표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Abstract

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 _REG) 세포, CD4 ⁺ T 세포의 서브 세트이다. T의 _{등록 세포는} 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 _{등록 세포의} 주요 역할은 효과기 T (T의 _EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. _EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 _레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T _{세포에 등록하는} 기능, 마우스 또는 인간 T _{등록 세포를} 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 _등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T _레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T _{세포는 등록} 나이브 마우스로부터 단리 된 T _{세포를 등록} 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 _등록 된 T _세포 휴식에서 활성화 된 T _{세포를 등록} 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 _{등록 세포의} 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

Introduction

규제 T (T의 _REG) 세포는 개발 및 기능 ¹ 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 _{등록 세포는} ^CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) ^(3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 ⁽⁴⁾ 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) ⁽⁵⁾ 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 ^{6,7, 8,9} 박테리아, 기생충 ^10-12 또는 암 ^13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 _{등록 셀은} 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 ^+와 CD8 ⁺ T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 _{등록 세포가} 손상된 CD8 ⁺ T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 ^{15 ~ 17시} 전자. FV 유발 T에 _{등록 셀은} IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 ⁺ T 세포의 세포 독성 ^15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 - 특이적인 CD8 ⁺ T 세포 및 immunopathogenic CD4 ⁺ T 세포를 ^18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T에 _{등록 세포의} 고갈을보고 하였다.

림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) ^{21-24 널리} 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 _EFF) 및 T의 _{등록 세포의} 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T _EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 _배기) 세포가된다. 한편, T에서_{레지 세포는} 바이러스 특이 적 T 세포 반응 ^(25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 _EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T _EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 _등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 ^26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 _{배기 세포와} T에 _{등록 세포} 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 _{등록 셀의} PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 ^(27)가 감소 하였다. 또한, T의 _{등록 세포는} LCMV ^{(23, 25)와} 쥐의 만성 감염시 활성화 (25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 _{등록 세포뿐} 아니라 T의 _{배기 세포} 발현되며, PD-1 T에 _{등록 세포에} 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 ^(25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계.

여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 _{등록 세포} 감염 쥐로부터 분리 활성화 T _{등록 세포의} 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 _레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.

Protocol

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다.

솔루션 1. 준비

1. RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비
2. 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다.
3. 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다.
4. T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산.

비장 림프구 2. 분리

1. 이전 ¹⁹ 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에서 비장을 제거하고 2 % RPMI 배지 10 ㎖를 포함하는 X 15mm 배양 접시 60mm에 배치합니다.
   참고 :이 연구의 실험에서, 5 ~ 6 주령에 C57B1L / 6J 암컷 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사를 통해 LCMV CL13의 2 × 10 ⁶ 플라크 형성 단위 (PFU)를 받았다. 16 일 후 감염 (16 D 파이) ^(25)에 쥐를 희생. 분석 GE의 일치 순진 마우스는 같은 날이었다.
2. 50 ㎖의 튜브에 세포 여과기를 넣고 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 씻어. 70 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄. 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 셀 스트레이너를 씻어 50 ML 튜브에서 제거합니다.
3. 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 뜨는을 취소하고를 재현 탁ACK 용균 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛. 5 분 동안 실온 (RT)에서 샘플을 인큐베이션.
   참고 : 위의 표시 ACK 용균 버퍼의 볼륨이 하나의 비장입니다. 풀링 비장 샘플 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
4. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁.
   참고 : 트리 판 블루 만 혈구를 사용하여 염색되지 않은 세포를 살고 카운트 라이브 셀 카운팅, 얼룩 세포하십시오.

지라 기존의 T (T의 _전환) 세포와 T의 _{등록 세포의} 3 표현형

참고 : T의 _{등록 세포} 분리하기 전에 다양한 항체와 세포를 염색 및 유동 세포 계측법에 의해을 분석하여 순진하거나 감염된 마우스에서 분리 된 비장 림프구의 표현형을 검사합니다.

1. 세포의 50 μl를 전송새로운 U 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 전체 비장 림프구 중 (5 × ¹⁰⁵ 세포) 및 웰 당 FACS 완충액 150 μL를 추가한다. 4 ℃에서 2 분 300 XG에 원심 분리기.
2. 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 선동하고 잘 당 FACS 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 4 ° C (2 회)에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리기.
3. 다음 항체 및 시약 잘 당 FACS 버퍼의 50 μL에 염색 세포 표면 마커에 대한 항체 칵테일을 준비합니다. 안티 CD4 보라색 염료, 항 CD25 녹색 염료, 항 PD-1 바이올렛 염료 항 CD8를 PerCP-Cy5.5 염료 및 세포 생존 검출 시약 근적외선 (IR​​) 형광 반응성 염료.
   주 : 상기 활성화 된 T _{등록 세포의} 표현형을 분석은 항 CD103 ^{(23, 25)은} 세포 표면 마커 염색을 첨가 할 수있다.
4. 웰 당 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 로 두 번 세포를 씻으4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 FACS 버퍼입니다.
5. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 가만히 따르다 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 제조 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다.
6. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 (제조사의 프로토콜에 따라 제조)을 permeabilization 세척 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
7. Foxp3의 세포 내 염색 용 항체 용액을 제조하고, 반대로 Foxp3의 항체 용액 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁.
   주 : 상기 항 CTLA이 단계에서 첨가 될 수있다 T _전환율 및 T의 _{등록 세포의} 표현형을 분석.
8. 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어 및 단계 3.6를 반복합니다. 최종 세척 단계 후, FACS 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계수기 ^(25)에 의해 세포의 표현형을 조사한다.
9. 게이트 살아있는 세포의 popula기. CD4 ⁺ 또는 CD8 ⁺ T 세포 중에서 PD-1 ⁺ 세포 ^- LCMV CL13 감염 동안 _전환율 T _세포의 표현형 분석을 위해 Foxp3의 빈도를 조사한다.
   주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 비율 ^- PD-1 ^+는 LCMV CL13 16 D 파이에서 CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포 집단을 모두 50 % 이상이다.
   1. T의 _{등록 셀의} 주파수 및 표현형을 분석, CD4 ⁺ T 세포 사이 Foxp3의 ⁺ 또는 ⁺ Foxp3의 PD-1 ⁺ 세포의 빈도를 조사한다.
      주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 ⁺ 또는 ⁺ Foxp3의 PD-1 ⁺ 세포의 비율은 각각, CD4 ⁺ T 세포 집단에서 20 % 이상이다.

CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 4. 분리

참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된위한1 × 10 ⁽⁷⁾ 총 비장 세포의 세포 수를 시작.

1. 순진하고 LCMV 만성적으로 감염된 마우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 격리 완충액 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
2. 자기 세포 분리 장치를 사용하여 CD4 ⁺ T 세포 농축을 위해, 바이오틴 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 10 분 동안 품어.
3. 버퍼의 30 μL, 비 CD4 ⁺ T 세포의 라벨링에 대한 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 20 μL와 CD25 ⁺ 세포의 형광 라벨에 대한 CD25-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
4. 완충액 2 ㎖를 첨가하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 셀을 통과한다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.완전히 뜨는을 취소하고 최대 1.25 × 10 ⁽⁸⁾ 세포의 밀도로 500 μL 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend.
5. 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 추가하여 열을 씻으십시오. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 90 μL에 고립 된 CD4 ⁺ T 세포를 재현 탁.
6. CD25 ⁺ 세포의 자기 표시를 들어, 안티 - PE 마이크로 비즈의 10 μl를 추가 잘 혼합, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
7. 버퍼 2 ㎖를 추가하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻는다. 완전하게 상층 액을 제거하고 최대 1 × ¹⁰⁸ 세포의 밀도로 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁.
8. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포를} 풍부하게하기 위해, 긍정적 인 선택을위한 칼럼에 세포를 적용하고, 콜 럼을 씻어완충액 2 ㎖를 첨가하여 N. 세탁 세 번 반복합니다.
9. 열이 최종 세척 단계 후 비면 컬럼 상 완충액 1 mL를 넣어 자화 표지 CD4 ⁺ CD25 ^+, 플런저를 사용하여 세포 플러시.
10. 반복 고립 된 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 순도를 향상시키기 위해 4.8-4.9 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 격리 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T에 _{등록 세포를} 재현 탁.
11. 단리-CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 순도를 확인하려면 총 격리-CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포에서} 2 × 10 ⁵ 세포를 사용합니다. FACS 완충액 50 μL 안티 CD4 FITC를 함유 세포 생존율이 거의 IR 형광 반응성 염료 시약을 검출하여 세포를 염색.
    참고 : CD25는 이미 분리시 PE로 표지 하였다.
12. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의해 순도를 확인한다.
13. 게이트 라이브 세포 인구. T의 _{등록 세포의} 순도를 분석, CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포의 비율을 확인.
    주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD4 ⁺ CD25 ⁺ 세포의 비율은 약 80 % 이상이다.

