Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Regulatoriske T (T reg) celler, som udtrykker Foxp3 som en transskriptionsfaktor, er delmængder af CD4 + T-celler. T reg celler spiller afgørende roller i immun tolerance og homeostase vedligeholdelse ved at regulere immunresponset. Den primære rolle af T reg celler er at undertrykke proliferationen af effektor-T (T eff) celler og produktionen af cytokiner, såsom IFN-γ, TNF-α og IL-2. Det er blevet påvist, at T reg cellers evne til at inhibere funktionen af T eff celler forstærkes under vedvarende patogen infektion og cancerudvikling. For at tydeliggøre funktionen af T reg celler under hvilende eller betændte tilstande, en række forskellige in vitro suppression assays under anvendelse af muse eller human T reg celler er blevet udtænkt. Hovedformålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til at sammenligne forskellene i fænotype og undertrykkende funktion mellem hvilende og aktiverede T regceller. For at isolere aktiverede T reg celler blev mus inficeret med lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stamme af LCMV. T reg celler isoleret fra milten fra LCMV CL13-inficerede mus udviste både den aktiverede fænotype og forøget undertrykkende aktivitet sammenlignet med hvilende T reg celler isoleret fra naive mus. Her beskriver vi den grundlæggende protokol for ex vivo fænotype-analyse for at skelne aktiverede T reg celler fra hvilende T reg celler. Desuden beskriver vi en protokol til måling af den undertrykkende aktivitet fuldt aktiverede T reg celler.
Regulatoriske T (T reg) celler udtrykker forkhead kasse P3 (Foxp3) som en transskription faktor for deres udvikling og funktion 1. Derudover T reg celler udtrykker forskellige andre molekyler, såsom CD25 2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) 3, glucocorticoidinduceret tumornekrosefaktorreceptor 4, og cytotoksisk T-lymfocyt-associeret protein 4 (CTLA-4) 5 på deres overflade eller intracellulære område. Under kronisk infektion med forskellige former for patogener såsom vira 6,7, bakterier 8,9 og parasitter 10-12, eller i løbet af kræft udvikling 13,14, bliver T reg celler differentieret i aktiverede celler, viser forbedret undertrykkende funktion målretning effektor CD4 + og CD8 + T-celler. En række papirer har antydet, at ekspanderede og aktiverede T reg celler bidrager til de forringede CD8 + T-celle-response under ven retrovirus (FV) infektion 15-17. FV-inducerede T reg celler inhiberer IFN-γ eller granzym B-ekspression og cytotoksisk reaktivitet af CD8 + -T-celler 15-17. Desuden er der i en herpes simplex virus infektion model, blev det rapporteret, at udtømningen af CD4 + CD25 + -T-reg-celler resulterede i en udvidelse af virus-specifikke CD8 + T-celler og alvorlig vævsbeskadigelse ved infiltration af immunopathogenic CD4 + -T-celler 18-20.
Mus inficeret kronisk med klonen 13-stammen af lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV CL13) 21-24 er ofte blevet brugt til at karakterisere fænotypen og funktion af effektor T-celler (T EFF) og T reg celler under kronisk virusinfektion. Under vedvarende LCMV-infektion, virus-specifikke T eff celler gradvist mister deres effektorfunktion og blive udmattet T (Texh) celler. På den anden side, Treg celler styrke deres evne til at undertrykke virus-specifikke T-celle respons 25. Faldet i funktion kapacitet af T eff celler kan forklares ved adskillige faktorer, såsom opregulering af inhiberende receptorer på T eff celler, ændret funktion af antigen-præsenterende celler, produktion af immunregulatoriske cytokiner, og øget frekvens eller forstærket funktion af T reg celler 26. Blandt de er involveret i T-celle-suppression faktorer, programmeret celledød protein-1 (PD-1) udtrykkende Texh celler og T reg celler er blevet bredt betragtes som kendetegnende for antigen persistens og undertrykkende miljø. For nylig blev det rapporteret, at blokade af PD-1-vejen og ablation af T reg celler føre til øget T-cellefunktion og nedsat viral belastning under LCMV kronisk infektion 27. Desuden er T reg celler aktiveres under kronisk infektion af mus med LCMV 23,25 </sop> og deres undertrykkende funktion styrkes 25. PD-1 er overudtrykt på T reg celler såvel som Texh celler, og niveauet af PD-1 udtrykt af T reg celler korrelerer med styrken af deres supprimerende funktion at inhibere T-celleproliferation 25.
Her beskriver vi en metode til at sammenligne egenskaberne af aktiverede T reg celler isoleret fra mus inficeret med LCMV CL13 og hvilende T reg celler isoleret fra naive mus. Endvidere forklarer vi en række processer til at adskille aktiverede T reg celler og undersøger deres ex vivo fænotype, samt måle deres supprimerende aktivitet in vitro.
Selvom der findes kun et lille antal af T reg celler i mus og mennesker, er det vigtigt at forstå deres funktion som de spiller en afgørende rolle i reguleringen af immunresponset og opretholdelse immuntolerance. Antallet og undertrykkende funktioner T reg celler stiger i løbet af en kronisk virusinfektion 15-20 samt kræft progression 13,14. Dette er sandsynligvis på grund af fortsat antigenstimulering. At evaluere T reg celler fungerer under antigen persistens…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |