Abstract
Bir transkripsiyon faktörü olarak Foxp3 ifade eden düzenleyici T (T reg) hücreleri, CD4 + T hücrelerinin alt kümeleridir. T reg hücreleri bağışıklık yanıtını düzenleyerek immün tolerans ve homeostasis bakım çok önemli rol oynarlar. Regülatör T hücrelerinin temel görevi efektör T (T EFF) hücrelerinin çoğalması ve IFN-y, TNF-a ve IL-2 gibi sitokinlerin üretimini baskılamaktır. T eff hücrelerin fonksiyonunu inhibe regülatör T hücrelerinin yeteneği inatçı bir patojen enfeksiyon ve kanser gelişimi sırasında gelişmiş olduğu gösterilmiştir. Dinlenme veya iltihaplı koşullar altında regülatör T hücrelerin fonksiyonunu fare ya da insan regülatör T hücreleri kullanılarak in vitro bastırma edilen çeşitli testler öne sürülmüştür değerlendirmektir. Bu çalışmanın temel amacı, fenotip ve dinlenme arasındaki baskılayıcı fonksiyon farklılıkları ve aktive olmuş T reg karşılaştırmak için bir yöntem geliştirmektirHücreler. Aktive T reg hücreleri izole etmek için, fareler, lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) klon 13 (CL13) ile LCMV kronik zorlanma enfekte edildi. LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak izole regülatör T hücreleri naif farelerden izole edilen regülatör T hücreleri dinlenme ile karşılaştırıldığında aktive fenotip ve geliştirilmiş baskılayıcı aktivitesini sergiledi. Burada, T reg hücrelerini dinlenme aktive T reg hücreleri ayırt etmek ex vivo fenotip analizi için temel protokol açıklar. Ayrıca, tam olarak aktif regülatör T hücrelerin baskılayıcı aktivitesi ölçümü için bir protokol açıklar.
Introduction
Düzenleyici T (T reg) hücreleri kendi gelişimi ve işlevi 1 için bir transkripsiyon faktörü olarak forkhead kutusu P3 (Foxp3) ifade eder. Buna ek olarak, regülatör T hücreleri, CD25 2, lenfosit aktivasyonu geni 3 (ara-3) 3, glukokortikoitin yol açtığı tümör nekroz faktörü reseptör 4, ve sitotoksik gibi çeşitli başka molekülleri ifade T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA-4) '5 yüzeylerinde ya da hücre içi bölgeye. Bu tür virüsler 6,7, bakteriler 8,9, ve parazitler 10-12 veya kanser gelişimi 13,14 sırasında olduğu gibi patojenlerin çeşitli kronik enfeksiyon sırasında, T reg hücreleri gelişmiş baskılayıcı fonksiyon gösteren, aktif hücrelerin içine ayırt hale hedefleme efektör CD4 + ve CD8 + T hücreleri. Kağıtların bir dizi genişletilmiş ve aktive regülatör T hücreleri, bozulmuş CD8 + T hücresi yanıt vermeyen katkıda sürmüşlerdirarkadaş retrovirüs (FV) enfeksiyonu 15-17 sırasında e. FV kaynaklı regülatör T hücrelerinin IFN-y ya da Granzim B ekspresyonu ve CD8 + T hücrelerinin 15-17 sitotoksik reaktivite inhibe eder. Ayrıca, bir herpes simpleks virüsü enfeksiyon modelinde, bu virüse spesifik CD8 + T hücreleri ve immünopatojenik CD4 + T hücrelerinin 18-20 infiltrasyonu ile ciddi doku hasarının genişleme sonuçlandı CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin tükenmesinin bildirilmiştir.