CD8 ⁺ T 세포와 CD8 ⁺ T 세포의 라벨링 5. 분리

참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된 1 × 10 ⁽⁷⁾ 총 비장의 시작 세포 수에 대한 것입니다.

1. 순진 마​​우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 분리 버프 10 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어어. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 폐기하고, 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend.
2. 자기 세포 분리 시스템을 사용하는 CD8 ⁺ T 세포의 분리를 위해, 비 CD8 ⁺ T 세포 비오틴 표지 용 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
3. 버퍼의 30 μL 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 믹스 4 °​​ C에서 10 분 동안 배양한다.
4. 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 버퍼 세번 2ml를 첨가하여 열을 씻는다.
5. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼 2 ㎖에 고립 된 CD8 ⁺ T 세포를 재현 탁.
6. 분리 된 세포의 순도를 확인하려면, FACS 버퍼에 항체 용액 50 μl를 준비합니다. 절연 CD8 ⁺ T의 CEL 중에서 2 × ¹⁰⁵ 세포를 재현 탁항체 용액 50 μL에 LS.
   참고 : 안티 - CD8 FITC 추가, 항체 용액을 제조하고, 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료) FACS 버퍼로합니다.
7. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 유세포 분류법으로 세포의 순도를 확인한다.
8. 게이트 라이브 세포 인구. CD8 ⁺ T 세포의 순도를 확인하기 위해, CD8 ⁺ T 세포의 비율을 확인.
   주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD8 ⁺ 세포의 비율은 약 90 % 이상이다.
9. 격리 된 CD8 ⁺ T 세포에 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. PBS에 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml의 농도로 단리 CD8 ⁺ T 세포를 재현 탁.
10. CD8 ⁺ T 가전에 레이블을 지정하려면시험 관내 억제의 분석을위한 LLS은 RT에서 5 μM의 농도를 얻기 위해 PBS에 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석.
    참고 : 본 연구에 사용 된 세포 증식 추적 바이올렛 염료의 대략 여기 및 발광 피크는 각각 405 및 450 나노 미터이다.
11. 15 ㎖의 튜브에 세포 증식 추적 보라색 염료 (5 μM) 세포 현탁액 (CD8 ⁺ T 세포를 1 × ¹⁰⁷ 세포 / ml)의 균등 한 양을 혼합하고 37 ° C에서 20 분간 인큐베이팅 하였다. 튜브마다 10 분을 소용돌이.
12. 감기 전체 RPMI 미디어와 튜브를 입력하고 실온에서 10 분 동안 튜브를 둡니다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전하게 상층 액을 제거하고 예열 된 완전한 RPMI 배지로 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. RT에서 15 분 동안 세포를 인큐베이션.

6. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T를 <사용하여 체외 억제 분석 설정서브> 등록 번호 및 CD8 ⁺ T 세포

1. 항 CD3 / CD28 코팅 구슬을 준비하려면, 관의 15 ㎖ (2.5 μL / 1 × 10 ⁵ 세포)에 자석 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다. PBS의 동일한 볼륨을 추가하고 혼합한다. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세척하고 상층 액을 버린다. 전체 미디어의 자기 구슬을 (50 μL / 웰) 희석.
2. CD4 ⁺ CD25 ⁺ T의 _{등록 세포의} 나누어지는 50 μL U-바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 (1 × 10 ⁵ 세포 / 웰). 응답자 T (T의 _RESP)와 같은 CD8 ⁺ T 세포 세포 물론 당 (1 × 10 ⁵ 세포 / 웰)의 50 μl를 추가합니다. 물론 당에 희석 항 CD3 / CD28 코팅 구슬의 50 μl를 추가합니다.
   참고 : 다음과 같이 제어 우물을 설정할이 단계, 레이블 및 : 없음 항 CD3 / CD28 코팅 구슬 "만 자극되지 CD8 ⁺ T 세포를"; "CD8 ⁺ T 세포 만"항 CD3 / CD28 코팅 구슬; "CD8 ⁺ T 세포 만"항 CD3 / CD28 코팅 구슬;". T의 _{등록 세포} 만 "항 CD3이 / CD28 코팅 구슬 T의 _{등록 세포는} T의 서로 다른 비율로 전체 미디어와 공동 배양 T의 _{인공 호흡기 세포에} 의해 희석 될 수있다 _{RESP 세포} : T 세포의 _레지 (1 : 0.25-1 : 1).
3. 200 μL의 총 부피에 대한 모든 우물에 50 μL 또는 미디어의 적절한 볼륨을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 72 시간 동안 37 ° C에서 CO ₂ 배양기에서 배양한다.

