자율 톤의 수학 평가이 기술은 쥐36,37적응 되지 않을 수 있습니다 인간의 과목, 자율 기능을 평가 하는 데 유용 합니다. 따라서, 의식, 편안 하 게 휴식 마우스에서 신경 활동의 직접 샘플링은 밀접 하 게 피사체의 자연, 그대로 자율 상태를 반영 하 고 선택 된 신경에의 기여의 정교한 평가 용이 하 게 이상적 이다 관심의 생리 적 현상입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
S.M.H. 건강 연구 (CIHR), 심장 및 스트로크 재단의 캐나다 (HSFC) 및 앨버타 혁신적인 건강 솔루션 (AiHS);에 대 한 캐나다 기관에서 박사 장학금에 의해 지원 되었다 J.E.H.는 국가 심 혼, 폐 및 혈액 연구소 PO1HL-51971에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
References
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
