Summary

Фенотипическая и функционального анализа активированных регуляторных Т-клеток, выделенных из хронического лимфоцитарного хореоменингита инфицированных вирусом мышей

Published: June 22, 2016
doi:

Summary

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Abstract

Регуляторные Т (Т р) клетки, которые выражают Foxp3 как транскрипционный фактор, являются подмножествами CD4 + Т – клеток. Т – клетки играют Reg критическую роль в иммунной толерантности и поддержания гомеостаза путем регуляции иммунного ответа. Основная роль клеток Т рег является подавление пролиферации эффекторных Т (Т эфф) клеток и выработку цитокинов , таких как IFN-gamma, TNF-alpha и IL-2. Было показано , что способность Т Reg клеток к ингибировать функцию Т – клеток эфф усиливается во время хронической инфекции патогеном и развития рака. Для уточнения функции клеток Т рег под покоящихся или воспаленных условиях, разнообразие лабораторных анализов подавления в с помощью мыши или человека Т – клетки REG были изобретены. Основной целью данного исследования является разработка метода для сравнения различий в фенотип и супрессивной функции между отдыхавших и активированные Т регклетки. Для выделения активированные Reg Т – клеток, мышей инфицировали вирусом лимфоцитарного хореоменингита (LCMV) клона 13 (CL13), хроническое напряжение LCMV. Клетки Т рег , выделенные из селезенки LCMV CL13-инфицированных мышей обнаруживалось как активированный фенотип и повышенную активность по сравнению с супрессивной покоящихся клеток Т – Reg , выделенных из нативных мышей. Здесь мы опишем базовый протокол для анализа экс естественных условиях фенотипа , чтобы отличить активированные клетки Т – REG от покоя Т рег клеток. Кроме того, мы опишем протокол для измерения подавляющей активности полностью активированных клеток Т рег.

Introduction

Регуляторные Т (Т р) клетки экспрессируют Forkhead коробки P3 (FOXP3) в качестве фактора транскрипции для их развития и функции 1. Кроме того, клетки Т – Reg выражают различные другие молекулы , такие как CD25 , 2, ген-лимфоцитами активации 3 (LAG-3) 3, индуцированной глюкокортикоидами фактор некроза опухоли рецепторов 4, и цитотоксические Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA-4) 5 на их поверхности, или внутриклеточной области. При хронической инфекции с различными видами патогенов , таких как вирусы, бактерии 6,7 8,9 и паразитов 10-12, или в процессе развития рака 13,14, клетки Т рег дифференцируются в активированных клетках, демонстрируя повышенную функцию подавляющий нацеливание эффекторных CD4 + и CD8 + Т – клеток. Ряд работ предположили , что расширенные и активированные Т – клетки рег способствуют обесцененных RESPONS CD8 + Т – клетоке во друга ретровируса (FV) инфекции 15-17. FV-индуцированных Т рег клетки ингибируют IFN-gamma или экспрессию гранзимом и цитотоксическую реактивность CD8 + Т – клеток 15-17. Кроме того, в модели вирусной инфекции простого герпеса, сообщалось , что истощение клеток CD4 + CD25 + Т рег привело к расширению вирус-специфических CD8 + Т – клеток и повреждения тяжелой ткани за счет инфильтрации immunopathogenic CD4 + Т – клеток 18-20.

Мыши инфицированных хронически штаммом вируса лимфоцитарного хориоменингита клон 13 (LCMV CL13) 21-24 широко используются для характеристики фенотипа и функции эффекторных Т – клеток (Т EFF) и Т – клеток рег при хронической вирусной инфекции. Во время хронической инфекции LCMV, вирус-специфические Т эфф клетки постепенно теряют свою функцию эффекторной и разрядиться T (T л.д.) клетки. С другой стороны, Tрег клетки усиливают их способность подавлять реакцию вирус-специфических Т – клеток 25. Снижение в функционировании емкости ЕФФ Т – клеток можно объяснить несколькими факторами , такими как повышающей регуляции ингибиторных рецепторов на эфф Т – клеток, измененную функцию антиген-представляющих клеток, продукции иммунорегуляторных цитокинов и увеличение частоты или расширенной функции Т рег 26 клетки. Среди факторов , участвующих в подавлении Т – клеток, программируемая гибель клеток белок-1 (ПД-1) -expressing клетки EXH Т и Т – клетки , Reg широко рассматривается в качестве признаков антигена персистенции и ингибирующее среды. Недавно было сообщено о том, что блокада PD-1 и пути абляции клеток Т рег приводить к усилению функции Т – клеток и снижение вирусной нагрузки во время LCMV хронической инфекции 27. Кроме того, клетки Т рег активируются при хронической инфекции мышей с LCMV 23,25 </sвверх> и их подавляющая функция усиливается 25. PD-1 сильно экспрессируется на Т рег клеток, а также Т – клетки EXH, а уровень PD-1 , выраженное рег Т – клеток коррелирует с силой , подавляющей функции ингибировать пролиферацию Т – клеток на 25.

Здесь мы опишем метод для сравнения характеристик активированных Т – клеток , выделенных из рег мышей , инфицированных LCMV CL13 и клеток покоящихся Т рег , выделенных из наивных мышей. Кроме того, мы объясняем ряд процессов , чтобы отделить активированные клетки Т – REG и проверяет их ех естественных фенотипа, а также измерить их подавляющую активность в пробирке.

