We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (Vκ) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.
Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research.
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.
आईजीएम निर्धारण के एंटीबॉडी कैंसर और सीएनएस विकारों 1-7 सहित विभिन्न रोगों के उपचार के लिए महान चिकित्सीय क्षमता प्रदर्शित करता है। Vollmers 'समूह ट्यूमर विशिष्ट बायोमार्कर या सक्रिय चिकित्सा विज्ञान है कि apoptotic रास्ते 4,8,9 उत्प्रेरण द्वारा घातक कोशिकाओं को मारने में सक्षम हैं के रूप में संभावित इस्तेमाल के लिए कैंसर के रोगियों में कई एंटीबॉडी की पहचान की। दिलचस्प है, चिकित्सीय क्षमता के साथ सभी की पहचान एंटीबॉडी आईजीएम निर्धारण के हैं और "प्राकृतिक स्वप्रतिपिंडों" (nabs) के समूह के हैं।
इसी तरह, रोड्रिगेज के समूह माउस और मानव एंटीबॉडी कि मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) के मॉडल में चिरकाल demyelinated रीढ़ की हड्डी घावों में remyelination को प्रोत्साहित पहचान की। विरोधी कैंसर प्रभाव के साथ एंटीबॉडी के लिए समान है, सभी remyelination को बढ़ावा देने के एंटीबॉडी nabs हैं और आईजीएम निर्धारण 1,6,7,10 की। सबसे पहचान IgMs के लिए सटीक एंटीजन अभी भी undetermine हैंएमएस रोगियों 11 के लिए मैं क्लिनिकल परीक्षण मानव remyelination को बढ़ावा देने के एंटीबॉडी rHIgM22, चरण में वर्तमान सहित घ। दोनों शैक्षणिक सेटिंग में और उद्योग 11 के साथ साझेदारी में लिपिड और कार्बोहाइड्रेट अनुसंधान के क्षेत्र में विशेषज्ञों के लगातार प्रयासों के बावजूद, की पहचान करने के rHIgM22 के प्रतिजन सफल नहीं किया गया है प्रयास करता है। मानक आईजीएम एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए आईजीजी के एंटीजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक की विफलता ये एंटीबॉडी कि सबसे अधिक संभावना लक्ष्य कार्बोहाइड्रेट या लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्ट तरीके को निखारने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता को पहचानती है।
इस पांडुलिपि का ध्यान केंद्रित मानव पुनर्योजी एंटीबॉडी HIgM12 और प्रयोगात्मक अपने प्रतिजन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं है। एंटीबॉडी HIgM12 Waldenstrom के macroglobulinemia के साथ रोगियों से पहचान की थी, इन विट्रो 12-14 में neurite परिणाम को बढ़ावा देने और polysialic एसिड (पीएसए) तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (पीएसए एनसीए से जुड़ी लक्षित करता हैएम) 15,16। HIgM12 ए एल एस 17 के एक माउस मॉडल में फैली जीवन-काल और Theiler के murine encephalomyelitis वायरस (TMEV) -infected चूहों में कार्यात्मक परिणाम में सुधार। विशेष रूप से, HIgM12 चिरकाल demyelinated चूहों और बढ़ जाती है छोटे और मध्यम व्यास रीढ़ की हड्डी एक्सोन आठ सप्ताह की संख्या में सहज क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर मोटर गतिविधियों को बढ़ावा देने के लिए एक एकल, intraperitoneal की कम खुराक इंजेक्शन एंटीबॉडी 18 के बाद।
तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु (NCAM) इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) superfamily न्यूरॉन्स, glia, कंकाल की मांसपेशी, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं 19-25 की कोशिका की सतह पर व्यक्त की एक ग्लाइकोप्रोटीन है। तीन प्रमुख NCAM isoforms करार दिया NCAM180, NCAM140, और NCAM120, एक प्राथमिक प्रतिलेख के वैकल्पिक ब्याह वेरिएंट कि उनके cytoplasmic डोमेन में ही भिन्न हैं। सीएनएस के भीतर, NCAM प्रमुख polysialylated अणु (> 95%) लंबे, नकारात्मक आरोप लगाया सियालिक एसिड homopolymers के साथ है। Polysialic एकn> 10 के साथ सीआईडी पीएसए कहा जाता है, लेकिन कम oligomeric संरचनाओं का अस्तित्व भी है कि जैविक रूप से प्रासंगिक हैं। अन्य polysialylated सीएनएस में व्यक्त प्रोटीन SynCAM1 26, Neuropilin -2 (NRP -2) 27,28 रहे हैं और एक सोडियम चैनल सबयूनिट 25 (समीक्षा के लिए 29 देखें)।
यहाँ वर्णित विधियों विशिष्ट कापा (Vκ) प्रकाश चेन (मानव एंटीबॉडी और माउस एंटीबॉडी के लिए VκI प्रकाश श्रृंखला के लिए VκI, VκIII या VκIV प्रकाश चेन) युक्त मानव और माउस इम्युनोग्लोबुलिन के लिए प्रतिजन पहचान की अनुमति एंटीबॉडी का निर्धारण (जैसे, आईजीजी, आईजीएम की परवाह किए बगैर , आईजी ऐ, आईजीडी या आईजीई)। इस सीमा आईजीएम निर्धारण के एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitations के लिए प्रोटीन एल agarose के उपयोग पर आधारित है। वैकल्पिक रणनीतियों mannose बाध्यकारी lectins और covalently मोती agarose से जुड़े माध्यमिक आईजीजी विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी, जो अधिक आईजीएम एंटीबॉडी के लिए इस पद्धति के प्रयोग व्यापक हो सकता है शामिल हो सकते हैं इंकलैम्ब्डा (λ) प्रकाश चेन के साथ उन luding (चर्चा देखने के लिए)। 1 30: आईजीएम λ प्रकाश स्वस्थ व्यक्तियों से निकाली गई चेन की तुलना में सीरम आईजीएम Vκ प्रकाश चेन का अनुपात 1.5 रहे हैं।
Chromatographic यहां इस्तेमाल किया, अलग समृद्ध, और प्रतिरक्षा के कुछ अणुओं का पता लगाने के 31 कार्यप्रणाली के आधार पर, सभी एंटीजन कम से कम एक छोटे प्रोटीन डोमेन शामिल करने के लिए आवश्यक हैं। एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन मिलान के भीतर या प्रोटीन डोमेन (जैसे, ग्लाइकोप्रोटीन, लिपो प्रोटीन में) के बाहर हो सकता है। प्रारंभिक जैव रासायनिक HIgM12 के लिए विशिष्ट प्रतिजन पहचान करने के लिए संभावित उम्मीदवारों की सूची को कम करने के लिए संबंधित इस्तेमाल किया कदम, इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सेल प्रकार विशिष्ट तैयारियाँ और सेल आकृति विज्ञान आधारित अभिलक्षण glial कोशिकाओं के लिए वर्णित हैं लेकिन इस पद्धति के भीतर या बाहर सीएनएस अन्य प्रकार की कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए extrapolated किया जा सकता है।
वहाँ एक जरूरी हैविशेष रूप से उन मामलों में अलग-अलग मानव विकारों के लिए चिकित्सीय क्षमता (आईजीएम एंटीजन के बहुमत) के साथ आईजीएम एंटीबॉडी जहां एंटीबॉडी लक्ष्यों कार्बोहाइड्रेट या लिपिड संरचनाओं हैं की बढ़ती संख्या के लिए लागू नई या संशोधित तकनीक विकसित करने की जरूरत है।
मानव प्राकृतिक आईजीएम स्वप्रतिपिंडों immunotherapies के लिए उम्मीदवारों अपील कर रहे हैं और कैंसर और सीएनएस विकारों 1-7 सहित विभिन्न रोगों के उपचार के लिए चिकित्सीय क्षमता का प्रदर्शन किया है। हितकर, ये एंटीबॉडी एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में जो निष्क्रिय करने एंटीबॉडी की पीढ़ी काफी हद तक प्रभावी चिकित्सीय खुराक और प्रभावकारिता को कम कर देता बटोर नहीं होंगे। महत्वपूर्ण बात है, चिकित्सीय क्षमता के साथ सभी एंटीबॉडी आईजीएम निर्धारण के लिए किया गया है और एनएबी प्रदर्शनों की सूची 3-5,8,9,37,40,42-45 करने के लिए संबंधित है। आईजीएम