CD8 ⁺ T 세포 7. 분석 CD8의 ⁺ T 세포 증식 및 사이토 카인 생산

1. 사이토 카인 생산 분석을 위해, 문화 3 일 후, 물론 다른 플레이트에 각각의 상층 액을 분리하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다.
   주 : 상등액을 분취하고 -70 ℃에서 저장 될 수있다. 이 실험에서, 항 마우스 IFN-γ 항체 - 코팅 된 플레이트는 IFN-γ 생산 일치를 검출하는 데 사용제조 업체의 프로토콜에 보내고. 단일 세포 수준에서 CD8 ⁺ T 세포 증식의 IFN-γ 생산을 결정하기 위해, 세포 내 사이토 카인 염색법을 행할 수있다.
2. 각 우물에서 뜨는을 분리 한 후, 4 ° C (3 회)에서 2 분 동안 300 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기로 세포를 포함하는 접시를 씻으십시오.
3. 세척 후, 상층 액을 버린다. 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 염색 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어.
   참고 : FACS 버퍼에 방지 CD4 FITC, 안티 - CD8를 PerCP-Cy5.5 및 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료)를 추가, 항체 칵테일을 준비합니다.
   참고 사항 : CD44 또는 CD69 각종 마커에 대한 항체는 CD8 ⁺ T 세포의 활성화를 확인하는 다른 항체와 결합 될 수있다. CD8 ⁺ T 세포가 이미 증식 추적 V로 표지 된 기억단계 5.10에서 iolet 염료.
4. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 제거하고, 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다.
5. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. FACS 완충액 200 μL로 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의한 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 ⁺ T 세포의 증식을 측정한다.
   1. 게이트 생균 중 CD8 ⁺ T 세포 집단. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 및하기 식에있어서 CD8 ⁺ T 세포 희석액의 희석에 따른 분할 전적인 세포의 비율을 측정한다. 억제 % = [(T의 _{등록 세포의} 부재하에 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 % - T에 _{등록 세포의} 존재 하에서 증식 된 CD8 ⁺ T 세포의 %) / (%에서 증식 된 CD8 ⁺ T 세포T _{세포의 등록의} 유무)] X (100)는 또한 소프트웨어 ⁽²⁵⁾ 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터를 분석한다.

Representative Results

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 ⁶ PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 _{등록 세포} 및 만성 바이러스 감염시 T _전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 ⁺ T의 _전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 ^{- -} CD8 ⁺ T의 _전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 _레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1a)에서보다 LCMV CL13 감염된 마우스의 두 배 이상이었다. 특히, Foxp3의 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 _레지 대부분은 높은 수준의 발현, 활성화 된 표현형을 표시PD-1이 시점 (그림 1A)에서.

시험 관내 억제 분석을 위해, CD8 ⁺ T _{세포의 전환} 및 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T 세포의 _레지 상당수가 필요 하였다. 1 × 10 ⁷ 세포 증식 추적 보라색 염료 표지 CD8 ⁺ T 세포를 얻기 위해, 순진한 마우스의 두 비장의 비장 세포가 풀링되었다. 2 × ⁶ 또는 CD4 ⁺ CD25 ⁺ T에 _{등록 셀} × ¹⁰⁶ (3)을 얻기 위해, 순과 LCMV CL13 감염된 마우스에서 적어도 세 비장 각각 모았다. T의 _{RESP 세포와} 같은 CD8 ⁺ T 세포는 다른 면역 세포 (도 2A)와 상당한 오염없이 성공적으로 분리 하였다. T _{세포의 등록은} 또한 80 % 이상의 순도 (도 2B)과 CD25 ⁺ CD4 ⁺ T 세포의 지배적 인구 단리 될 수있다.