Protocol

В этом исследовании мышей содержали в определенной патогена объекта животного научно-исследовательского центра Йонсейского Лаборатория Йонсей. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами корейской пищевых продуктов и медикаментов с исполь?…

Representative Results

Мы получили мышей с персистирующей вирусной инфекцией, вводя их с 2 х 10 6 БОЕ LCMV CL13 внутривенно. Для того, чтобы исследовать фенотипические изменения в клетках рег Т и Т Conv ​​клеток при хронической вирусной инфекции, лимфоцитов селезенки , полученные о…

Discussion

Несмотря на то, лишь небольшое число клеток Т – рег существуют у мышей и человека, важно , чтобы понять их функцию , поскольку они играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа и поддержания иммунной толерантности. Номерные и подавляющие функции Т рег клеток увеличиваетс?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

Materials

FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714 Use this reagent for cell surface staining.
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655 Use this reagent for cell surface staining.
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Cell strainer, 70mm BD Biosciences 352350 Use this strainer for grinding the whole spleen.
Cell strainer, 40mm BD Biosciences 352340 Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1X) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975 Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901 Use this column for Treg cell isolation
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401 Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation
EDTA, 0.5M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences Flow cytometer*
Flowjo TreeStar Flow cytometry software†
Hematocytomer Marienfeld superior

References

  1. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
  2. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  3. Huang, C. T., et al. Role of LAG-3 in regulatory T cells. Immunity. 21 (4), 503-513 (2004).
  4. McHugh, R. S., et al. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor. Immunity. 16 (2), 311-323 (2002).
  5. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med. 192 (2), 303-310 (2000).
  6. Manigold, T., et al. Foxp3+CD4+CD25+ T cells control virus-specific memory T cells in chimpanzees that recovered from hepatitis. C. Blood. 107 (11), 4424-4432 (2006).
  7. Andersson, J., et al. The prevalence of regulatory T cells in lymphoid tissue is correlated with viral load in HIV-infected patients. J Immunol. 174 (6), 3143-3147 (2005).
  8. Chen, X., et al. CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells suppress Mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease. Clin Immunol. 123 (1), 50-59 (2007).
  9. Shafiani, S., Tucker-Heard, G., Kariyone, A., Takatsu, K., Urdahl, K. B. Pathogen-specific regulatory T cells delay the arrival of effector T cells in the lung during early tuberculosis. J Exp Med. 207 (7), 1409-1420 (2010).
  10. Belkaid, Y., Piccirillo, C. A., Mendez, S., Shevach, E. M., Sacks, D. L. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature. 420 (6915), 502-507 (2002).
  11. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-beta pathway. J Exp Med. 207 (11), 2331-2341 (2010).
  12. Taylor, M. D., van der Werf, N., Maizels, R. M. cells in helminth infection: the regulators and the regulated. Trends Immunol. 33 (4), 181-189 (2012).
  13. You, Z. Tumor regulatory T cells potently abrogate antitumor immunity. J Immunol. 182 (10), 6160-6167 (2009).
  14. Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
  15. Dittmer, U., et al. Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection. Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).
  16. Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells. J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).
  17. Iwashiro, M., et al. Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).
  18. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses. J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).
  19. Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions. J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).
  20. Veiga-Parga, T., et al. On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions. J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).
  21. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).
  22. Jin, H. T., et al. Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).
  23. Punkosdy, G. A., et al. Regulatory T-cell expansion during chronic viral infection is dependent on endogenous retroviral superantigens. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3677-3682 (2011).
  24. Blackburn, S. D., et al. Coregulation of CD8+ T cell exhaustion by multiple inhibitory receptors during chronic viral infection. Nat Immunol. 10 (1), 29-37 (2009).
  25. Park, H. J., et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).
  26. Virgin, H. W., Wherry, E. J., Ahmed, R. Redefining chronic viral infection. Cell. 138 (1), 30-50 (2009).
  27. Penaloza-MacMaster, P., et al. Interplay between regulatory T cells and PD-1 in modulating T cell exhaustion and viral control during chronic LCMV infection. J Exp Med. 211 (9), 1905-1918 (2014).
  28. Chang, M., et al. The ubiquitin ligase Peli1 negatively regulates T cell activation and prevents autoimmunity. Nat Immunol. 12 (10), 1002-1009 (2011).
  29. Krishnamoorthy, N., et al. Early infection with respiratory syncytial virus impairs regulatory T cell function and increases susceptibility to allergic asthma. Nat Med. 18 (10), 1525-1530 (2012).
  30. Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. J Exp Med. 209 (10), 1713-1722 (2012).
  31. Tai, X., et al. Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventional CD4(+) T cells. Blood. 119 (22), 5155-5163 (2012).
  32. Rushbrook, S. M., et al. Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection. J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).
  33. Sekiya, T., et al. The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4. T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).
  34. Merianos, D. J., et al. Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice. J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).
  35. Allakhverdi, Z., et al. Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets. J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).
  36. Camisaschi, C., et al. LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).
  37. Wang, R., et al. Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).
  38. Myers, L., et al. IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection. J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).

Play Video

Cite This Article
Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

View Video