Summary
Bedøvet mus viser ikke-fysiologiske systemisk blodtrykk, som utelukker meningsfull vurdering av autonome tone gitt intime forholdet mellom blodtrykk og det autonome nervesystemet. Således, en ny metode for å samtidig posten nyre sympatiske nerve aktivitet og blodtrykk med intravenøs infusjon i bevisst mus er skissert.
Abstract
Nyre sympatiske nerver bidrar betydelig til både fysiologiske og patofysiologiske fenomener. Evaluere nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) er av stor interesse i mange områder av forskning som kronisk nyresykdom, hypertensjon, hjertesvikt, diabetes og fedme. Utvetydig vurdering av rollen som det sympatiske nervesystemet er avgjørende for riktig tolkning av eksperimentelle resultater og forståelse av sykdom prosesser. RSNA har tradisjonelt blitt målt i bedøvet gnagere, inkludert mus. Imidlertid viser mus vanligvis svært lav systemisk blodtrykk og hemodynamic ustabilitet i flere timer under anestesi og kirurgi. Meningsfull tolkning av RSNA er forvirret av denne ikke-fysiologisk tilstand, gitt intime forholdet mellom sympatisk nervøs tone og kardiovaskulær status. For å løse denne begrensningen av tradisjonelle tilnærminger, utviklet vi en ny metode for å måle RSNA i bevisst, fritt flytte mus. Mus ble kronisk instrumentert med radio-telemeters for kontinuerlig overvåking av blodtrykk samt en jugulare venøs infusjon kateter og spesialdesignede bipolar elektrode for direkte opptak av RSNA. Etter en 48-72 timers restitusjonsperiode, overlevelse var 100% og alle mus oppførte seg normalt. På dette tidspunkt registrert RSNA er i 80% av mus, med levedyktig signaler kjøpt opp til 4 og 5 dager etter operasjonen i 70% og 50% av mus, henholdsvis. Fysiologiske blodtrykk ble registrert i alle mus (116±2 mmHg; n = 10). Innspilte RSNA økt med spise og stell, så godt etablert i litteraturen. Videre ble RSNA godkjent av ganglionic blokaden og modulering av blodtrykket med farmakologiske agenter. Her, er en effektiv og administrerbar metode for tydelig opptaket av RSNA i bevisst, fritt flytte mus beskrevet.
Introduction
Interesse i å bruke mus i flere områder av biomedisinsk forskning fortsetter å utvide med utviklingen av utallige genmodifiserte modeller. For det meste, tekniske fremskritt har holdt tritt med økt bruk av mus i fysiologi og det er nå et imponerende utvalg av miniatyriserte enheter utviklet spesielt for å måle viktige fysiologiske parametere i mus. Selv om telemetrisk enheter for direkte måling av autonome nervøs tonen i bevisst rotta er tilgjengelig for over et tiår, miniatyriserte enheter for å vurdere nerve aktivitet i bevisst mus er ikke tilgjengelige. Etterforskerne vanligvis omgå denne begrensningen ved å evaluere bidrag av det autonome nervesystemet indirekte metoder (i.e. plasma eller urin katekolaminer farmakologiske autonome blokaden, spektral analyse av mønstre av blod Trykk/hjertefrekvens)1.
Disse gir verdifull informasjon, er resultatet et globalt bilde av samlet autonome tone, i stedet for å avsløre diskret bidrag av isolerte bestander av nerver til fenomenet under etterforskning. Alternativt, direkte opptak av aktivitet fra bestemte nerver er utført i bedøvet mus, som utgjør en rekke bekymringer. Det er meget vanskelig å opprettholde stabilt blodtrykk innenfor fysiologiske området i en bedøvet mus for flere timer etter operasjonen. Faktisk disse typer eksperimenter, blodtrykk ofte urapporterte eller presentert på svært lave nivåer (dvs. 60-80 mmHg vs > 100mmHg i en bevisst mus)2. Sårbarheten i det kardiovaskulære systemet utstilt i en bedøvet musen forberedelse ofte utelukker meningsfull vurdering av autonome nerve aktivitet, gitt codependent forholdet mellom blodtrykk og sympatisk tone3, 4.
For å løse denne begrensningen, en ny metode for direkte opptak av nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) i bevisst, uhemmet mus, uforstyrret i burene sine hjem ble utviklet. Både den kirurgiske og eksperimentelle tilnærmingen for vellykket implementering av denne teknikken er beskrevet i detalj. Dette preparatet kan etterforskeren samtidig registrere arterieblodtrykk via radiotelemetry i tillegg til RSNA, med det addert evnen å sette intravenøst mot agenter rundt uten å forstyrre musa.
Tjuefire timer etter operasjonen, mus fungerer normalt og ikke vise tegn på smerte eller ubehag. Eksperimentell opptak kan deretter starte 48 til 72 timer etter operasjonen når musen hviler komfortabelt i buret sitt hjem med ubegrenset tilgang til mat, vann og miljømessig berikelse. Klart RSNA spor presenteres og karakteristiske svarene på nerve befolkningen til normale fysiske bevegelser av dyr (som spiser og grooming) er vist i tillegg farmakologiske modulering av systemisk blodtrykk. Kvaliteten og spesifisitet av RSNA valideres videre av ganglionic blokade. Dette manuskriptet inneholder det audiovisuelle supplement til en opprinnelig publiserte beskrivelse av denne teknikken5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer er i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av University of Mississippi medisinske senter.
1. dyr og bolig
- Huset mus (24 – 35 g) ved ankomst i institusjonelle laboratorium dyr anlegget.
- Tilby mus standard gnager chow og springvann ad lib i alle stadier av eksperimentelle protokollen i en temperatur og fuktighet kontrollert miljø.
2. tilpasset fabrikasjon av implanterbare RSNA elektroden
Merk: Konstruere implanterbare RSNA elektroden minst et par dager før den planlagte kirurgiske prosedyren for herding og sterilisering tid (beskrevet nedenfor).
- Kutte tre like store deler av isolerte rustfri flere-strandet ledningen, 250 mm (tråddiameter 0.0254 mm nakne, 0,14 mm belagt). Bruk en skalpell blad (fortrinnsvis #11) til å strippe ca 15 mm isolasjonsmateriale å avdekke de underliggende metall fra en slutten av lengden på ledningen.
- Lodde en enkelt mann pinnerskontakt (messing med gull) til bared slutten av bare to av ledninger for å opprette bipolar elektroden fører (figur 1A). La slutten av tredje lengden på kabelen nakne. Dette vil fungere som bakken ledningen.
- Ta en kort (~2.0 - 2,5 cm) stykke 1,6 mm diameter varme-shrink rør over pinnerskontakt og wire å dekker nylig loddet felles mellom wire og pin kontakten.
Merk: Spissen av pin kontakten som blir plugget inn forsterker headstage må være utsatt. - Hold ledningen over varmepistol med et par små tang eller hemostats å krympe varmefølsomme slangen og elektrisk isolere forbindelsen mellom pin kontakten og ledningen. Gjenta for de andre wire/pinnerskontakt.
- Kutte en 200 mm lengde av polyetylen rør (PE 90; indre diameter 0,86 mm ytre diameter 1.27 mm). Gruppere tre ledninger (to fører + bakken ledning) og innføre urørt ender i PE 90 slangen, threading dem sammen gjennom til den åpne enden av slangen (figur 1B).