Lenfositik koryomenenjit virüsünün klon 13 suşu ile kronik olarak enfekte olan fareler (LCMV CL13) 21-24 yaygın kronik virüs enfeksiyonu esnasında efektör T hücrelerinin (EFF) ve regülatör T hücrelerinin fenotip ve işlevini karakterize etmek için kullanılmaktadır. Kalıcı LCMV enfeksiyonunun sırasında virüs spesifik T EFF hücreleri kademeli olarak efektör fonksiyonunu kaybeder ve tükenmiş T (T exh) hücreler haline gelirler. Diğer yandan, TREG hücreleri virüs-belirgin T hücre tepkisine 25 önleme yeteneklerinden güçlendirir. T eff hücrelerinin çalışması kapasitesinde azalma, T eff hücreleri üzerinde inhibe edici reseptör artışı, antijen-sunan hücrelerin değişmiş fonksiyonu, bağışıklık sitokinlerin üretimi ve artan frekans veya regülatör T gelişmiş fonksiyonu olarak çeşitli faktörler tarafından açıklanabilir hücreler 26. T hücresi bastırılmasıyla ilgili faktörler arasında, programlanmış hücre ölümü proteini-1 (PD-1) -expressing T exh hücreleri ve regülatör T hücreleri yaygın antijene kalıcılık ve baskılayıcı çevre işaretlerinden olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu T reg hücrelerinin PD-1 yolunun ve ablasyon abluka gelişmiş T hücre fonksiyonuna neden olduğunu bildirdi ve LCMV kronik enfeksiyon 27 sırasında viral yük azaltıldı. Ayrıca, regülatör T hücreleri LCMV 23,25 ile farelerin kronik enfeksiyon sırasında aktive edilir 25 güçlendirilmiştir. PD-1 yüksek regülatör T hücreleri hem de T exh hücre ifade edilir, ve PD-1 regülatör T hücreleri tarafından ifade seviyesi, T hücre proliferasyonunu 25 inhibe etme baskılayıcı fonksiyonu gücü ile ilişkilidir.
Burada, LCMV CL13 ve naif farelerden izole dinlenme T reg hücreleri ile enfekte edilen farelerin izole aktive T reg hücrelerinin özelliklerini karşılaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, aktive edilmiş T-hücrelerinin ayrılmasında reg ve ex vivo fenotipi incelenmesi, hem de in vitro olarak da bastırma etkinliğini ölçmek için bir dizi işlemden açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, fareler Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi. Tüm hayvan deneyleri Yonsei Üniversitesi Yonsei Laboratuar Hayvan Araştırma Merkezi Uluslararası Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri kullanarak Kore Gıda ve İlaç İdaresi kurallarına uygun olarak yapılmıştır.
Çözümler 1. hazırlanması
- RPMI içinde% 1% 2 ve penisilin-streptomisin fetal sığır serumu (FBS) seyrelterek% 2 RPMI ortamı hazırlamak
- tam RPMI ortamı hazırlayın. RPMI ortam FBS% 10, penisilin-streptomisin,% 1 L-glutamin,% 1 ve 50 uM 2-merkaptoetanol ekleyin.
- flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) tamponu hazırlayın. FBS% 2 ile çok, ek fosfat tamponlu tuz (PBS) yapmak için.
- T hücre izolasyonu tampon hazırlayın. Bunu yapmak için, FBS% 2 ve 2 mM ethylenediaminetetraa PBS ile ekasetik asit elde edildi.
Splenik Lenfositler 2. izolasyonu
- Daha önce tarif edildiği gibi 19 saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden dalak çıkarın ve% 2 RPMI ortam, 10 ml ihtiva eden x 15 mm'lik Petri kaplara 60 mm koyun.
NOT: Bu çalışma deneylerde, 5, 6 haftalık için C57B1L / 6J dişi fareler kuyruk veninden intravenöz enjeksiyon yoluyla LCMV CL13 2 x 10 6 plak oluşturucu birim (pfu) aldı. Gün 16 sonrası enfeksiyon (16 d pi) 25 fareler Kurban. Analiz ge-uyumlu naif fareler aynı gün idi. - 50 ml'lik bir tüp içine, bir hücre süzgeci yerleştirin ve% 2 RPMI ortam, 2 ml ile durulayın. 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde dalak yerleştirin ve bir şırınga pistonu kullanarak eziyet. % 2 RPMI ortam 2 ml hücre süzgecinden yıkayın ve 50 ml'lik bir tüp çıkarın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatantı atın ve tekrar süspansiyonACK yokedici tamponda 1 ml hücre topağı. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
NOT: Yukarıda belirtilen ACK parçalama tampon hacmi bir dalak içindir. toplanmış dalak örnekleri için buna göre hacmi büyütmek. - 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de% 2 RPMI ortam ve santrifüj tüpü doldurmak. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 1 x 10 7 hücre / ml'lik bir yoğunlukta hücreler tekrar süspansiyon.
NOT: tripan mavi ve sadece hemasitometre kullanarak lekeli olmayan hücreleri canlı sayısı ile canlı hücre sayımı, leke hücreleri için.
Dalak Konvansiyonel T (T dönüşüm) Hücreler ve T reg Hücreler 3. Fenotiplendirme
Not: regülatör T hücre izolasyonu önce, çeşitli antikorlarla hücrelerin boyanması ve akış sitometrisi ile analiz ederek saf ya da enfekte olmuş farelerde izole edilmiş dalak lenfositleri fenotipinin inceleyin.
- hücreler 50 ul transferYeni bir U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, toplam dalak lenfositler arasındaki (5 x 10 5 hücre) ve oyuk başına FACS tampon 150 ul ekle. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- süpernatant atın. Hücre topağı karıştırın ve oyuk başına FACS tampon 200 ul ekle. 4 ° C'de (2 kez), 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- Aşağıdaki antikorlar ve reaktifler ile göz başına FACS tamponu 50 ul lekeleme hücre yüzey markörleri için antikor kokteyli hazırlanır. Anti-CD4, mor bir boya, anti-CD25 yeşil boya, anti-PD-1, mor bir boya, anti-CD8 PerCP Cy5.5 boyası ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi yakın kızılötesi (IR), floresan reaktif boya.
Not: Aktifleştirilmiş regülatör T hücrelerinin fenotipi analiz etmek için, anti-CD103 23,25 hücre yüzey markör boyanması için ilave edilebilir. - oyuk başına antikor kokteylinin 50 ul hücre pelletini. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. ile iki kez hücreleri yıkayın4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu.
- Son yıkama aşamasından sonra, süpernatant süzün ve üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlanan sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile (üreticinin protokolüne uygun olarak hazırlandı) permeabilizasyon yıkama tamponu ile iki kez hücreleri yıkayın.
- hücre içi Foxp3 boyama için antikor çözeltisi hazırlayın ve anti-Foxp3 antikor çözeltisi 50 ul hücre pelletini.
Not: daha CTLA bu aşamada eklenebilir T Dönüşümün ve regülatör T hücreleri, fenotipleri analiz etmek. - 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edilir ve adım 3.6 tekrarlayın. Son yıkama aşamasından sonra, FACS tampon 200 ul hücre pelletini ve 25 akış sitometresi ile hücrelerin fenotipini inceleyin.
- Kapısı canlı hücre nüfuslarıyon. CD4 + veya CD8 + T-hücreleri arasında PD-1 + hücrelerinin - LCMV CL13 enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerin fenotipleri analiz etmek için, Foxp3 sıklığını inceleyin.
NOT: Deneysel sonuçlara dayanarak, Foxp3 yüzdesi - PD-1 + LCMV CL13 ile 16 d pi CD4 + ve CD8 + T hem hücre popülasyonlarının% 50'den fazla olduğunu.- Regülatör T hücrelerinin frekansı ve fenotipleri analiz etmek için, CD4 + T-hücreleri arasında FoxP3 + ya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin frekansları inceleyin.
Not: Deney sonuçlarına göre, Foxp3 + veya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin yüzdesi, sırasıyla, CD4 + T hücresi popülasyonunda fazla% 20'dir.
- Regülatör T hücrelerinin frekansı ve fenotipleri analiz etmek için, CD4 + T-hücreleri arasında FoxP3 + ya Foxp3 + PD-1 + hücrelerinin frekansları inceleyin.
CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin 4. Yalıtım
Not: Tüm reaktifler hacimleri aşağıdaki belirtilen bir içindir1 x 10 7 toplam splenositlerin hücre sayısını başlangıç.
- saf ve LCMV kronik olarak enfekte olan fareler kullanılarak bölüm 2'de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon tamponunda 10 ml ilave edilerek hücreler yıkanır. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 40 ul hücre pelletini.
- Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak, CD4 + T hücresi zenginleştirme için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- Tampon 30 ul olmayan CD4 + T hücrelerinin etiketlenmesi için, anti-biyotin mikro boncuklar 20 ul ve CD25 + hücrelerinin floresan etiketlemesi için CD25-PE antikorun 10 ul ekle. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
- tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml'lik bir tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçer. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkanır.Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1.25 x 10 8 hücre yoğunluğunda 500 ul tampon içinde hücre pelletini.
- kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de tampon ve santrifüj 2 ml ekleyerek sütun yıkayın. Tamamen Süpernatantı atın ve tampon 90 ul izole CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon.
- CD25 + hücreleri manyetik işaretleme için, anti-PE mikro 10 ul ilave edilir, iyice karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.
- tampon maddesinin 2 ml ilave edilir ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkayın. Tamamen Süpernatant atılır ve en fazla 1 x 10 8 hücre yoğunluğunda tampon 500 ul hücre pelletini.
- CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri zenginleştirmek pozitif seçim için kolona hücreleri uygulamak ve colum yıkamatampon maddesinin 2 ml ekleyerek n. yıkandıkları üç kez tekrarlayın.
- Kolon son yıkama aşamasından sonra boşaldığında, kolona tampon 1 ml ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş CD4 + CD25 + piston kullanarak hücrelerin dışarı yıkayın.
- Tekrar izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı artırmak için 4.8-4.9 adımları tekrarlayın. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Süpernatant atılır ve tam RPMI ortamında 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda izole CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin yeniden süspanse edin.
- Izole edilmiş-CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin saflığı kontrol etmek için, toplam izole-CD4 + CD25 + regülatör T hücreleri 2 x 10 5 hücre kullanımı. FACS tamponu 50 ul anti-CD4 FITC içeren ve hücre canlılığı, IR-yakını flüoresan reaktif boya saptama reaktif maddesi ile hücreleri Leke.
NOT: CD25 zaten izolasyonu sırasında PE ile işaretlenmiştir. - 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini ve akış sitometrisi ile saflığını kontrol.
- Kapısı canlı hücre popülasyonu. Regülatör T hücrelerinin saflığı analiz etmek için, CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi teyit etmektedir.
Not: Deney sonuçlarına göre, saflaştırılmış hücreler arasında CD4 + CD25 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 80 üzerindedir.
CD8 + T hücreleri ve CD8 + T hücrelerinin etiketlenmesi 5. Yalıtım
NOT: Tüm reaktif hacimleri aşağıda belirtilen 1 x 10 7 toplam splenositlerin bir başlangıç hücre sayısı içindir.
- saf fareler kullanılarak bölüm 2'de tarif edildiği gibi hücreler hazırlayın. T hücresi izolasyon devetüyü 10 ml ekleyerek hücreleri yıkanırer. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve tampon 40 ul hücre pelletini.
- Manyetik Hücre Ayırma Sistemi kullanılarak CD8 + T hücre izolasyonu için, sigara CD8 + T hücresi etiketlemesi için, biyotin-antikor kokteyli 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. 4 ° C'de 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- tampon 30 ul anti-biyotin mikro-20 ul ekle. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
- kolona hücreleri uygulayın ve sütunun geçmesine etiketsiz hücreleri toplamak. Bunu tamponun üç kez 2 ml ekleyerek sütun yıkayın.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen Süpernatant atılır ve tamponun 2 ml izole edilmiş CD8 + T hücrelerini yeniden süspanse edin.
- İzole hücreler saflığını kontrol etmek için FACS tamponu içerisinde antikor çözeltisi 50 ul hazırlar. İzole CD8 + T cel arasında 2 x 10 5 hücreleri tekrar süspansiyonAntikor çözeltisinin 50 ul mi.