एंटीबॉडी के संभावित नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक बड़ी बाधा उनकी एंटीजन, जो कई मामलों में अनिर्धारित कर रहे हैं की पहचान है। आईजीजी के लिए कार्यरत मानक तकनीक अक्सर एक आईजीएम के प्रतिजन की पहचान करने के लिए लागू नहीं कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल पुनर्योजी मानव आईजीएम एंटीबॉडी HIgM12 के लिए प्रतिजन के रूप में पीएसए NCAM की पहचान, पशु मॉडल में प्रभावी का वर्णनएमएस और ए एल एस 15-18 की। इस्तेमाल किया पद्धति मुख्यतः विशिष्ट Vκ प्रकाश चेन VκI, VκIII और VκIV और VκI प्रकाश चेन के साथ माउस एंटीबॉडी के साथ सभी मानव एंटीबॉडी के लिए लागू है, एंटीबॉडी के निर्धारण की परवाह किए बगैर है।
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी अनुप्रयोगों में आईजीएम एंटीबॉडी का इस्तेमाल होता है। अधिक विशेष रूप से, सफल एंटीबॉडी immunoprecipitations में पुल से नीचे एजेंट के रूप में कार्य करने के लिए अलग-थलग करने या जटिल ऊतक या सेल संस्कृति lysates के बाहर एक प्रतिजन संतुष्ट करने के लिए आवश्यक हैं। समृद्ध प्रतिजन अंशों निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी से immunoprecipitations तुलना में किया जा सकता है और बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मतभेद के लिए विश्लेषण किया। एक अनिवार्य आवश्यकता है या इस कदम की सीमा सही एंटीबॉडी Vκ प्रकाश श्रृंखला और मेजबान (मानव, माउस) की उपस्थिति प्रोटीन एल agarose के लिए बाध्य एंटीबॉडी के लिए सक्षम है। मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन agarose के लिए बाध्य का उपयोग (यह भी calleघ mannose बाध्यकारी लेक्टिन) प्रोटीन एल agarose की बजाय विशिष्ट Vκ प्रकाश चेन बिना IgMs immunoprecipitate के लिए एक संभावित विकल्प नहीं है। हालांकि, के रूप में द्वारा अर्नोल्ड एट अल। 35 में कहा गया है, प्रतिजन बाध्य आईजीएम एंटीबॉडी मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन के लिए बाध्य नहीं है, लक्ष्य glycan दुर्गम हो दिखाई देते हैं के रूप में एक बार आईजीएम अपने प्रतिजन के लिए बाध्य किया है। इन निष्कर्षों के आधार पर मन्नान बाध्यकारी प्रोटीन एक बाध्यकारी मैट्रिक्स प्रतिजन लोड आईजीएम अणुओं 35 immunoprecipitate के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। अन्य संभावित विकल्प के माध्यमिक agarose बाध्य विरोधी आईजीएम आईजीजी 46,47 या सतह सक्रिय चुंबकीय मोती 48 के उपयोग का उपयोग किया जा सकता है। IgMs के खिलाफ निर्देशित आईजीजी रासायनिक आदेश ब्याज की प्रतिजन के साथ एक साथ eluted एंटीबॉडी की हद तक कम करने में एक या agarose जी agarose को crosslinked हो सकता है। एक उचित सफलतापूर्वक पहचान एंटीजन के संबंध में आईजीएम immunoprecipitation के विभिन्न वेरिएंट के बीच तुलना मैंमुश्किल है, क्योंकि ज्यादातर immunoprecipitations को अलग-थलग या उनके एंटीजन में आगे ब्याज के बिना IgMs व्यय करना प्रदर्शन किया गया। इसके अलावा, IgMs का उपयोग कर immunoprecipitations मुख्य रूप से शुद्ध एंटीजन 49 एंटीबॉडी जोखिम के साथ एक पहले से ही जाना जाता है या उम्मीद एकल प्रतिजन पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Immunoprecipitated सीरम आईजीएम अणुओं की – (15% 10) जब प्रारंभिक सामग्री 50 की तुलना में मानव IgMs के खिलाफ निर्देशित agarose युग्मित IgGs का एक नुकसान यह एक बहुत कम उपज है। इसके विपरीत, सतह सक्रिय चुंबकीय मोती सफलतापूर्वक स्क्रैपी जुड़े तंतुओं 48 immunoprecipitate के लिए आईजीएम सहित विभिन्न isotypes के एंटीबॉडी के लिए लागू किया गया। इस विधि विशिष्ट कापा (Vκ) या लैम्ब्डा (λ) चेन या एक विशेष होस्ट करने के लिए सीमित नहीं है और काफी हद तक immunoprecipitations में इस्तेमाल आईजीएम एंटीबॉडी के स्पेक्ट्रम व्यापक हो सकता है।
प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी के एक Det के रूप में कार्य करने की क्षमता हैपश्चिमी blots या अन्य स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों में एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) ecting। सफल एंटीबॉडी प्रतिजन गैर ईओण या संभवतः ईओण डिटर्जेंट की मौजूदगी में बाध्यकारी अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च आत्मीयता के साथ उनकी प्रतिजन लक्ष्य होगा। उच्च संबंध एंटीबॉडी समानता-maturated आईजीजी के बीच आम है, लेकिन आईजीएम निर्धारण, जो वजहों से वहाँ अपेक्षाकृत जैव रासायनिक सेटिंग्स में एजेंट का पता लगाने के रूप में कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आईजीएम एंटीबॉडी हैं में से एक है के एंटीबॉडी के बीच कम आम हैं। उच्च संबंध एंटीबॉडी के बंधन आणविक एंटीजन की immunoprecipitations के लिए और पश्चिमी सोख्ता के लिए एक आवश्यकता है। डिटर्जेंट सांद्रता या आईपी buffers और सेल बफ़र्स में डिटर्जेंट का पूर्ण अभाव को कम प्रतिजन अपने फैब डोमेन के माध्यम से कम आत्मीयता एंटीबॉडी द्वारा लक्षित करने की अनुमति देता है। इसके विपरीत, एंटीबॉडी के अपने एफसी भाग के माध्यम से प्रोटीन एल agarose लक्षित करने की क्षमता काफी हद तक अलग डिटर्जेंट ध्यान केंद्रित की एक सीमा से अधिक निर्धारण नियंत्रण के बीच में प्रभावित नहीं हैtrations। हालांकि, lysis बफर और आईपी बफर में कम डिटर्जेंट एकाग्रता कोशिका झिल्ली विघटन और विशिष्ट अणुओं के अलगाव से बचाता है। इसी तरह, पश्चिमी धब्बा धोने बफ़र्स में एक कम डिटर्जेंट एकाग्रता (जैसे, पीबीएस-टी) कम आत्मीयता एंटीबॉडी के बंधन प्रतिजन की अनुमति देता है, लेकिन एक ही समय में गैर विशिष्ट बंधन को बढ़ाता है और इसलिए एक विकल्प नहीं है।
एक प्रतिजन प्रोटीन कोर की उपस्थिति इस विधि के लिए एक और आवश्यकता है। Posttranslational संशोधनों (जैसे, ग्लाइकोप्रोटीन, लिपो प्रोटीन) और असंशोधित प्रोटीन, लेकिन नहीं एकमात्र लिपिड या कार्बोहाइड्रेट के साथ प्रोटीन, पश्चिमी blots में पता लगता है। यह उपस्थिति या डिटर्जेंट के अभाव में ऊतक या सेल lysates से लिपिड (जैसे, sphingolipids) immunoprecipitate करने के लिए संभव नहीं है। डिटर्जेंट और लिपिड के भौतिक गुणों, बहुत ही चयनात्मक लिपिड एंटीबॉडी बातचीत अनुमति देने के लिए इसी तरह के हैं, जबकि एक ही समय में डिटर्जेंट बाधित करने के लिए आवश्यक हैंआदेश में झिल्ली विशिष्ट अणुओं के चुनिंदा अलगाव की अनुमति है। हमारी सबसे अच्छा ज्ञान, immunoprecipitations पूरी तरह कार्बोहाइड्रेट के शामिल, एक प्रोटीन कोर के अभाव में करने के लिए, पहले से सूचित नहीं किया गया है। क्योंकि आईजीएम एंटीबॉडी अक्सर कार्बोहाइड्रेट और glycolipids, जो जरूरी नहीं कि एक प्रोटीन इकाई से जुड़े नहीं हैं लक्ष्य यह विशेष रूप से प्रासंगिक हो जाता है। अन्य chromatographic तकनीक एक प्रोटीन कोर के अभाव में वसा और कार्बोहाइड्रेट की जुदाई और immunologic पहचान के लिए आवश्यक हैं। उदाहरण के लिए, टीएलसी प्लेट (इम्युनो-टीएलसी) पर बाद में एंटीबॉडी का पता लगाने के साथ सेलुलर लिपिड की पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 51,52 से लागू किया जा सकता है।
अन्य विरोधी पीएसए एंटीबॉडी पिछले अध्ययनों और परिणाम में वर्णित किया गया है की तुलना में HIgM12 के साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए आईजीएम के रूप में (क्लोन 2-2B)। सबसे अधिक इस्तेमाल किया पीएसए के क्षेत्र में एंटीबॉडी एक आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) माउस monoc रूप में उपलब्ध हैlonal या खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी 53। यह विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी microglial कोशिकाओं 41 सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं सीएनएस पर SynCAM और NCAM पर पीएसए का पता लगाता है। विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी के विपरीत, मानव आईजीएम एंटीबॉडी HIgM12, HIgM42 और विरोधी पीएसए माउस आईजीएम (क्लोन 2-2B) चूहों में विभिन्न भ्रूण और जल्दी प्रसव के बाद के चरणों में SynCAM पर पीएसए लक्षित करने में असमर्थ है (लेकिन NCAM पर) , आसानी से पहचाने जा जबकि गैर polysialylated SynCAM है 15। इस्तेमाल किया आईजीएम एंटीबॉडी भी microglial कोशिकाओं (आंकड़े 3 + 4) पर पीएसए का पता लगाने में सक्षम नहीं हैं। एंटीबॉडी isotypes के बीच मनाया मतभेद के लिए एक संभावित व्याख्या यह पीएसए NCAM के स्तर के संभावित कम आत्मीयता के विरोधी पीएसए आईजीजी की तुलना में आईजीएम एंटीबॉडी के बंधन के साथ संयुक्त की तुलना में कम पीएसए SynCAM स्तरों हो सकता है। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम SynCAM वर्तमान में बड़ी मात्रा भ्रूण चरण E17 पर NCAM KO पशुओं में immunoprecipitations प्रदर्शन किया और HIgM12 एक "पुल से नीचे एजेंट 'के रूप में इस्तेमाल किया <sup> 15। E17 गुम्मट littermate में HIgM12 हद तक कि IgMs भारी श्रृंखला के रूप में बाद पश्चिमी धब्बा eluted एंटीजन का उपयोग करने में डेन्टिसिटोमीटरी द्वारा पता लगाया की तुलना में पीएसए NCAM "नीचे खींच लिया" के समान तीव्रता से पता चला है immunoprecipitated नियंत्रण पीएसए NCAM। इस परिणाम के अपने लक्ष्य को पीएसए के लिए कम से कम HIgM12 की पर्याप्त समानता का सुझाव दिया। गुम्मट littermate के विपरीत नियंत्रित HIgM12 NCAM KO पशुओं में SynCAM से जुड़ी पीएसए पता नहीं लगा था। समान परिणाम मानव विरोधी पीएसए आईजीएम HIgM42 का उपयोग कर immunoprecipitations में प्राप्त किया गया। HIgM12 और HIgM42, साथ ही माउस विरोधी पीएसए आईजीएम (क्लोन 2-2B) भ्रूण और प्रसव के बाद विकास के चरणों में WT और NCAM KO जानवरों से पश्चिमी blots में SynCAM पर पीएसए लक्षित करने में असमर्थ थे। HIgM12 की कम राशि की आवश्यकता (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के लिए विशेष रूप से पश्चिमी blots सीएनएस ऊतक (0.1 माइक्रोग्राम प्रति अच्छी तरह से सीएनएस ऊतक) की थोड़ी मात्रा का उपयोग करने में NCAM से जुड़ी पीएसए पता लगाने के लिए 15 यह संभावना कम समानताएं अकेले हैं कि प्रतीत होता है को देखते हुएतीन अलग अलग तरीकों में HIgM12 द्वारा पीएसए SynCAM का पता लगाने की पूरी कमी के लिए जिम्मेदार है।
हम निष्कर्ष विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी और अक्सर प्रकाशित विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि क्यों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी अतीत में अधिक बार इस्तेमाल नहीं किया गया antiPSA आईजीजी एंटीबॉडी 735 के साथ प्राप्त परिणामों यह विशेष रूप से दिलचस्प है क्योंकि HIgM12 पहले से ही विभिन्न रोग मॉडल में क्षमता साबित कर दी पुष्टि करने के लिए है। अन्य विरोधी पीएसए आईजीएम एंटीबॉडी समान चिकित्सीय प्रभाव पड़ सकता है हालांकि यह स्पष्ट नहीं हुआ है विरोधी पीएसए आईजीजी एंटीबॉडी (क्लोन 735) एमएस और ए एल एस के मॉडल में एक समान चिकित्सीय परिणाम है या नहीं।
संक्षेप में, यहाँ वर्णित विधि पुनर्योजी मानव एंटीबॉडी HIgM12 के प्रतिजन एमएस के लिए संभावित क्लिनिकल परीक्षण और संभवतः अन्य neurodegenerative रोगों का समर्थन करने के लिए की पहचान करने के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया। चींटी की पहचानजैविक गतिविधि के साथ एंटीबॉडी के लिए igens कार्रवाई के अपने तंत्र को समझने के रूप में आवश्यक कदम है। यह कई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी वर्तमान में सुरक्षा और मानव परीक्षणों में प्रभावकारिता के लिए परीक्षण किया जा रहा है के संदर्भ में विशेष रूप से प्रासंगिक हो जाता है। तिथि करने के लिए चिकित्सकीय परीक्षण आईजीएम एंटीबॉडी की संख्या कम है, वहीं इस एंटीबॉडी वर्ग 1-10,37,40,42-45 की चिकित्सीय क्षमता पर प्रकाश डाला अध्ययन के एक बढ़ती हुई संख्या के साथ हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी एक साथ हाल के अग्रिमों में नए या के विकास का आग्रह संशोधित तरीकों गैर प्रोटीन आईजीएम एंटीजन की पहचान करने के लिए लागू है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम के स्वास्थ्य (R01 GM092993, R01 NS048357 और R21 NS073684) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (कैरियर पुरस्कार), जैव प्रौद्योगिकी के लिए मिनेसोटा भागीदारी पुरस्कार और मेडिकल जीनोमिक्स, राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी (CA1060A) और नैदानिक और translational विज्ञान के लिए मेयो क्लीनिक केंद्र (CCaTS)। लेखकों Applebaum, हिल्टन, पीटरसन और सैनफोर्ड मूलाधार, चंद्रमा और मर्लिन पार्क निदेशक कोष और McNeilus परिवार से समर्थन स्वीकार करते हैं।
DMEM | Fisher Scientific | MT-10-013-CVRF | HIGH GLUCOSE, with glutamine, with sodium pyruvate, 500 ml |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml, L-glutamine, sodium pyruvate, high glucose |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/mL, 100 ml |
N-2 Supplement (100X) | Life Technologies | 17502-048 | 5 ml |
B-27 Supplement (50X) | Life Technologies | 17504-044 | serum free, 10 ml |
Fetal Bovine Serum – Optima | Atlanta Biologicals | S12450 | 500 ml |
STERILE WATER FOR IRRIGATION | Baxter Healthcare | #2F7114 | USP-1000 ml, 12/CA |
Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7886-50MG | D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Molecular Weight 30,000-70,000 g/mol, 50 mg |
bovine serum albumin fraction V | Sigma | A-3294-100G | heat shock fraction, protease free, pH 7, purity 98%, 100 g |
D-(+)-Glucose | Sigma | G5767-500G | C6H12O6, Molecular Weight: 180.16 g/mol, ACS reagent, 500 g |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma | T9935-100mg | essentially salt-free, lyophilized powder, =9,000 BAEE units/mg protein, |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025-150KU | Type IV, lyophilized powder, =2,000 Kunitz units/mg protein |