Merk: PE 90 rør funksjoner som en skjede gruppere og beskytte elektroden fører og bakken ledning.- Identifisere bakken ledningen og trekk den gjennom PE 90 skjede et lite stykke å skille det fra bipolar elektroden fører.
3. Bygg elektrode tips
- Visualisere urørt endene av ledningene elektrode med dissecting mikroskop. Tråd tre løse endene av elektroden gjennom en 5 mm - lang stykke mindre polyetylen rør (PE 10, indre diameter 0,28 mm ytre diameter 0,61 mm) binde elektrode ledningene sammen.
- Tråden en 1,5 mm stykke denne PE 10 rør til tre elektrode ledningene. Fremme denne slangen til hvile 2.0 mm fra første 5 mm stykke PE 10.
- Tråden en andre 1,5 mm stykke PE 10 rør på tuppen av de to bipolar elektrode fører til dekke og isolere tips og skille dem fra bakken ledningen (figur 1 c).
- Trim overflødig lengden av ledningene med saks.
- Fest enkeltdelene PE 10 rør til elektroden ledninger med en liten dråpe flytende formel cyanoacrylate lim. Plass en avstumpet 25 gauge nål på slutten av lim røret å forbedre kontroll og redusere utslipp.
- Plasser pinne-spissen i krysset mellom PE 10 og wire, deretter dispensere en liten dråpe lim og visualisere lim belegg på innsiden av PE slangen.
- At limet til fullt cure over natten.
4. fine forberedelse elektrode tips for innspilling
- Stripe isolerende belegg fra bipolar elektrode tips og spissen av bakken ledningen med #11 skalpell blad. Ikke forstyrr eller skade den underliggende flere strandet ledninger som dette vil påvirke kvaliteten på RSNA signalet.
- Grep konstruert elektroden mellom 5.0 mm og 1,5 mm PE 10 ankere med buet tang og bøy ledninger for å danne en 90-graders vinkel (figur 1 d).
Merk: Denne manøveren skal plassere bipolar elektroden fører over bakken ledningen, i optimal plassering å vugge nerve bunten.
5. bygging av forankring sokkelen
- Konstruere en pidestall å stabilisere elektroden fører til området midt scapular musen på exteriorization ved å kutte en 3 cm stykke polyetylen rør (indre diameter 2,70 mm ytre diameter 4.00 mm).
- Grip slangen med tang og smelte ene enden over varmepistol. Trykk oppvarmet slutten av rør vinkelrett til kule metall å lage en avrundet rygg eller "kant".
- Tråd denne sokkelen på konstruert elektroden, slik at flensen peker mot elektrode spissen.
Merk: En kombinasjon av PE 90 skjede og pidestall vil beskytte elektroden fører en gang exteriorized fra dyr.
6. sterilisering av fullførte implanterbare elektroden
- Pakken fullført elektroden enkeltvis i sterilisering poser og ozon sterilisere (TSO3) før implantasjon.
Merk: Ta kontakt med lokale sykehuset sterilisering anlegget om bestemt type sterilisering bag og prosedyre som dette skiller mellom institusjoner.
7. anestesi og forberedelse til operasjon
- Administrere analgesi 20 minutter før starten av kirurgi (2 mg/kg har meloksikam, S.C.). Plass musen i en induksjon kammer fylt med 100% medisinsk karakter oksygen. Justere vaporizer for å øke andelen isoflurane anestesi i intervaller på 0,5 å nå 4%. Evaluere kirurgisk fly ved å vurdere refleks svaret lett press brukt på tærne eller foten pads for forgrunnen og hind lemmer og bremse av respirasjonsfrekvens.
- Overføre dyret til tabellen kirurgiske og vedlikeholde anestesi med 1,5 til 2% isoflurane via en nosecone når den har nådd kirurgisk flyet og ikke lenger viser det toe-klype refleks. Gjenta tå-klype svaret regelmessig og vurdere respirasjonsfrekvens gjennom hele kirurgiske prosedyren. Ophthalmica salve gjelde øyne å hindre tørrhet.
- Opprettholde dyrets normal kroppstemperatur hele tiden med gel-fylt isotermiske varme pads og tilsvarende kirurgisk tabellen. Lagre isotermiske pads i et 37° C vannbad og erstatte pads så ofte som nødvendig under operasjonen for å opprettholde fysiologiske kroppstemperatur.
- Administrere glycopyrrolate (50-70 µg/kg, subcutaneously (S.C.)) å hindre overdreven produksjon av luftveiene sekreter umiddelbart etter induksjon av anestesi. Administrere denne dose av glycopyrrolate en gang midt i den kirurgiske prosedyren (trinn 9.1).
- Gjennomføre alle kirurgiske prosedyrer under aseptiske forhold. Kontroller alle kirurgiske verktøy har vært autoklaveres før planlagt kirurgi. Rengjøre kirurgiske feltet som beskrevet nedenfor (7.2.1 Oppgi) og vedlikeholde sterilitet i hele denne prosedyren.
- Bære en ansiktsmaske, autoklaveres isolasjon kappe og sterile, engangs hansker. Rengjør alle store utstyr som svanehals lampe, dissekere omfang og kirurgisk tabell med 70% etanol. Regelmessig under prosedyren, gjelde 70% etanol kirurgiske hansker slik sterilitet.
- Fjerne hår fra dyrets venstre flanke, ventral nakken regionen og dorsal midscapular regionen med liten dyr hårklippere etterfulgt av depilatory fløte (sensitiv hud formel).
- Rense huden på disse to kirurgisk feltene med 3 vekslende anvendelser av kirurgiske rensing løsningen (10% povidon jod) og 70% etanol. Forberede kirurgiske feltet med en siste programmet av kirurgiske rensing løsningen.
8. kirurgisk implantering av RSNA elektroden
- Plasser musepekeren på høyre side med rostral enden som peker til kirurgens venstre, utsette dyrets venstre flanke. Gjøre en 5 mm snitt i huden av den midscapular regionen med en skalpell (#11).
Merk: Dette er området der RSNA elektroden fører vil være exteriorized.- Gjør andre snitt (< 20 mm) i huden overliggende venstre flanke, vinkelrett ryggraden og 2 mm caudal til brystkasse. Tunnel en 13G rustfritt stål p subcutaneously fra denne snitt til innsnitt på webområdet dorsal exit.
Merk: Filen skarpe kanter på nålen å forlate en glatt, ikke-cutting edge. - Passere 13G nålen sterilisert implanterbare RSNA elektroden (trinn 2 - 6). Dra 13G pinnen tilbake for å forlate elektrode spissen på abdominal muskler av venstre flanke. La et segment av elektroden fører liggende under huden, og la gjenværende lengder fremvoksende fra dorsal innsnitt.
- Gjør andre snitt (< 20 mm) i huden overliggende venstre flanke, vinkelrett ryggraden og 2 mm caudal til brystkasse. Tunnel en 13G rustfritt stål p subcutaneously fra denne snitt til innsnitt på webområdet dorsal exit.
- Plassere elektrode til side. Gjør et snitt i bukmuskel direkte underliggende hud innsnitt i 8.1.1. Skill fat og bindevev langs ryggen muskler med små bomull-tipped påføring å avsløre venstre nyre.
- Åpne kirurgiske feltet med mikro-retractors og trekke nyrene. Gjøre ikke for å strekke nyre nevrovaskulære bunten, hvilke ville irreversibelt skade nyre nerver og utelukke opptak av et levedyktig RSNA signal.
Merk: Steel mikro-retractors kan bli formet fra en standard binders og en lengde av 4-0. Kontroller disse retractors er også sterilisert med Kirurgiske instrumenter for å bevare steril teknikk.
- Åpne kirurgiske feltet med mikro-retractors og trekke nyrene. Gjøre ikke for å strekke nyre nevrovaskulære bunten, hvilke ville irreversibelt skade nyre nerver og utelukke opptak av et levedyktig RSNA signal.
- Visualisere nyre nevrovaskulære bunten ved hjelp av en høy makt dissekere mikroskop. Identifisere nyre nerve bundle, som vanligvis (men ikke alltid) bilterminalen nyre arterien og venen. Dissekere nerve bunten fra omkringliggende vev med fine, rett tang.
Merk: Nyre nerve bunten vises ugjennomsiktig, med en «tau-lignende» reflekterende utseende, unike sammenlignet lymfekar, som synes klart.- Manipulere nerve bunten mulig. Ikke rør, strekke eller plukke opp i nerve-gruppen til enhver tid. Ikke avbryte fine blodårene forsyne nerve eller nedsatt lymfe røret fordi dette vil invadere levedyktigheten til nerve og produsere kontinuerlig lymfe væske pooling rundt nerve/elektroden, som vil hindre eller helt utslette nerve signalet.
- La nyre nerve bunten intakt, som vil hjelpe bevare langsiktig levedyktighet av nerve samt opprettholde stabil kontakt mellom nerve og elektroden (dvs. en delt nerve kan gli ut av elektroder med tid og naturlig kroppsbevegelser).
- Innføre RSNA elektrode spissen i magen. Justere sin posisjon slik at bipolar elektrode tips og bakken ledningen er vinkelrett til nyre nevrovaskulære bunten. Videre justere plasseringen av elektroden slik at bakken ledningen har god kontakt med underliggende vev og elektroden ikke komprimere nyre fartøyene, akkord nedsatt sirkulasjon (figur 1 d).
- Løft nyre nerve bunt med vinklet tang. Slip elektrode spissen under nerve, forlater nerve i direkte kontakt med både ledninger.
- Sett en liten bit av parafin film mellom nerve/bipolar ledninger og tredje (bakken) ledningen (figur 1 d).
Merk: Suge sterilisere parafin filmen i 70% etanol i 24 timer og skyll i sterilt fysiologiske saltvann før implantasjon. - Fjerne alle blod eller væske fra rundt nerve/elektroden med små absorberende spears som væske venstre rundt nerve eller elektrode ledninger vil hindre eller slukke nerve signalet.
- Raskt teste kvaliteten på RSNA signalet hvis ønskelig (setup beskrevet nedenfor).
Merk: Dette må gjøres raskt eksponering til luft vil tørke nerve og kompromiss sin levedyktighet. - Bruke en to-komponent silikon-elastomer nerve/elektrode enheten, sikrer at silikon bassengene under og rundt nerve til å gi fullstendig elektrisk isolasjon (dvs. ikke bare en dråpe på nerve).
Merk: Kontroller elektrode tips er også belagt i silikon. Bakken ledningen bør forbli i kontakt med underliggende vev og dermed elastomer trenger ikke bassenget under denne ledningen. Unngå å bruke en unødvendig stor mengde silikon-elastomer som dette kan potensielt hindrer nyre blodstrøm, eller bli forskyves med naturlig kroppsbevegelser med tid. - La 1-2 minutter for silikon-elastomer å kurere helt, deretter forsiktig løfte ytterkant silikon "glob" med tang og Påfør en liten mengde flytende formel kirurgisk lim.
Merk: ta vare ikke for å bruke mye av denne lim, som det kanskje svekket omløpet eller spres til nerve og kompromiss sin levedyktighet.
- Sett en liten bit av parafin film mellom nerve/bipolar ledninger og tredje (bakken) ledningen (figur 1 d).
- Lukk den abdominal snittet med usammenhengende, absorberbare suturer (5-0). Lukk overliggende huden likt med samme Sutur materialet.
9. implantering av blodtrykk Radiotelemeter
- Flytte musen på ryggen, med rostral enden som peker mot kirurgen. Juster anestesi nosecone etter behov. Administrere andre dosen av glycopyrrolate på dette punktet (se 7.1.3).
- Gjøre en midtlinjen snitt i huden i nakken regionen med en skalpell (#11), begynner fra like under dyrets underkjeven og utvide like over brystkasse. Skille kjertel vev for å avdekke de underliggende nakkemusklene. Utsette den venstre arteria carotis communis og separat fra omkringliggende vev.
Merk: Ta stor forsiktighet for ikke å skade nervus vagus som dette kan føre til økt post-kirurgisk dødelighet.- Passere tre stykker av 6-0 silke Sutur materialet under arterien. Plasser en Sutur så langt rostrally som mulig og knytte det occlude fartøyet. Plasser en andre Sutur halvveis langs fartøyet og knytte løst. Plasser det siste suture så caudally som mulig og knytte løst.
- Trekke det rostral mest suture og sikre nosecone med et lite stykke umbilical tape. Trekke det caudal mest suture med mikro-mygg tang å begrense blodtilførsel i fartøyet.
- Lag et lite innsnitt i fartøyet veggen med fine våren saks så rostrally som mulig. Introdusere musen blodtrykk radiotelemeter kateter inn i fartøyet og videre til den caudal Sutur.
- Tie det midterste suture midlertidig stabilisere kateter, slipper caudal tilbakekallingen og fremme kateter 10 mm. slips suture rundt kateter å sikre på plass.
- Tunnel telemeter kroppen til en subcutaneous lomme langs høyre flanke.
10. implantasjon og Exteriorization av den jugulare venekateter
- Bruk små bomull-tipped påføring til å eksponere riktig vena jugularis. Passere to stykker av 6-0 silke Sutur materiale rundt fartøyet.
- Plasser en Sutur så langt rostrally som mulig og knytte til occlude fartøyet. Plasser det andre suture så caudally som mulig og forsiktig trekke for å stoppe blodstrøm i fartøyet.
- Bruke fine våren saks for å gjøre et lite innsnitt i fartøyet veggen så nær det rostral suture som mulig. Catheterize åre med varme-strakte rør (OD 1.02 mm, strukket til OD 0,64 mm), som er før fylt med sterilt fysiologiske saltløsning.
Merk: Kontroller kateter tipset er skåret med en skalpell å produsere en avrundet skråkant for å hindre fartøyet perforering. Finne volumet av væske i kateter (død mellomrom) for referanse (se trinn 14.4-14.6 nedenfor).- Forhånd kateter ~ 8 mm i venen. Sikre kateter ved å binde silke bildet rundt fartøyet og kateter, samt bruk av en liten dråpe gel formelen cyanoacrylate lim.
- Plass musen på venstre side. Tunnel til intravenøs kateter fra halsen til avkjørselen dorsal midscapular regionen bruker en 13G rustfritt stål nål.