Not: Anti-CD8 FITC ekleyin antikor çözeltisinin hazırlanması ve hücre canlılığı saptama reaktif maddesi (IR-yakını flüoresan reaktif boya) FACS tampon içine için. - 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. Yıkama işleminden sonra, FACS tampon 100 ul hücre pelletini, ve akış sitometrisi ile hücre saflığını kontrol.
- Kapısı canlı hücre popülasyonu. CD8 + T hücrelerinin saflığını kontrol etmek için, CD8 + T hücrelerinin yüzdesini teyit etmektedir.
Not: Deney sonuçlarına göre, arıtılmış, hücreleri arasında CD8 + hücrelerinin yüzdesi yaklaşık% 90 üzerindedir. - Izole edilmiş CD8 + T hücrelerine PBS ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın. PBS içinde 1 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda izole CD8 + T hücreleri yeniden süspanse edin.
- CD8 + T ce etiketlemek içinin vitro bastırma deneyi için LLS, oda sıcaklığında 5 uM'lik bir konsantrasyon elde etmek için PBS içinde hücre çoğalması izleme mor boya seyreltin.
NOT: Çalışmada kullanılan hücre çoğalması izleme mor boya yaklaşık uyarma ve emisyon zirveleri sırasıyla 405 ve 450 nm. - 15 ml'lik bir tüp içinde hücre çoğalması, izleme, mor bir boya (5 uM) ve hücre süspansiyonu (CD8 + T hücreleri 1 x 10 7 hücre / ml) de eşit hacimde karıştırılır ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edilir. tüpü her 10 dakikada Vortex.
- Soğuk tam RPMI ortamı ile tüp doldurun ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tüpü terk. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Tamamen supernatant atmak ve önceden ısıtılmış tam RPMI ortamı ile 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
6. CD4 + CD25 + T <kullanma İn Vitro Bastırma Testi Kurmasub> reg ve CD8 + T hücreleri
- Anti-CD3 / CD28 kaplı taneler hazırlamak için, borunun, 15 ml (2.5 ul / 1 x 10 5 hücre) manyetik boncuk uygun hacim transferi. PBS eşit hacimde ilave et ve karıştır. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile yıkayın ve supernatant atın. tam ortam içinde manyetik boncuk (50 ul / oyuk) ile seyreltilir.
- CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin kısım 50 ul, U tabanlı, 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu (1 x 10 5 hücre / oyuk). Cevaplayıcı T (T resp) CD8 + T hücrelerinin hücre oyuk başına (1 x 10 5 hücre / çukur) 50 ul ekle. oyuk başına seyreltilmiş, anti-CD3 / CD28 kaplı manyetik boncuklar 50 ul ekle.
NOT: aşağıdaki gibi kontrol kuyuları kurmak bu adımı, etiketli ve: hiçbir anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile "sadece uyarılmamış CD8 + T hücresi"; "CD8 + T hücresi yalnızca" anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile; "CD8 + T hücresi yalnızca"Anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar,". Regülatör T hücresi sadece "anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile regülatör T hücreleri, T, farklı bir oranda tam ortam ve CO-kültürlenmiş T solunum hücreleri ile seyreltilmiş olabilir Solunum hücreleri: regülatör T hücreleri (1: 0.25-1: 1). - 200 ul toplam hacmine her kuyulara 50 ul ya da ortamın uygun bir hacim. Folyo ile plaka Kapak ve 72 saat boyunca 37 ° C'de bir CO2 kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
CD8 + T hücrelerinde 7. analizi CD8 + T hücre proliferasyonu ve sitokin üretim
- sitokin üretimi analizi için, kültür, 3 gün sonra, iyi bir plaka her yüzey maddesi ayrılır ve enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) ile yerine getirir.
