Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.
Regulatoriska T (T reg) celler, vilka uttrycker Foxp3 som en transkriptionsfaktor, är undergrupper av CD4 + T-celler. T reg celler spelar avgörande roller i immuntolerans och homeostas underhåll genom att reglera immunsvaret. Den primära rollen av T-reg-celler är att undertrycka proliferationen av effektor-T (T eff) celler och produktionen av cytokiner såsom IFN-γ, TNF-α, och IL-2. Det har visats att T reg cellernas förmåga att inhibera funktionen av T-eff celler förstärks under ihållande patogen infektion och utveckling av cancer. För att förtydliga funktionen av T-reg celler under vila eller inflammerade villkor, ett flertal in vitro-undertrycknings analyser med användning av mus eller humant T reg-celler har uppfunnits. Huvudsyftet med denna studie är att utveckla en metod för att jämföra skillnaderna i fenotyp och undertryckande funktion mellan vilande och aktiverade T regceller. För att isolera aktiverade T-reg-celler, möss infekterade med lymfocytär koriomeningitvirus (LCMV) klon 13 (CL13), en kronisk stam av LCMV. T reg-celler isolerade från mjälten hos LCMV CL13-infekterade möss uppvisade både den aktiverade fenotypen och förbättrad suppressiv aktivitet jämfört med vilande T reg celler som isolerats från naiva möss. Här beskriver vi den grundläggande protokollet för ex vivo fenotyp analys att skilja aktiverade T-reg-celler från vilande T reg-celler. Dessutom beskriver vi ett protokoll för mätning av den undertryckande aktiviteten hos helt aktiverade T-reg-celler.
Regulatoriska T (T reg) celler uttrycker forkhead box P3 (Foxp3) som en transkriptionsfaktor för deras utveckling och funktion 1. Dessutom T reg-celler uttrycker olika andra molekyler såsom CD25 2, lymfocyt-aktivering gen 3 (LAG-3) 3, glukokortikoid-inducerad tumömekrosfaktor-receptor 4, och cytotoxisk T-lymfocyt-associerat protein 4 (CTLA-4) 5 på sin yta eller intracellulära regionen. Under kronisk infektion med olika typer av patogener, såsom virus 6,7, bakterier 8,9 och parasiter 10-12, eller i samband med cancerutveckling 13,14, blir T reg-celler differentieras till aktiverade celler, visar förbättrad undertryckande funktion inriktnings effektor CD4 + och CD8 + T-celler. Ett antal artiklar har föreslagit att expanderade och aktiverade T-reg-celler bidrar till osäkra CD8 + T-cells response under vän retrovirus (FV) infektion 15-17. FV-inducerade T reg-celler inhiberar IFN-γ eller granzym B-uttryck och cytotoxiska reaktivitet av CD8 + T-celler 15-17. Dessutom i ett herpes simplex-virus infektionsmodell, rapporterades det att utarmning av CD4 + CD25 + T-reg-celler resulterade i expansion av virusspecifika CD8 + T-celler och allvarlig vävnadsskada genom infiltrering av immunopathogenic CD4 + T-celler 18-20.
Möss infekterade kroniskt med klon 13-stammen av lymfocytisk koriomeningitvirus (LCMV CL13) 21-24 har ofta använts för att karakterisera fenotypen och funktionen av effektor-T-celler (T eff) och T reg-celler under kronisk virusinfektion. Under ihållande LCMV infektion, virus-specifika T eff celler förlorar gradvis sin effektorfunktion och blir utmattad T (T exh) celler. Å andra sidan, Treg-celler förstärker deras förmåga att undertrycka virusspecifikt T-cellsvar 25. Minskningen i den fungerande kapacitet av T eff celler kan förklaras av flera faktorer, såsom uppreglering av hämmande receptorer på T eff celler, förändrad funktion av antigenpresenterande celler, produktion av immunregulatoriska cytokiner, och ökad frekvens eller ökad funktion av T-reg celler 26. Bland de faktorer som är involverade i T-cellundertryckning, programmerad celldöd protein-1 (PD-1) uttryckande T EXH celler och T-reg-celler har allmänt betraktas som kännetecken av antigen uthållighet och undertryckande miljö. Nyligen rapporterades det att blockaden av PD-1 vägen och ablation av T-reg-celler leder till förbättrad funktion T-cell och minskad virusbelastning under LCMV kronisk infektion 27. Vidare är T reg-celler aktiveras under kronisk infektion av möss med LCMV 23,25 </supp> och deras undertryckande funktion stärks 25. PD-1 uttrycks kraftigt på T reg-celler såväl som T EXH celler, och nivån på PD-1 uttrycks av T reg-celler korrelerar med styrkan av sin suppressiva funktionen att inhibera T-cellsproliferation 25.
Här beskriver vi en metod för att jämföra egenskaperna hos aktiverade T-reg-celler som isolerats från möss infekterade med LCMV CL13 och vilande T reg celler som isolerats från naiva möss. Dessutom förklarar vi en rad processer för att separera aktiverade T-reg-celler och undersöka deras ex vivo fenotyp, samt mäta deras undertryckande aktivitet in vitro.
Även om det finns bara ett litet antal av T-reg-celler i möss och människor, är det viktigt att förstå deras funktion eftersom de spelar en avgörande roll i regleringen av immunförsvaret och bibehålla immuntolerans. Siffer och undertryckande funktioner T reg celler ökar under en kronisk virusinfektion 15-20 samt cancerutveckling 13,14. Detta är troligen på grund av fortsatt antigenstimulering. För att utvärdera T reg celler fungera under antigen uthål…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).
FITC Rat Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | BD Biosciences | 553047 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Use this reagent for cell surface staining. | |
U-Bottom Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353077 | ||
Fixation buffer | BD Biosciences | 554655 | Use this reagent for cell surface staining. | |
FITC Rat Anti-Mouse CD25 | 7D4 | BD Biosciences | 553072 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Cell strainer, 70mm | BD Biosciences | 352350 | Use this strainer for grinding the whole spleen. | |
Cell strainer, 40mm | BD Biosciences | 352340 | Use this strainer for filtering the cells before column enrichment. | |
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) | 29F.1A12 | BioLegend | 135217 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 | RM4-5 | Biolegend | 100547 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3 | FJK-16s | eBioscience | 17-5773 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5223 | ||
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a | 53-6.7 | eBiosicence | 45-0081 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer. |
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA | eBiosicence | BMS606 | ||
RPMI 1640 | GE Life Sciences | SH30027 | ||
PBS (1X) | GE Life Sciences | SH30256 | ||
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | ||
L-Glutamine, 200mM solution | Gibco | 25030 | ||
Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL | Gibco | 10378-016 | ||
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L-34975 | Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer. | |
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-104-075 | ||
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyibiotec | 130-091-041 | ||
MACS Separation Columns, LD columns | Miltenyibiotec | 130-042-901 | Use this column for Treg cell isolation | |
MACS Separation Columns, LS columns | Miltenyibiotec | 130-042-401 | Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation | |
EDTA, 0.5M (pH 8.0) | Promega | V4231 | ||
2-Mercaptoethanol | Sigma Life Science | M7522 | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30919.03 | ||
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34557 | ||
BD Canto II flowcytometer | BD Biosciences | Flow cytometer* | ||
Flowjo | TreeStar | Flow cytometry software† | ||
Hematocytomer | Marienfeld superior |