- Flytte musen på ryggen. Stenge incision halsen med usammenhengende suturer.
- Plassere dyret i liggende stilling. Tråden en liten subkutan knapp på venekateter. Sikre knappen under huden med suturer. Tråden tilsvarende rustfritt stål våren over venekateter og fest den på huden for å beskytte kateter.
11. å sikre Exteriorized elektroden fører
- Sikre polyetylen pidestall beskytte elektroden fører til underliggende muskler med vev limet. Sutur overliggende huden over flensen for ytterligere støtte.
12. etter kirurgisk utvinning
- Antibiotikaresistens sårsalve gjelde alle snitt.
- Administrere smertestillende medisiner. Administrere flere doser av smertestillende medisiner som trengs under restitusjonsperioden hvis dyret viser tegn til smerte eller ubehag.
- Plass musen i metabolske bur med tre chip sengetøy og papirhåndkle å gjenopprette. Kontinuerlig overvåker dyr og ikke la det uovervåkede før den gjenvinner bevisstheten og kan opprettholde sternal recumbency. Introdusere miljømessig berikelse og næringen og vann (ad libitum) på dette punktet.
- Coil elektroden fører utenfor cage inntil eksperimentet.
- Plass buret over en varm heten pute for de første 24 timene av utvinning. Koble rustfritt stål våren og intravenøs kateter til en dreibar/infusjon system for kontinuerlig infusjon fysiologiske saltoppløsning under restitusjonsperioden (0,5 mL/t).
- Sikre dyret forblir enkeltvis ligger i en dedikert bur på grunn av den exteriorized kateter og elektroden fører.
13. eksperimentelle oppsett for opptak blodtrykk og RSNA
- Utstyre et rustfritt stål øverste anti-vibrasjon bord med en enkel buret.
Merk: Denne buret kan konstrueres med en tre ramme og aluminium skjermen mesh. Elektrisk bakken tabell/buret for å eliminere eventuelle elektrisk støy. - Plassere en blodtrykk radiotelemetry mottaker i buret.
- Koble den radiotelemetry mottakeren til tilknyttede press-utgangsadapteren. Koble dette kortet til data oppkjøpet til posten blodtrykk online.
- Lodde to kvinnelige pinnerskontakter som er gratis for elektrode mannlige pinnerskontakter (messing med gull) til endene av en sammenkoblet, skjermet PVC isolert kabel. Loddetinn de motsatte endene av denne koblet kabelen til banan plugger. Koble banan pluggene til en preamplification headstage (10 X forsterkning).
- Koble denne forforsterker til en differensial forsterker. Justere for å forsterke nerve signalet x10, 000. Justere filterinnstillingene som følger: Low cut, 100Hz; Høy klippe, 1000 Hz.
- Plass hjem buret med musen på radiotelemetry mottakeren ligger i buret 48 til 72 timer etter operasjonen. Slå på radiotelemetry sonden registrere blodtrykk signaler.
Merk: Acclimating musen ved å plassere hjem buret i oppsettet i løpet av 1 uke før kirurgi er optimale. - Uncoil elektrode fører og koble pinnerskontakter av bipolar elektroden til tilsvarende kvinnelige pinnerskontakter beskrevet ovenfor (13.4) å registrere RSNA.
- Vise og samtidig opp blodtrykk signaler online med en datamaskin under infusjonen fysiologiske saltvann eller løsning av interesse. Registrere data med en minimum hastighet på 2500 eksempler per sekund.
14. prøve eksperimentelle protokollen og validering av RSNA Signal
- Kontroller at mus er komfortabel i deres hjem bur, uhemmet med fri tilgang til mat og vann. Følg dyr institusjon retningslinjer for å bekrefte normalt utseende og virkemåte.
- Huset musene i samme temperatur og luftfuktighet kontrollert rom i hvilke RSNA opptak finner sted. Sikre intravenøs infusjon fortsetter som beskrevet ovenfor.
- Tillat minst 30 minutter av stabilisering Når Dyret ligger i opptak oppsett beskrevet ovenfor før innspillingen en time av planlagte blodtrykk og RSNA data. Sikre dyret ligger stille under innspillingen siden naturlig bevegelse er knyttet til økning i sympatisk tone. Merk Når Dyret går direkte på digital spor under opptak, slik at dette kan bli ignorert under analyse.
- Teste baroreflex svaret av første sakte injisere bolus av natrium nitroprusside (2,5 µg/g kroppsvekt i et volum på 25 µL saltoppløsning) i infusjon linjen. Sakte flush linjen med ~ 50 µL fysiologiske saline. Sikre kateter døde mellomrom er fjernet. Registrere blodtrykk og RSNA i 2 til 5 minutter.
- Sakte injisere bolus av phenylephrine (20 µg/g kroppsvekt i 25 µL saltoppløsning). Skyll med ~ 50 µL fysiologiske saline. Sikre kateter døde mellomrom er fjernet. Registrere blodtrykk og RSNA for ytterligere 10 til 15 minutter.
- Kontroller postganglionic natur nerve signalet ved å injisere sakte bolus av ganglionic blokkering, hexamethonium (50 µg/g kroppsvekt i 25 µL saltvann) i infusjon linje. Skyll med ~ 50 µL saltvann. Sikre kateter døde mellomrom er fjernet. Fortsette innspillingen i flere minutter.
- Bruke gjenværende aktiviteten som gjenstår etter hexamethonium administrasjon som en vurdering av støy i bakgrunnen for bruk i analyse av RSNA (beskrevet nedenfor).
- Euthanize musen med en overdose av isoflurane (gradvis dosering i intervaller på 0,5 opptil 5%) og fortsette innspillingen RSNA for ytterligere 30 minutter. Merk: Gjenværende signalet kan også brukes som et overslag bakgrunnsstøy for analyse av RSNA.
15. dataanalyse
- Bruk oppkjøpet programvare å analysere rå blodtrykk og RSNA spor.
- Integrere digital og full-bølge rette rå RSNA spor bruk av denne programvaren. Velg "Absolutt integrert" for integrert innstillinger; bruke en tid konstant decay 0,1 sekunder6.
- Analysere integrert RSNA signalet (vises i enheter av µV·s) for hvert segment av eksperimentelle protokollen. Ignorere segmenter av opptaket Når Dyret skjedde til å flytte. Ta minst 3 mål for grunnlinje og eksperimentelle deler av eksperimentet, henholdsvis.
- Analysere RSNA på minimum og maksimum blodtrykk nivå oppnådd for natrium nitroprusside eller phenylephrine, henholdsvis for å vurdere baroreflex følsomhet.
- Gjennomsnittlig enkeltmål tatt over for hver del av eksperimentelle protokollen til en enkeltverdi.
- Kvantifisere RSNA svaret ved å beregne Prosentvis endring av RSNA fra grunnlinjen, som er utpekt ved 100%7. Fullstendig statistisk analyse etter behov.
Merk: I dette statistisk analyse av responsen av RSNA natrium nitroprusside og phenylephrine ble fullført med en Student t -test; betydning ble akseptert med P -verdier < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter beskrevet protokollen var overlevelse 100% - alle mus instrumenterte i denne studien overlevde og kommet til hektene frisk etter den kirurgiske prosedyren. Innen 24 timer etter kirurgisk forberedelse, alle mus oppførte seg normalt viser typisk spise, grooming og utforskende atferd. Ingen dyr viste noen tegn til smerte eller ubehag på dette tidspunktet. 48 timer etter operasjonen, ble en verifiserbar og helt RSNA signal innspilt i 10 av 12 musene. Dette signalet ble opprettholdt i disse mus 72 timer etter operasjonen, men en ekte RSNA signal ble registrert i 7 (70%) av mus dag 4 og i bare 5 (50%) mus av dag 5 etter operasjonen. Mus som ikke ha et høykvalitets RSNA signal på grunn av elektrisk støy eller forurensning av elektrokardiogram signaler var fortsatt i god helse inntil euthanization.
Mener arteriell trykket i bevisst mus 48 timer etter operasjonen var 116±2 mmHg, med en tilsvarende Gjennomsnittlig hjertefrekvens 596±22 bpm (n = 10). Samtidig innspillingen av et representativt utvalg av blodtrykk og RSNA nå demonstrert tydelig og karakteristisk rytmisk bursts av RSNA (figur 2). Den typiske økningen av RSNA forventet med normale aktiviteter som spising og grooming, som direkte observert og fremgår av personell, var også til stede (figur 3). Høy kvalitet RSNA ble også innspilt sekvensielt i 50% av musene under etterforskning opp til 5 dager etter kirurgisk forberedelse (figur 4). Blodtrykk og hjertefrekvens stabilt i den 5 etterforskning perioden og verdiene var ikke de har vi registrert etter opp til 10 dager etter kirurgisk utvinning (tabell 1)8.
For å validere RSNA signalet og kontrollere at det er faktisk entrained med arteriell baroreflex, var blodtrykk farmakologisk manipulert med en intravenøs injeksjon av natrium nitroprusside og phenylephrine. RSNA økt karakteristisk i respons til natrium nitroprusside-indusert reduksjon av arterieblodtrykk; derimot var RSNA nesten forstummet etter phenylephrine-indusert økning i arterial Press (figur 5). Kvantitativt, natrium nitroprusside redusert blodtrykk til 62±3 mmHg, som tilsvarte rettighetsutvidelse RSNA 77±9% over baseline nivåer (n = 5; P < 0,05, figur 6). På samme måte etter phenylephrine administrasjon, arterieblodtrykk nådd 137±6 mmHg, som redusert RSNA med 79±2% under grunnlinjen nivå (n = 5; P < 0,05, figur 6). Videre RSNA ble fullstendig slått ut etter ganglionic blokaden med hexamethonium (figur 7), etablere etter ganglionic natur RSNA signalet.
Figur 1: konstruksjon og plassering av implanterbare nyre sympatiske nerve elektroden. Skjematisk fremstilling av design og anbefalte plassering av implanterbare nyre sympatiske nerve elektroden. (A) bipolar fører utstyrt med pinnerskontakter og en tredje bakken ledning. (B) ledninger er tredd gjennom polyetylen 90 slangen å beskytte exteriorized fører. (C) Design elektrode tips for å skille den bipolare fører fra bakken ledningen. (D) elektroden tips er bøyd i 90° vinkel å lette optimal posisjon. nyre nerve bunten plasseres vinkelrett bipolar fører og voks-baserte laboratoriet filmen isolerer fører fra bakken ledningen som er i kontakt med underliggende vev. Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant innspillingen arteriell press og nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA). Prøven spor demonstrere samtidig opptak av systemisk arterial blodtrykket, RSNA og integrert RSNA en bevisst, stille hviler musen 48 timer etter kirurgisk forberedelse. Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Svar nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) normal fysiske aktivitet. Representant spor med samtidig innspillingen av systemisk arterial blodtrykket, RSNA og integrert RSNA i to bevisst mus 48 og 72 timer etter kirurgi ved baseline og (A) ved begynnelsen av aktive grooming eller (B) stille spise. Store piler angir begynnelsen av fysisk aktivitet fra resten. Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Langsiktig nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) signal levedyktighet. Sekvensiell representant opptak av blodtrykk og RSNA en bevisst, stille hviler musen flere dager etter kirurgisk forberedelse. (A) 2 dager, (B) 3 dager, (C) 4 dager og (D) 5 dager etter operasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Entrainment av nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) med arteriell baroreflex. Representant opptak av arterial blodtrykket og RSNA i en bevisst mus i ro under (A) baseline og etter påfølgende intravenøs administrasjon av (B) natrium nitroprusside etterfulgt av (C) phenylephrine. Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Kvantifisering av nyre sympatisk responsivity til arterial blodtrykket. Kvantitativ svar av arterial blodtrykket og nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA) på farmakologiske manipulering med natrium nitroprusside og phenylephrine. (A) at arteriell press ved baseline (svart linje, 116±2 mmHg) og etter påfølgende intravenøs administrasjon av natrium nitroprusside (grå bar, 62±3 mmHg) og phenylephrine (åpen bar, 137±6 mmHg). (B) tilsvarende RSNA svar under natrium nitroprusside (grå bar, 77±9%) eller phenylephrine (åpen bar, -79±2%). RSNA uttrykkes en prosentendring fra grunnlinjen, gjennomsnittlig ± SEM. * betydelig forskjell fra grunnlinjen (p < 0,05, n = 5). Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Etter ganglionic natur nyre sympatiske nerve aktivitet (RSNA). Representant spor av arterial blodtrykket og RSNA ved (A) baseline, (B) umiddelbart etter ganglionic blokaden med hexamethonium og (C) post-mortem. Gjengitt med tillatelse5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Dyr ID | 2D | 3D | 4d | 5d | |
| A | mmHg | 112 | 110 | 108 | 109 |
| BPM | 657 | 551 | 626 | 616 | |
| B | mmHg | 115 | 107 | 111 | 110 |
| BPM | 582 | 652 | 662 | 668 | |
| C | mmHg | 115 | 118 | 113 | 111 |
| BPM | 591 | 599 | 689 | 664 | |
| D | mmHg | 114 | 115 | 116 | 110 |
| BPM | 457 | 513 | 599 | 531 | |
| E | mmHg | 109 | 109 | 103 | 105 |
| BPM | 632 | 687 | 699 | 689 |
Tabell 1: Opprinnelige mener arteriell press og hjertefrekvens verdier i instrumenterte mus over 5 dager etter operasjonen. Gjengitt med tillatelse5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi skissert, demonstrert og godkjent en ny metode for målrettet evaluering av RSNA i bevisst mus, flytte og hvile godt i burene sine hjem. Etter kirurgisk implantasjon av en arterieblodtrykk radiotelemeter, en iboende intravenøs infusjon kateter og en spesialdesignet bipolar RSNA elektrode, mus frisk fra kirurgi og var igjen uforstyrret 48 til 72 timer. Mus forble komfortabelt utlignet i deres hjem bur til enhver tid (inkludert eksperimentelle perioder) med ubegrenset tilgang til mat, vann og miljømessig berikelse. Alle påfølgende eksperimentelle manipulering av utprøver var ekstern og disquiet ikke dyr. Om kvaliteten og tolkning av RSNA fjernes denne tilnærmingen fullstendig uønsket og uunngåelig fysiologiske komplikasjoner av anestesi og kirurgisk traumer, samt tilbakeholdenhet og andre kilder til fysisk og psykisk stress til dyret. Dermed ble disse alvorlige forvirrende faktorer som alltid påvirke tolkningen av sympatiske nerve aktivitet målinger effektivt eliminert.
Alle mus var i god helse og så tidlig som 24 timer etter operasjonen, vises typisk opptreden som lysstyrke, aktivitet, respons, spise, drikke, grooming leken og utforskende atferd. Alle dyr utstilt disse egenskapene og engasjert aktivt med den angitte miljømessig berikelse uansett hvorvidt et levedyktig RSNA signal kunne registreres. Selv om utvinningen tid må fullstendig gjenopprette normal blodtrykk følgende implantasjon av radiotelemetric sonden er angivelig som 4-7 dager9, arterieblodtrykk tilbake til normal mye raskere, som demonstrert av verdiene rapporteres her for blodtrykk og hjertefrekvens. Faktisk er disse kardiovaskulære parametere tilsvarende de tidligere rapportert i tilsvarende instrumenterte dyr som fikk opp til 10 dager å gjenopprette fra kirurgi8,10.
Velge å bruke radiotelemetric sonder på blodtrykket måling over et væskefylte kateter var bevisst, som dette reduserer stress i mus og også gir mer klar og pålitelig blod og puls press signaler og hjertefrekvens verdier11. Bruke telemetrisk teknologi til posten blodtrykk utgjør en ekstra fordel siden måtte ofte flush og opprettholde væske fylte arteriell kateter med heparinized saltvann, som uunngåelig forstyrrer dyret, er helt eliminert. Også tilnærming av kirurgisk exteriorizing, forankring og beskytte intravenøs kateter og bipolar elektroden fører er ideelt i forhold til andre rapporter beskriver midlertidig lagring av leder i en subcutaneous lomme12, siden vår tilnærming unngår selv kort re-anestesi og kirurgisk manipulasjon av dyret umiddelbart før eksperimentelle opptak, som vil utvilsomt forurolige musen og kompromittere kvaliteten og interpretability av utsøkt sensitive autonome nervesystemet data.
Denne metoden gir sanne RSNA signaler, kvaliteten som er demonstrert av karakteristiske bursts av elektrisk aktivitet klart kan skilles fra bakgrunnsstøy i en avslappet, rolig hviler musen. I tillegg viste RSNA vanlig respons til fysisk aktivitet i dyr som grooming og rolig spise som rapportert i litteraturen13,14. Gitt den karakteristiske økningen i RSNA forventet med naturlig bevegelse eller årvåkenhet av dyret, det er dermed viktig å oppmerksom og utelate disse perioder for eksperimentell analyse og fokusere på segmenter av opptaket som den dyr er stille hviler. Dette hjelper for å forhindre mulig feiltolkning av dataene. Andre faktorer som kan føre til data feiltolkning er elektrisk støy eller forstyrrelser, samt signal forurensning med ECG pulser15. Overdreven bevegelse av den exteriorized delen av elektroden fører kan også påvirke kvaliteten på RSNA signalet og kan vises som en ustabil eller "vaklende" baseline. Til tider disse kildene av signal forstyrrelser kan vises og spontant forsvinner under helt klart registreringen og bør utelukkes fra analyse5,15,16. Tas er tiden som de er oppnådd. Det er viktig å merke seg at blodtrykk og RSNA varierer med døgnrytme, så er det ideelt å utføre eksperimenter på samme tid på dagen for å unngå denne potensielt forvirrende faktoren. I denne studien observerer vi ikke betydelig variasjon av blodtrykk og RSNA på grunn av circadian svingninger som vi registrerte alle parametere mellom 10 am og 6 pm - godt innenfor dagslys syklusen av dyr bolig. En annen viktig del av denne rapporten er validering av RSNA signalet, som som vist, er faktisk entrained med arteriell baroreflex. Gitt rask reduksjon og heving av RSNA parallelt med farmakologisk-indusert drop og økning i systemisk blodtrykket, arteriell baroreflex var absolutt intakt - som selv viser at occlusive implantering av den radiotelemetry kateter i en arteria carotis forstyrrer ikke normalt hjerte-funksjon. Den virtuelle forsvinningen av RSNA signalet på ganglionic blokaden med hexamethonium videre bekrefter innspilling av postganglionic RSNA.
Det ville være ideelt å gi lengre etter operasjonen gjenoppretting for mus, men vi og andre i dette feltet anerkjenner at opprettholde langsiktig levedyktighet av autonome nerver i kronisk instrumenterte dyr, spesielt mus, fortsatt utfordrende. Selv signalkvaliteten RSNA redusert i løpet av flere dager etter operasjonen, var det fortsatt mulig å pålitelig spille ekte RSNA for minst 3 dager i alle mus og opp til 5 dager i omtrent halvparten av dyrene. Denne prestasjon i seg selv innebærer et gjennombrudd innen autonome studier i mus. Videre er maksimerer denne metoden bruk av dyrebare transgene dyr, det er mulig å registrere flere eksperimentelle og kontroll prøvelser i samme dyret på ulike dager, selvfølgelig, tillater for tilfeldiggjøring av rettssaken ordre og riktig planlagt opptak før hvert eksperiment17. Det er oppmuntrende å se vellykkede rapporter om langsiktig sympatiske nerve opptak i bevisst gnagere18,19,20 inkludert fremskritt i telemetrisk nerve opptaket teknologier for rotter 15,21. Miniatyrisering av denne teknologien for bruk i bevisst musen er imøtekommende og i mellomtiden vi streber etter å forbedre denne teknikken for å øke levetiden til sympatisk nervefibrene til utvide vinduet eksperimentelle og kanskje tillate en lengre etter operasjonen utvinning tid. Men vil denne metoden forbli en nyttig og lett tilgjengelig og rimelig alternativ/supplement til eventuelle fremtidige utviklingen i telemetrisk nerve lagringsteknologi i mus, som krever en investering i dedikert utstyr og vanlige enhet vedlikehold.