Recombinant Rat FGF basic Protein | R&D systems | 3339-FB-025 | BSA as a carrier protein, 25 ug, lyophilized, >95%, 16.2 kDa |
Recombinant Rat PDGF-AA Protein | R&D systems | 1055-AA-50 | carrier free, 50 ug, lypphilized, >97%, E.coli-derived, 12.5 kDa |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | 500 ml, No Glutamine, No Aspartic Acid, No Glutamic Acid |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-1KG | crystalline, 1 kg, reagent grade, Molecular Weight 30.03 g/mol (as monomer) |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane (Tris bas | Biorad | #1610719 | 1 kg, 99.8% pure, powder |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Biorad | #1610302 | 1 kg, powder |
Glycine | Fisher Scientific | BP-381-5 | C2H5NO2, Molecular weight: 75.07 g/mol, White crystalline Powder, 5 kg |
Sodium chloride | Sigma | S7653-5KG | NaCl, Molecular Weight: 58.44 g/mol, 5 kg |
Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751-500G | NaH2PO4, Molecular Weight: 119.98 g/mol, 500 g |
Phosphate-buffered Solution 1X (PBS) | Cellgro | MT-21-040-CV | Without Calcium and Magnesium, 6 x 500 ml |
Falcon 60mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning Life Sciences | #353002 | 60 mm Cell Culture Dish, TC-treated polystyrene, 20/pack, sterile |
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish | Corning Life Sciences | #351007 | Not TC-Treated Bacteriological Petri Dish, 20/Pack |
6 well cell culture plates | Corning Costar | CLS3516 | 6 well, flat bottom (Individually wrapped), gamma-irradiated, growth area 9.5 c |
75cm² tissue culture flask | Corning Life Sciences | 430720U | 75cm² U-Shaped Canted Neck Cell Culture Flask with Plug Seal Cap |
Pierce™ Protein L Plus Agarose | ThermoFisher Scientific | #20520 | 2 ml, crosslinked 6% beaded agarose (CL-6B), binding capacity: 10 to 20 mg IgG |
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Biorad | 456-1094 | 10-well, 50 µl, for use with Mini-PROTEAN electrophoresis cells |
Immobilon-P Membrane | Millipore | IPVH00010 | PVDF, 0.45 µm, 26.5 cm x 3.75 m roll |
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone | Millipore | MAB5324 | 50 microliters, Host: mouse, monoclonal IgM |
XT sample buffer (Western blot) | Biorad | #1610791 | 10 ml, 4 x premixed protein sample buffer |
2-mercaptoethanol | Biorad | #1610710 | 25 ml, 98 % pure, 14.2 M |
Endoneuraminidase-N (Endo-N) | ABC Scientific | ABC0020 | 50 microliters, 200 µg/ml, 3500 U/mg |
25 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | Circles No. 1; Thickness: 0.13 to 0.17mm; Size: 25mm |
HEPES buffer solution | ThermoFisher Scientific | 15630-080 | 100 ml, 1M |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X (HBSS) | Cellgro | MT-21-022-CV | 500 ml, without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
Papain | Worthington Biochemical Cooperation | LS003119 | lyophilized powder, 100 mg |
Magnesiumsulfate | Sigma | M-2643-500G | powder, 500 g |
L-Glutamine | Gibco | #25030-081 | 100 ml, 200 mM |