나이브 만성 T에 _{등록 세포의} 억제 기능을 비교하기 위해 분리 된 T의 _등록 및 T의 _{RESP 세포를} 3 일 동안 37 ° C에서 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드 자극 하에서 함께 배양 하였다. CD8 ⁺ T _{RESP 세포} 증식 억제율 (%)은 T 세포의 _레지 DESE 의존적 (도 3A)에서 증가 하였다. CD8 ⁺ T의 _{RESP 셀} 1의 비율로 만성 T에 _{등록 세포와} 공동 배양 한 경우, 1, CD8 ⁺ T의 _{RESP 세포의} 증식이 크게 (도 3b)을 억제 하였다. CD8 ⁺ T의 _{RESP 세포가} 만성적으로 감염된 마우스에서보다는 T의 _등록에 나이브 마우스로부터 T에 _{등록 세포} 쉬고 활성화 T _{등록 세포와} 공동 배양시 CD8 ⁺ T의 _{RESP 세포에} 의해 IFN-γ의 생산도 현저하게 억제했다 (도 3C).

그림 1 : 16 D 파이 (A) PD-1 또는 Foxp3의에서 CD25의 발현에 순진 마우스 또는 LCMV CL13에 감염된 생쥐의 비장에 CD4 ^+와 CD8 ⁺ T 세포의 표현형 ^- CD4 ⁺ T의 _전환과 Foxp3의 ⁺ CD4 ⁺ T의 _{등록 세포.} Foxp3의에서 PD-1 또는 CD25의 (B) 표현 ^- CD8 ⁺ T의 _{전환 세포.} 비장 림프구는 CD4, CD8, CD25, PD-1과 Foxp3의에 대한 항체로 염색 하였다. 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표 값이다. 패널 A는 기준으로 ^25에서 수정되었습니다. 를 클릭하십시오 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

도 2 : 나이브 또는 LCMV CL13 감염 쥐로부터 분리 나이브 마우스 및 T의 _{등록 세포로부터} 단리 된 T _{세포의 RESP} 순도 분리 후에 CD8 ⁺ T 세포 (A) 백분율.. 분리 후, CD25을 발현하는 CD4 ⁺ T 세포의 _레지의 (B) 백분율. (B)의 각 사분면은 CD4 및 CD25의 발현 수준을 결정 하였다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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도 3 : CD8 ⁺ T 세포 반응에 대한 활성화 된 T _{등록 셀의} 영향은 T에 _{등록 세포} 용량 - 의존적으로 T에 _{등록 세포와} 공동 배양 된 CD8 ⁺ T 세포 (A) % 억제.. 1 T에 _{등록 세포와} 공동 배양 된 CD8 ⁺ T 세포 (B) 확산도 : 1 비율. T 자 _{등록의 셀} 용량 의존적으로 T에 _{등록 세포와} 공동 배양 된 CD8 ⁺ T 세포 (C) IFN-γ 생성. CD8 ⁺ T 세포의 증식은 증식 된 CD8 ⁺ T 세포 및 IFN-γ 분비 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석 측정은 ELISA에 의해 평가 하였다. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 ⁺ T 세포는 T의 부재 또는 존재하에 3 일간 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드로 자극했다 레지없이 공 배양 CD8 ⁺ T 세포의 증식 비율을 나타낸다. 히스토그램 채워진 회색 피크 T의 _{등록없이 세포} 공 배양 CD8 ⁺ T 세포의 증식을 나타낸다. 각 그룹은 삼중으로 설계되었다. 막대는 + SEM을 의미 나타냅니다. 이 수치는 기준으로 ^25에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

T _{세포의 레지} 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 ^15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 ^13,14 세포 증가 _REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. _{레지 세포} 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다.