Behovet for pålitelig teknikker for å vurdere hjerte og autonome funksjon i mus har aldri vært så stor, vurderer stadig voksende interessen transgene musen modeller innen biomedisinsk forskning. Store fremskritt er gjort i mange områder av fysiologi, men det er fortsatt langt å gå standardisering og optimalisere tilnærminger for å vurdere autonome funksjon i musen. Dato er det en rapport som beskriver måling av sensoriske nerve aktivitet i de bevisste musen12. Denne tilnærmingen skisserer måling av blæren sensoriske nerve aktivitet og innebærer anestesi og kirurgisk manipulasjon av subcutaneously plassert katetre umiddelbart før eksperimentelle opptak og fysisk selvbeherskelse av mus i løpet av eksperimentelle protokoll12. Disse faktorene er kjente stressfaktorer som helt unngås med nåværende tilnærming, som sikkert kan skreddersys for opptak av en rekke nervene rundt i tillegg til nyre nerver. Flere nylig, sympatiske nerve målinger i bevisst mus er rapportert, men disse målingene er hovedsakelig utført timer etter kirurgisk forberedelse, med ingen omtale av smertestillende administrasjon22. Bortsett fra disse rapportene, er autonome funksjonen ellers vurdert i bedøvet mus. En grundig gjennomgang av litteratur gir en rekke tilnærminger, timer lange eksperimentelle varighet, bedøvende kombinasjoner/doser, mekanisk ventilasjon og ofte kreative tiltak for å opprettholde mus i en tilstand med noen skinn til den fysiologiske (i.e. oksygen blåst direkte mot dyr nesen)23,24,25,26,27,28,29, 30,31. Blant disse studiene er rapporter om måleverdier fraværende eller abysmally lav - under fysiologiske området systemisk arteriell press2. Dette er problematisk på mange nivåer, men spesielt så når riktig vurdering av autonome funksjon i disse dyrene er bekymret, gitt etablerte koblingen mellom blodtrykk og autonome tone. Anestesi agenter seg påvirke direkte sympatisk tone, med mange rapporter tyder på at anestesi demper sympatisk aktivitet. Faktisk bevis viser at uretan, det mest valgte anesthetic for akutt nerve opptak eksperimenter32, dose dependently minsker RSNA33 og hemmer arterielle baroreflex34. Omvendt, andre rapporter tyder på at uretan øker sympatisk tone35. Gitt, slike studier vanligvis sammenligne eksperimentelle nerve aktivitet som en endring fra opprinnelig innspilt plan, men endret tilstanden i det autonome nervesystemet under betingelsene ovenfor beskrevet unektelig utelukker påvisning av diskrete endringer i nerve aktivitet.
Utfordringen av denne metoden ligger hovedsakelig i kirurgiske ferdigheter kreves for vellykket utarbeidelse av musen for bevisst nerve opptak. Men investeringen i honing disse ferdighetene er mer enn motvirket av kvaliteten og påliteligheten av direkte RSNA data produsert. Denne tilnærmingen omgår helt begrensningene som indirekte vurderinger av autonome kontroll som plasma katekolaminer nivåer, som er ganske labil i mus og er begrenset av mengden av blod som kan være humant samlet36. I tillegg plasma katekolaminer nivå samt farmakologiske autonome blokaden estimat samlet autonome tone1 i motsetning til separate bidrag av bestemte nerve befolkningsgrupper, som er generelt mer interessante. Matematisk evaluering av autonome tone via makt spektral analyse av blodtrykk og hjertefrekvens spor er nyttig for å vurdere autonome funksjon i menneskelig fag, men denne teknikken kan ikke tilpasses mus36,37. Derfor er direkte utvalg av nerve aktivitet i en bevisst, komfortabelt hviler musen ideelt som det tett gjenspeiler naturlig, intakt autonome status av faget og forenkler sofistikert bedømmelse for forholdet mellom de valgte nerver til å fysiologiske fenomener av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
S.M.H. ble støttet av postdoktor stipend fra Canadian institutter for helse forskning (CIHR), Heart & Stroke Foundation av Canada (HSFC) og Alberta fornyer Health Solutions (AiHS); J.E.H. støttes av et stipend fra National hjerte, lunge og blod Institute PO1HL-51971.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Teflon-coated stainless steel multiple stranded wire | A-M Systems | 793200 | 0.001in diameter bare; 0.0055in diameter coated |
| #11 Scalpel Blade | Fisher Scientific | ALMM9011 | |
| Soldering Iron and solder | Any make or model suitable | ||
| Male miniature pin connectors | A-M Systems | 520200 | Brass with gold plating |
| Female miniature pin connectors | A-M Systems | 520100 | Brass with gold plating |
| Heat Shrink tubing | Radio Shack | Model #: 278-1610 | Catalog #: 2781610 | 1.6 mm diameter |
| Polyethylene 90 (PE90) tubing | VWR | CA-63018-703 | 0.86mm inner diameter; 1.27mm outer diameter |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica M80 | Any make or model also suitable |
| Polyethylene 10 (PE10) tubing | Braintree Scientific | PE10 50 FT | 0.28mm inner diameter; 0.61mm outer diameter |
| Super Glue Liquid | Loctite | n/a | Liquid Formula; any brand suitable |
| Super Glue Gel | Loctite | n/a | Gel Formula; any brand suitable |
| Polyethylene tubing | Scientific Commodities | BB31695-PE/13 | For pedestal 2.7mm inner diameter; 4.0mm outer diameter |
| Hospital Sterilization Services & Ozone Sterilization packets | Contact local hospital sterilization services | ||
| Isoflurane anesthesia | Abbott | 05260-05 | |
| Deltaphase isothermal heat pads & surgical table | Braintree Scientific | 39OP | Keep heat pads warm in a 37°C water bath; Corresponding surgical table essential |
| Glycopyrrolate | Amdipharm Mercury Company Limited | n/a | |
| Isoflurane vaporizer system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14173-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Small cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23400100 | |
| Fine Straight Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | #5, FST by Dumont Biologie Tip |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | #5/45 FST by Dumont |
| Small Absorbent Spears | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | BR701605 ALDRICH | |
| Kwik-Sil 2 component Silicone Polymer | World Precision Instruments (WPI) | KWIK-SIL | Purchase extra specialized tips from WPI |
| 5-0 Polysorb Suture | Tyco Healthcare | n/a | |
| 6-0 Silk Suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | Deknatel brand, spool |
| Radiotelemetry Probe | Data Sciences International (DSI) | TA11-PAC10 | |
| Radiotelemetry Receiver | Data Sciences International (DSI) | PhysioTel RPC-1 | |
| Ambient Pressure Reference | Data Sciences International (DSI) | Apr-01 | |
| Pressure Output Adapter | Data Sciences International (DSI) | R11CPA | |
| Rena Pulse Tubing | Braintree Scientific | RPT-040 | |
| Infusion Swivel | Instech Solomon | 375/D/22 | |
| Swivel Support Arm & Mount | Instech Solomon | SMCLA | |
| Polysulfone button | Instech Solomon | LW62S/6 | |
| Stainless steel spring | Instech Solomon | PS62 | |
| Vetbond surgical adhesive | 3M | n/a | |
| Triple Antibiotic Ointment | Fougera | n/a | |
| PowerLab 8 Channel Data Acquisition System & Software | ADInstruments | PowerLab 8/35 | |
| PVC Insulated Cable | Belden | PVC Audio Connection Cable 32 AWG | |
| Preamplification Headstage | Dagan Corporation | Model 4002 | |
| Differential Amplifier | Dagan Corporation | EX4-400 | |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich | 71778-25G | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich | P6126-5G | |
| Sterile Physiological Saline 0.9% NaCl | Beckton Dickinson | Contact local hospital supplier | |
| hexamethonium | Sigma Aldrich | H0879-5G | |
| Stainless Steel top anti vibration table | n/a | n/a | Custom designed in-house; Solid steel plate on a benchtop is also suitable |
| Faraday cage | n/a | n/a | Custom designed and constructed in-house |
| Small animal hair trimmer | n/a | n/a | Drugstore, men's beard trimmer suitable |
| Dipilatory Cream | n/a | n/a | Veet brand, sensitive skin formula |
| 10% Povidone Iodine | Purdue Products | Betadiene | |
| 70% Ethanol | n/a | n/a | |
| Steel microretractors | n/a | n/a | Made in-house. Bend a steel paper clip & loop 4-0 silk to form a retractor |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| Heat Gun | Fisher Scientific | 09-201-27 |
References
- Young, C. N., Davisson, R. L. In vivo assessment of neurocardiovascular regulation in the mouse: principles, progress, and prospects. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (3), H654-H662 (2011).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Charkoudian, N., Wallin, B. G. Sympathetic neural activity to the cardiovascular system: integrator of systemic physiology and interindividual characteristics. Compr Physiol. 4 (2), 825-850 (2014).
- Guyenet, P. G. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci. 7 (5), 335-346 (2006).
- Hamza, S. M., Hall, J. E. Direct recording of renal sympathetic nerve activity in unrestrained, conscious mice. Hypertension. 60 (3), 856-864 (2012).
- DeBeck, L. D., Petersen, S. R., Jones, K. E., Stickland, M. K. Heart rate variability and muscle sympathetic nerve activity response to acute stress: the effect of breathing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), R80-R91 (2010).
- Krowicki, Z. K., Kapusta, D. R. Microinjection of glycine into the hypothalamic paraventricular nucleus produces diuresis, natriuresis, and inhibition of central sympathetic outflow. J Pharmacol Exp Ther. 337 (1), 247-255 (2011).
- do Carmo, J. M., et al. Control of blood pressure, appetite, and glucose by leptin in mice lacking leptin receptors in proopiomelanocortin neurons. Hypertension. 57 (5), 918-926 (2011).
- Brockway, B. P., Mills, P. A., Azar, S. H. A new method for continuous chronic measurement and recording of blood pressure, heart rate and activity in the rat via radio-telemetry. Clin Exp Hypertens A. 13 (5), 885-895 (1991).
- Tallam, L. S., Silva, da, A, A., Hall, J. E. Melanocortin-4 receptor mediates chronic cardiovascular and metabolic actions of leptin. Hypertension. 48 (1), 58-64 (2006).
- Van Vliet, B. N., Chafe, L. L., Antic, V., Schnyder-Candrian, S., Montani, J. P. Direct and indirect methods used to study arterial blood pressure. J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (2), 361-373 (2000).
- Zvara, P., et al. A non-anesthetized mouse model for recording sensory urinary bladder activity. Front Neurol. 1, 127 (2010).
- Hagan, K. P., Bell, L. B., Mittelstadt, S. W., Clifford, P. S. Effect of dynamic exercise on renal sympathetic nerve activity in conscious rabbits. J Appl Physiol. 74 (5), 2099-2104 (1985).
- Matsukawa, K., Ninomiya, I. Changes in renal sympathetic nerve activity, heart rate and arterial blood pressure associated with eating in cats. J Physiol. 390, 229-242 (1987).
- Stocker, S. D., Muntzel, M. S. Recording sympathetic nerve activity chronically in rats: surgery techniques, assessment of nerve activity, and quantification. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (10), 6 (2013).
- Burke, S. L., Lambert, E., Head, G. A. New approaches to quantifying sympathetic nerve activity. Curr Hypertens Rep. 13 (3), 249-257 (2011).
- Smith, F. G. Techniques for recording renal sympathetic nerve activity in awake, freely moving animals. Methods. 30 (2), 122-126 (2003).
- Miki, K., Kosho, A., Hayashida, Y. Method for continuous measurements of renal sympathetic nerve activity and cardiovascular function during exercise in rats. Exp Physiol. 87 (1), 33-39 (2002).
- Yoshimoto, M., Miki, K. Measurement of renal sympathetic nerve activity in freely moving mice. J Physiol. 560, (2004).
- Yoshimoto, M., Miki, K., Fink, G. D., King, A., Osborn, J. W. Chronic angiotensin II infusion causes differential responses in regional sympathetic nerve activity in rats. Hypertension. 55 (3), 644-651 (2010).
- Salman, I. M., Sarma Kandukuri,, Harrison, D., L, J., Hildreth, C. M., Phillips, J. K. Direct conscious telemetry recordings demonstrate increased renal sympathetic nerve activity in rats with chronic kidney disease. Front Physiol. 6, 218 (2015).
- Morgan, D. A., Despas, F., Rahmouni, K. Effects of leptin on sympathetic nerve activity in conscious mice. Physiol Rep. 3 (9), (2015).
- Alfie, M. E., Sigmon, D. H., Pomposiello, S. I., Carretero, O. A. Effect of high salt intake in mutant mice lacking bradykinin-B2 receptors. Hypertension. 29 (1 Pt 2), 483-487 (1997).
- Dietz, J. R., Landon, C. S., Nazian, S. J., Vesely, D. L., Gower, W. R. Effects of cardiac hormones on arterial pressure and sodium excretion in NPRA knockout mice. Exp Biol Med (Maywood). 229 (8), 813-818 (2004).
- Zhang, W., et al. Cyclosporine A-induced hypertension involves synapsin in renal sensory nerve endings. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9765-9770 (2000).
- Szczesny, G., Veihelmann, A., Massberg, S., Nolte, D., Messmer, K. Long-term anaesthesia using inhalatory isoflurane in different strains of mice-the haemodynamic effects. Lab Anim. 38 (1), 64-69 (2004).
- Tank, J., et al. Sympathetic nerve traffic and circulating norepinephrine levels in RGS2-deficient mice. Auton Neurosci. 136 (1-2), 52-57 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Zuurbier, C. J., Emons, V. M., Ince, C. Hemodynamics of anesthetized ventilated mouse models: aspects of anesthetics, fluid support, and strain. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2099-H2105 (2002).
- Farnham, M. M., O'Connor, E. T., Wilson, R. J., Pilowsky, P. M. Surgical preparation of mice for recording cardiorespiratory parameters in vivo. J Neurosci Methods. 248, 41-45 (2015).
- Cuellar, J. M., Antognini, J. F., Carstens, E. An in vivo method for recording single unit activity in lumbar spinal cord in mice anesthetized with a volatile anesthetic. Brain Res Brain Res Protoc. 13 (2), 126-134 (2004).
- Carruba, M. O., Bondiolotti, G., Picotti, G. B., Catteruccia, N., Da Prada, M. Effects of diethyl ether, halothane, ketamine and urethane on sympathetic activity in the rat. Eur J Pharmacol. 134 (1), 15-24 (1987).
- Wang, G. F., Mao, X. J., Chen, Z. J. Urethane suppresses renal sympathetic nerve activity in Wistar rats. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 18 (10), 1454-1457 (2014).
- Xu, H., et al. Effects of induced hypothermia on renal sympathetic nerve activity and baroreceptor reflex in urethane-anesthetized rabbits. Crit Care Med. 28 (12), 3854-3860 (2000).
- Shimokawa, A., Kunitake, T., Takasaki, M., Kannan, H. Differential effects of anesthetics on sympathetic nerve activity and arterial baroreceptor reflex in chronically instrumented rats. J Auton Nerv Syst. 72 (1), 46-54 (1998).
- Janssen, B. J., Smits, J. F. Autonomic control of blood pressure in mice: basic physiology and effects of genetic modification. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (6), R1545-R1564 (2002).
- Nunn, N., Feetham, C. H., Martin, J., Barrett-Jolley, R., Plagge, A. Elevated blood pressure, heart rate and body temperature in mice lacking the XLalphas protein of the Gnas locus is due to increased sympathetic tone. Exp Physiol. 98 (10), 1432-1445 (2013).