Not: üstteki sıvı kısımlar halinde -70 ° C'de muhafaza edilebilir. Bu deneyde, anti-fare IFN-γ, antikor kaplı plaka IFN-γ üretimi anlaşması tespit etmek için kullanıldıÜreticinin protokolüne ing. Bir tek hücre düzeyinde, CD8 + T hücrelerinin proliferasyon IFN-γ üretimini belirlemek için, hücre içi sitokin boyama yapılabilir. - her gözden üst fazın ayrılmasından sonra, 4 ° C'de (3 kez), 2 dakika boyunca 300 xg'de FACS tamponu ve santrifüj ile hücreler içeren plakayı yıkayın.
- Yıkama işleminden sonra, süpernatant atılır. Prolifere CD8 + T hücrelerinin boyanması için antikor kokteyli 50 ul hücre pelletini. 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin.
Not: FACS tampon, anti-CD4 FITC, anti-CD8 PerCP Cy5.5 ve hücre canlılığı saptama reajanı (IR-yakını flüoresan reaktif boya) ekleyin, antikor kokteyli hazırlanması.
NOT: Bu, CD44 veya CD69 gibi çeşitli belirteçler karşı olan antikorlar, CD8 + T hücrelerinin aktivasyonunu teyit etmek için, diğer antikorlar ile birleştirilebilir. CD8 + T hücreleri zaten hücre çoğalması izleme v ile etiketlenmiş edilmiştir unutmayınAdım 5.10 de iolet boya. - 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile iki kez yıkanır. Son yıkama aşamasından sonra, supernatant atmak ve sabitleme tampon 100 ul ile 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika boyunca hücrelerin tespit.
- 4 ° C'de 2 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile iki kez yıkanır. FACS tampon 200 ul hücreleri yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi ile hücre çoğalması izleme mor boya etiketli CD8 + T hücrelerinin proliferasyonunu ölçer.
- Kapı canlı hücreleri arasında CD8 + T hücresi popülasyonu. Hücre çoğalması, izleme, mor bir boya ve şu denkleme göre, CD8 + T hücresi seyreltme seyreltme göre ayrılır ve kesintisiz hücrelerin yüzdelerini ölçün. % Önleme = [(T Reg hücrelerin yokluğunda çoğaldı CD8 + T hücrelerinin% - regülatör T hücrelerin varlığında çoğalan CD8 + T hücrelerinin%) / (% olarak çoğalmıştır CD8 + T hücrelerininT reg hücrelerinin yokluğu)] x 100 Ayrıntılı yazılımın 25 flow sitometri kullanarak verileri analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz intravenöz LCMV CL13 2 x 10 6 pfu ile enjekte edilerek kalıcı virüs enfeksiyonu ile fareler üretti. Regülatör T hücreleri ve kronik virüs enfeksiyonu sırasında T dönüşüm hücrelerde fenotipik değişiklikler araştırıldı, saf ve enfekte farelerden elde edilen dalak lenfositleri çeşitli antikorlarla boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. CD4 + T sohbetler (Şekil 1A, üst panel) ve Foxp3 - - CD8 + T sohbetler (Şekil 1B, üst panel) hücreleri 16 d pi anda, PD-1 Foxp3 hem de yukarı regüle edilmiştir. Foxp3 + CD4 + regülatör T hücrelerinin frekansı saf farelerde (Şekil 1A) daha LCMV CL13 ile enfekte olmuş farelerde, iki kat daha yüksek olmuştur. Özellikle, FoxP3 + CD4 + regülatör T hücrelerinin çoğu yüksek seviyede ifade eden, aktif fenotipini gösterdiPD-1, bu zaman noktasında (Şekil 1A).
In vitro bastırma deneyi için, CD8 + T dönüşüm hücre ve CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin önemli bir bölümü gerekmiştir. 1 x 10 7 hücre çoğalma izleme mor boya etiketli CD8 + T hücreleri elde etmek için, saf fareler iki dalaklarından splenositler toplandı. 2 x 10 6 veya CD4 + CD25 + regülatör T hücrelerinin x 10 6 3 elde edilmesi için, saf ve LCMV CL13 ile enfekte farelerde en az üç dalakları, sırasıyla bir araya toplanmıştır. T hücreleri gibi solunum, CD8 + T hücreleri, diğer bağışıklık hücreleri (Şekil 2A) ile birlikte önemli bir kirlenme olmadan başarılı bir şekilde ayrıldı. Regülatör T hücreleri de% 80'den fazla saflığa (Şekil 2B) olan CD25 +, CD4 + T hücreleri baskın nüfusu ile izole edildi.