여기서는 T에 _{등록 세포의} 생체 표현형 분석 및 CD8 ⁺ T 세포와 T에 _{등록 세포의} 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 _{등록 세포의} 분리이다. 라이브 갓 절연 T 체외에서 명확한 억제 활동을 보여줍니다. 또한 만성 바이러스 감염 동안 T _전환율 및 T의 _{등록 세포의} 표현형을 조사 하였다. _전환율 T _세포, 즉 Foxp3의 ^- CD4 ⁺ 및 CD8 ⁺ T 세포는 만성 바이러스 감염 (도 1) 후 세포 활성의 감소를 보였다. 는 PD-1 발현은 모두 T _{전환율 세포} 집단에서 상향 조절되었다. T의 _{등록 세포} 수 증가까지 조절 PD-1 발현은 만성 바이러스 감염시의 면역 반응의 특징이다. 또한 이러한 TIM-3 및 CTLA-4와 같은 다른 수용체에 대한 저해 방지기구는 choric 바이러스 감염 후 FACS에 의한 T 세포의 표현형을 조사 PD-1과 결합하여 사용될 수있다.

억제 활성을 조사하기 위하여, T의 _{RESP 세포와} T에 _{등록 된} T 세포의 _등록 1 1로 공 배양의 비율로 공 배양했다나이브 마우스의 T _{세포의 등록에} 비해 만성적으로 감염된 마우스의 세포는 상당히 CD8 ⁺ T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 감소시켰다. 이것은 _등록 된 T _세포와 공동 배양 된 CD8 ⁺ T 세포의 증식 및 사이토 카인 생산은 역 T에 _{등록 세포의} 억제 기능에 관계하고 있음을 의미한다. 이 프로토콜은 비 _등록 된 T _세포와 T _{세포의 레지} 분리 오염위한 자기 세포 분리 시스템의 사용을 권장하고 있지만 배제 할 수 없다. CD25 종종 활성화 CD4 ⁺ T _전환뿐만 아니라 T에 _{등록 세포에서} 과발현으로 Foxp3의-GFP 리포터 생쥐 ^28-30에서 얻어진 T에 _{등록 셀은} 정확하게 자기 세포 분리 시스템보다 T의 _레지 세포의 기능을 연구하기 위해 더 좋은 후보들이다.

T의 _{등록 세포의} 억제 기능은 다양한 생체 외 평가 된억제 분석 ^16,28,31-34. 시험 관내 억제 분석의 장점은 단지 T의 _{RESP 세포가} T에 _{등록 세포와} 공동 배양하기 때문에 그것은 상기 CD8 ⁺ T 세포 반응의 억제에 대한 T에 _{등록 세포의} 직접적인 영향을 평가하는 것이다. CD8 ⁺ T 세포뿐만 아니라, CD25 ^- CD4 ⁺ T 세포를 대신 T _{세포의 RESP} ^(25)에 사용될 수있다. 이러한 수지상 세포 또는 천연 킬러 세포와 같은 면역 세포에 T의 _등록 또는 T _{세포의 전환의} 영향 실험 조건을 변화시킴으로써 평가 될 수있다.

반복 당 단백질 등 CD103 ³⁵ LAG-3 ³⁶ 분자, CD43 ^38, CD11a에 ^{38 37} 우세 또는 킬러 세포 렉틴 형 수용체 아과 G 부재 (1) ^(38)는 특정 질환에서 활성화 된 T _{등록 세포의} 마커로 사용되었다. 이 프로토콜에서, 우리는 같은 PD-1을 사용하여지표는 만성 바이러스 감염시 T의 _{등록 세포를} 활성화 식별합니다. 이 프로토콜은 특정 조건에서의 T _{세포 등록} 다각적 분석 (표현형 및 기능)에 사용될 수있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm		BD Biosciences	554714
U-Bottom Tissue Culture Plates		BD Biosciences	353077
Fixation buffer		BD Biosciences	554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25	7D4	BD Biosciences	553072
Cell strainer, 70 mm		BD Biosciences	352350
Cell strainer, 40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4	RM4-5	Biolegend	100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a	53-6.7	eBiosicence	45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640		GE Life Sciences	SH30027
PBS (1x)		GE Life Sciences	SH30256
ACK Lysing Buffer		Gibco	A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution		Gibco	25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit		Life technologies	L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0)		Promega	V4231
2-Mercaptoethanol		Sigma Life Science	M7522
Fetal Bovine Serum		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II flowcytometer		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
Hematocytomer		Marienfeld superior