Saf ve kronik regülatör T hücrelerinin baskılayıcı işlevi karşılaştırmak için, izole edilmiş T Reg ve T resp hücreleri 3 gün boyunca 37 ° C 'de, anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile stimülasyon altında birlikte inkübe edildi. CD8 + T solunum hücresi çoğalmasının% inhibisyon, bir regülatör T hücre Dese bağlı bir şekilde (Şekil 3A) artmıştır. CD8 + T hücreleri, resp 1 oranında kronik regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür edilmişlerdir: 1, CD8 + T solunum hücrelerinin proliferasyonu anlamlı (Şekil 3b) inhibe edilmiştir. CD8 + T hücreleri, solunum, kronik olarak enfekte farelerden yerine regülatör T naif farelerin regülatör T hücreleri dinlenme aktive regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür iken, CD8 + T hücreleri tarafından solunum IFN-γ üretimi önemli ölçüde önlendi (Şekil 3C).
Şekil 1: 16 d PI (A) PD-1 ya da Foxp3 üzerindeki CD25 ifadesi, bir saf fare ya da LCMV CL13-enfekte edilen farelerin dalak CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin fenotipleri - CD4 + T sohbetler ve Foxp3 + CD4 + regülatör T hücreleri. Foxp3 Pd-1 ya da CD25 (B) ifade - CD8 + T dönüşüm hücreleri. Dalaktaki lenfositler CD4, CD8, CD25, PD-1 ve Foxp3 karşı antikorlar ile boyandı. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. Panel A referans olarak 25 modifiye edilmiştir. Tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2: saf ya da LCMV CL13 enfekte farelerden izole naif farelerde ve regülatör T hücrelerinden izole edilen T solunum hücrelerinin saflığı izolasyonundan sonra, CD8 + T hücreleri (A) yüzdesi.. Izolasyondan sonra CD25-eksprese eden CD4 + regülatör T hücrelerinin (B) oranı. (B) 'de her bir kadran CD4 ve CD25 ekspresyon seviyeleri ile belirlenir. Veriler, üç bağımsız deneyler temsilcisi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
les / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg "/>
Şekil 3: CD8 + T hücresi yanıtı aktive regülatör T hücrelerinin Etkisi regülatör T hücresi doza bağlı bir şekilde regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücreleri (A)% inhibisyon.. 1'de regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücreleri (B) Çoğalma: 1 oranında. Bir regülatör T hücresi doza bağlı bir şekilde regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücrelerinin (Cı), IFN-γ üretimi. CD8 + T hücrelerinin proliferasyonu çoğaldı CD8 + T hücreleri ve IFN-γ salgılanmasına hücre çoğalması izleme mor boyanın seyreltme ile ölçülmüştür ELISA ile değerlendirilmiştir. Hücre çoğalması, izleme mor boya etiketli CD8 + T hücreleri, T varlığında ya da yokluğunda, 3 gün boyunca, anti-CD3 / CD28 kaplı boncuklar ile uyarıldı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Regülatör T hücrelerinin sadece küçük bir bölümü, farelerde ve insanlarda mevcut olmakla beraber, bunların bir bağışıklık tepkisi düzenlenmesi ve immün tolerans korumada önemli bir rol oynar olarak işlev anlamak önemlidir. T numarası ve baskılayıcı işlevleri kronik virüs enfeksiyonuna 15-20 yanı sıra kanser ilerlemesi 13,14 sırasında hücreler artar reg. Bu muhtemelen devam antijen uyarılmasına bağlıdır. Reg hücreleri antijen sebat ve hastalık gelişimi altında faaliyet T değerlendirmek, onların baskılayıcı aktivitesi ölçülür gerekmektedir.
Burada, regülatör T hücrelerinin ex vivo fenotip analizi ve CD8 + T hücreleri ve regülatör T hücrelerinin in vitro ko-kültür sistemi kullanılarak baskılayıcı aktivitesini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Mevcut protokol Kritik adımlar analizi ve T reg hücrelerinin izolasyonu vardır. Canlı ve taze izole edilen T
Baskılayıcı aktivitesi incelemek için, T hücreleri ve solunum regülatör T hücreleri, regülatör T 1 1. ortak-kültürünün bir oranda eş kültürlenmiştiryerli farelerden regülatör T hücreleri ile karşılaştırıldığında kronik olarak enfekte olan farelerden alınan hücrelerin önemli ölçüde CD8 + T hücre çoğalmasını ve IFN-γ salgısı azalır. Bu regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, CD8 + T hücrelerinin çoğalma ve sitokin üretimi ters regülatör T hücrelerinin bastırma fonksiyonu ile ilgili olduğunu ima eder. Bu protokol dışı T reg hücreleri ile T reg hücre izolasyonu, kontaminasyon için bir manyetik hücre ayırma sistemi kullanılmasını önerir rağmen göz ardı edilemez. CD25 sık sık aktive CD4 + T dönüşüm yanı sıra T reg hücreleri üzerinde aşırı olarak Foxp3-GFP muhabiri farelerden 28-30 elde edilen T reg hücreleri, doğru manyetik hücre ayırma sisteminden daha regülatör T hücrelerinin işlevini araştırmak için daha iyi adaylardır.
T reg hücrelerinin baskılayıcı fonksiyonu çeşitli in vitro değerlendirilmiştirbastırma deneyleri 16,28,31-34. In vitro bastırma tahlilinde avantajı, yalnızca T solunum hücreleri regülatör T hücreleri ile birlikte-kültür, çünkü CD8 + T hücresi tepkisinin inhibisyonu üzerindeki regülatör T hücrelerinin doğrudan etki değerlendirir olmasıdır. CD8 + T hücreleri ile birlikte, CD25 - CD4 + T hücreleri yerine T solunum hücreleri 25 kullanılabilir. Örneğin dendritik hücreler ya da doğal katil hücreler gibi bağışıklık hücreleri üzerinde regülatör T veya T dönüşüm hücrelerinin etkisi deneysel koşullar değiştirilerek değerlendirilebilir.
Bir tekrarların glikoprotein gibi CD103 35, LAG-3 36 olarak Moleküller, CD43 38, CD11a 38 37 egemen, ya da öldürücü hücre lektin benzeri reseptör altfamilya G üye 1 38 özel hastalıklarda aktive T reg hücrelerinin belirteçleri olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, biz bir şekilde PD-1 kullanılırGösterge kronik virüs enfeksiyonu sırasında T reg hücrelerini aktive tanımlamak için. Bu protokol, spesifik koşullar altında regülatör T hücrelerinin yönlü analizi (fenotipik ve işlevsel) için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 |
| Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | |
| Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 |
| Cell strainer, 70 mm | BD Biosciences | 352350 | |
| Cell strainer, 40 mm | BD Biosciences | 352340 | |
| Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 |
| Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 |
| APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | |
| PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 |
| Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | |
| RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | |
| PBS (1x) | GE Life Sciences | SH30256 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Gibco | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml | Gibco | 10378-016 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | |
| CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | |
| MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | |
| MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | |
| EDTA, 0.5 M (pH 8.0) | Promega | V4231 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | |
| BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | ||
| Flowjo | TreeStar | ||
| Hematocytomer | Marienfeld superior |
References
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
- McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
- Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
- Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
- Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
- Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
- Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
- Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
- cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. 33 (4), 181-189 (2012).
- You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
- Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
- Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
- Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
- Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
- Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
- Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
- Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
- Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
- Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
- Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R.
- Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
- Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
- Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
- Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
- Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
- Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
- Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
- Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
- Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
- Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
- Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).
